Articolo metodologico

Ingegneria del tessuto di trapianto-adatto del pigmento retinico epitelio derivato da cellule staminali embrionali umane

DOI:

10.3791/58216

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6 settembre 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1U861, I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), 2U861, I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Université Evry Val-d'Essonne (UEVE), 3I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Centre pour L’Etude des Cellules Souches (CECS), 4Banque de tissus humain, Hôpital Saint Louis, Assistance Publique - Hôpitaux de Paris (AP-HP), 5Sorbonne Université, INSERM, CNRS, Institut de la Vision, F-75012

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descriviamo un metodo per progettare un tessuto retinico composto di cellule epiteliali del pigmento retinico derivate da cellule staminali pluripotenti umane coltivate in cima membrane amniotiche umane e la sua preparazione per l'innesto in modelli animali.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diverse condizioni patologiche dell'occhio influenzano la funzionalità e/o la sopravvivenza dell'epitelio retinico del pigmento (RPE). Questi includono alcune forme di retinite pigmentosa (RP) e degenerazione maculare senile (AMD). Terapia cellulare è una delle più promettenti strategie terapeutiche proposte per curare queste malattie, con già incoraggianti risultati preliminari in esseri umani. Tuttavia, il metodo di preparazione dell'innesto ha un impatto significativo su suoi esiti funzionali in vivo. Infatti, le cellule RPE innestate come una sospensione cellulare sono meno funzionale le stesse cellule trapiantate come un tessuto retinico. Qui, descriviamo un metodo semplice e riproducibile per ingegnere RPE tessuto e la sua preparazione per un impianto in vivo . Cellule RPE derivate da cellule staminali pluripotenti umane sono seminate su un supporto biologico, la membrana amniotica umana (prosciutto). Rispetto ai ponteggi artificiale, questo supporto ha il vantaggio di avere una membrana dello scantinato che è vicino alla membrana di Bruch cui cellule RPE endogene sono fissate. Tuttavia, la sua manipolazione non è facile, e abbiamo sviluppato diverse strategie per la sua corretta coltivazione e preparazione per l'innesto in vivo.

Introduzione

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RPE è cruciale per la sopravvivenza e l'omeostasi dei fotorecettori con cui è strettamente associato1. Diverse condizioni patologiche alterano la funzionalità e/o sopravvivenza, comprese la RP e AMD.

RP è un gruppo di mutazioni monogeniche ereditarie che colpiscono le funzioni di fotorecettori, cellule RPE o entrambi di2,3. Si stima che le mutazioni che interessano specificamente RPE cellule rappresentano il 5% di RP2. AMD è un'altra condizione dove lo strato RPE è alterato, leader perdita di visione in definitiva a centrale. AMD è causato da complesse interazioni di fattori genetici e ambientali e colpisce gli anziani4,5,6. Secondo le proiezioni, AMD sarà una preoccupazione per 196 milioni di pazienti nel mondo da 20207. Per questi disturbi, non esiste alcuna cura efficace, e una delle strategie proposte è il trapianto di nuove cellule RPE per compensare i morti/non funzionale preesistente di cellule RPE8.

La modalità di formulazione del prodotto finale per essere innestato è essenziale per garantire i migliori risultati funzionali. Le cellule RPE iniettate come una sospensione cellulare, pur essendo un metodo di consegna, facile e semplice sollevano preoccupazioni per quanto riguarda la loro sopravvivenza, integrazione e funzionalità9,10,11,12 , 13. gli scienziati ora stanno sviluppando più complesse formulazioni di consegnare ingegnerizzato tessuto retinico9,13,14,15,16. In questo contesto, abbiamo sviluppato un metodo originale per generare in vitro tessuto RPE che poteva essere utilizzato per il trapianto9.

Banche di cellule RPE derivate da cellule staminali embrionali umane (ES) sono utilizzate nel presente protocollo. Comunque, alternativa RPE cellula banche da fonti differenti delle cellule (cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo, cellule RPE primarie, ecc.) e differenziato con un metodo diverso sono adatti anche per questo protocollo. Esso comprende differenziazione diretto protocolli mediante citochine e/o piccole molecole17,18,19,20,21,22.

Per essere trapiantati, il tessuto ingegnerizzato dovrebbe essere preparato su un ponteggio. Negli ultimi anni, diversi ponteggi sono stati sviluppati basandosi su un polimero o su una matrice di origine biologica13,23,24. Qui, il substrato biologico utilizzato è il prosciutto, ma altri substrati, come membrane Bruch denudate, potrebbero essere attuate. Il metodo qui descritto ha il vantaggio di usando un'impalcatura biologica che è più rilevante per l'ambiente nativo di RPE.

Cellule RPE di derivati da cellule ES umane sono coltivate per almeno 4 settimane al fine di essere completamente organizzato come un monostrato di ciottoli. In tale fase, l'epitelio ottenuta è funzionale e polarizzato9. Infine, come questo tessuto rughe facilmente, è incorporato in uno strato sottile di un vettore di idrogel per dargli più rigidità ed elasticità e per proteggerlo durante la procedura di iniezione. Questo prodotto è quindi conservato a 4 ° C fino ad innesto.

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Protocollo

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Tutto il materiale umano utilizzato in questo protocollo sono stato utilizzato in conformità con i regolamenti dell'Unione europea. La linea cellulare umana di ES utilizzata in questo studio è stata derivata da un unico embrione. La coppia che aveva donato l'embrione è stato pienamente informata e hanno dato il loro consenso per una donazione anonima. Una linea cellulare di uso clinico umana ES è stata derivata da questo embrione, incassata, qualificata e adeguatamente documentata da Roslin cellule (UK). Prosciutti sono ottenuti in condizioni di sterilità durante un taglio cesareo in madri che hanno firmato un consenso informato per la donazione di placenta secondo le linee guida di ospedale (APHP, Hôpital Saint Louis).

1. preparazione di terreni di coltura e reagenti

  1. Preparazione del terreno di coltura delle cellule RPE
    1. Per preparare il terreno di coltura delle cellule RPE, aggiungere 4% siero sostituto (20 mL per un volume finale di 500 mL), 1.000 x diluito 2-mercaptoetanolo (500 µ l per un volume finale di 500 mL) e soluzione di 1% Eagle′s mezzo minimo essenziale (MEM) gli aminoacidi non essenziali (5 mL per un finale volume di 500 mL) di (DMEM) medio alto glucosio dell'Aquila di Dulbecco modificato (475 mL per un volume finale di 500 mL).
  2. Preparazione del mezzo di trasporto/conservazione
    1. Per preparare il mezzo di trasporto/conservazione, aggiungere 1% di penicillina-streptomicina (5 mL per un volume finale di 500 mL) di CO2-mezzo indipendente (495 mL per un volume finale di 500 mL) e tenerlo a 4 ° C.
  3. Risospensione dell'enzima termolisina
    1. Preparazione di una soluzione madre di termolisina
      1. Per preparare una soluzione stock di termolisina, scongelare la polvere di termolisina, che è stata conservata a-20 ° C, a temperatura ambiente.
      2. Come l'attività enzimatica può essere variabile da lotto a lotto, calcolare questa attività basata sul certificato di analisi fornito con la polvere di termolisina del batch da utilizzare. Dividere le "attività della proteasi neutra calcolato = ANPC" (indicato nel certificato di analisi) di 181 (che è il peso molecolare di tirosina). Il risultato ottenuto corrisponde all'attività enzimatica totale della dotazione termolisina polvere (U/fiala).
      3. Preparare una soluzione di riserva a 200 U/mL aggiungendo il volume d'acqua corrisponde all'attività enzimatica totale (U/fiala) diviso per 200 (U/mL).
      4. Sciogliere l'enzima pipettando l'acqua che è stato aggiunto su e giù. Vortice la soluzione per 30 s e verificare se la polvere completamente è stato sospeso. Pipettaggio più può essere richiesto per una completa dissoluzione.
      5. Aliquota della soluzione di riserva e conservare a-20 ° C.
    2. Preparazione di una soluzione di lavoro di termolisina
      Nota: La soluzione di termolisina deve essere preparata il giorno del trattamento prosciutto.
      1. Scongelare le aliquote stock di termolisina a 200 U/mL conservati a-20 ° C. Diluire la soluzione madre di 200x in tampone fosfato salino (PBS) al fine di ottenere un'attività enzimatica finale di 1 U/mL. Preparare 40 mL per trattare le patch di prosciutto 1 – 4.
      2. Filtrare la soluzione di termolisina attraverso un prima del filtro di 0,2 µm di utilizzare.
  4. Risospensione di gelatina
    1. Preparazione della soluzione di gelatina di 20% e blocco
      Nota: Il 20% di soluzione di gelatina e il blocco può essere preparati fino a 1 settimana prima dell'uso.
      1. Scaldare la CO2-mezzo indipendente a 42 ° C a bagnomaria per 30 min (fino a 1 h). In una provetta da 50 mL, aggiungere 10 g di gelatina a 40 mL di riscaldato CO2-mezzo indipendente e vortice la soluzione.
      2. Sciogliere la gelatina per 30 – 60 min a 42 ° C. Vortice ogni 10 min per omogeneizzare la soluzione.
      3. Una volta che la soluzione è omogenea, aggiungere 4 mL di soluzione 20% gelatina a quattro piastre di coltura di 6 cm. Evitare le bolle. Aggiungere una pellicola di plastica paraffina per proteggere i piatti e lasciare che la soluzione a solidificare a 4 ° C.
    2. Preparazione della soluzione di gelatina di 8%
      Nota: La soluzione di gelatina 8% può essere preparata il giorno prima dell'uso e conservata a 4 ° C.
      1. Scaldare la CO2-mezzo indipendente a 42 ° C per 30 min (fino a 1 h). In una provetta da 50 mL, aggiungere 4 g di gelatina di 46 mL di riscaldato CO2-mezzo indipendente e vortice la soluzione.
      2. Sciogliere la gelatina per 30 – 60 min a 42 ° C. Aggiungere un film di plastica paraffina per proteggere il tubo e tenerlo a bagno d'acqua a 37 ° C se deve essere utilizzato lo stesso giorno, o conservarlo a 4 ° C se deve essere usato più tardi.

2. termolisina trattamento delle membrane amniotiche umane

  1. Lavare la membrana amniotica umana
    1. Sono prosciutti forniti come piccoli pezzi (circa 30 mm x 30 mm) fissati in un'impalcatura di nylon, sia già a 4 ° C in PBS o congelati. Se forniti congelati, scongelare le membrane a 37 ° C in un incubatore per 30 min.
    2. Lavare le membrane:
      1. Posto 1 – 4 membrane in un flacone da 250 mL contenente 80 mL di PBS. Utilizzare come molte bottiglie come richiesto.
      2. Agitare ogni bottiglia in un agitatore per piastre ad alta velocità per 5 min, poi scarta il PBS. Aggiungere 80 mL di PBS e ripetere.
  2. Trattamento di termolisina
    1. Aggiungere 40 mL di soluzione di lavoro di termolisina (1 U/mL) al flacone contenente le membrane (1 – 4 membrane per bottiglie; fino a 3 bottiglie alla volta).
    2. Agitare le bottiglie per 5 min a 450 giri/min e poi vortice li per 30 s. Ripetere 1 x.
    3. Scartare la soluzione di termolisina e aggiungere 80 mL di PBS.
    4. Agitare le bottiglie per 5 min a 450 giri/min. Scartare il PBS e aggiungere 80 mL di PBS. Ripetere 3 volte.

3. fissazione delle membrane amniotiche umane su un inserto di cultura

  1. Utilizzare pinze lunghe sterili (che possono raggiungere il fondo della bottiglia) per rimuovere i prosciutti uno per uno e trasferire ogni prosciutto a una piastra di coltura di 10cm contenente 10 mL di PBS.
  2. In una nuova piastra di coltura 10cm contenente 10 mL di PBS, posizionare una delle membrane con il nylon rivolto verso il basso. Scollegare due dei quattro ganci che sono utilizzati per fissare la membrana di nylon.
  3. Inserire l'anello più piccolo dell'inserto cultura tra il nylon e la membrana.
  4. Assicurarsi che la membrana copre l'anello più piccolo completamente. La seconda parte dell'inserto cultura sopra la membrana di clip. La membrana dello scantinato del prosciutto è rivolto verso l'alto all'interno dell'inserto di cultura. Staccare le ultime due clip.
  5. Taglio, con forbici sterili, l'eccesso di membrana fuori l'inserto di cultura se necessario. Usando il forcipe, trasferire la membrana fissa nell'inserto cultura ad una piastra 12-pozzetti, aggiungere PBS e memorizzare la piastra in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2.
  6. Ripetere queste operazioni (dal punto 3.2-3.5) con le altre membrane.

4. lo scongelamento e la semina delle cellule dell'epitelio retinico del pigmento sulle membrane amniotiche umane

  1. Lo scongelamento delle cellule dell'epitelio retinico del pigmento
    1. La banca di cellule RPE è congelata a 1 milione cellule per flaconcino criogenico in azoto liquido. Scongelare i flaconcini criogenici come molti come richiesto (350.000 celle sono seminate a membrana).
    2. Preparare una provetta da 15 mL contenente 3 mL di terreno RPE per flaconcino criogenico. Una volta che il flaconcino è scongelato, trasferire le cellule in ogni provetta. Ripetere questa operazione per le altre fiale.
    3. Omogeneizzare (pipetta su e giù un paio di volte per risospendere le cellule in medium RPE) e prendere 10 µ l della soluzione cella e trasferirlo in una provetta da 1,5 mL. Aggiungere 10 µ l di blu di trypan. Place 15 µ l di questa soluzione in una camera di conteggio, poi contare il numero di cellule vitali (non colorato in blu) sotto un microscopio con un obiettivo 4x. Ripetere questa operazione per le altre fiale.
    4. Nel frattempo, centrifugare le provette da 15 mL a 110 x g per 5 min, scartare il supernatante e risospendere le cellule a 700.000 cellule/mL.
  2. Semina delle cellule dell'epitelio retinico del pigmento in membrane amniotiche umane
    1. Rimuovere la piastra 12-pozzetti contenenti le membrane dall'incubatrice.
    2. Aspirare il PBS. Aggiungere 500 µ l di sospensione cellulare preparata al punto 4.1.4 al centro dell'inserto cultura. Aggiungere 1 mL di mezzo RPE fuori l'inserto di cultura (all'interno del pozzo). Ripetere per le altre membrane.
    3. Posizionare la piastra 12-pozzetti contenenti le membrane nell'incubatrice.

5. il mantenimento di colture di cellule di epitelio retinico del pigmento sulle membrane amniotiche umane

  1. Rinnovare il mezzo 2 x alla settimana, solitamente il lunedì e il venerdì, almeno fino al giorno 30 della cultura.
  2. Aspirare il mezzo dentro e fuori l'inserto di cultura per ogni pozzetto e rinnovarlo con medium fresco (1 mL di fuori dell'inserto di cultura e 500 µ l all'interno). Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 ° C e 5% CO2.

6. preparazione della Patch di epitelio retinico del pigmento per trapianto

Nota: A partire da giorno 30 della cultura, il tessuto è pronto per il trapianto.

  1. Caldo la soluzione 8% gelatina in un bagno di acqua a 37 ° C per 30 min. riempire la camera interna del vibratome con freddo CO2-mezzo indipendente (a 4 ° C).
  2. Inserire il blocco di 20% gelatina del vibratome.
    1. Prendere il piatto di cultura di 6 cm contenente il blocco di gelatina di 20% dal frigo. Usando un bisturi, tagliare un blocco di 5 cm x 5 cm. Incollare il lato superiore del blocco al supporto con colla del cianoacrilato o suo equivalente.
    2. Inserire una nuova lama in del vibratome.
    3. Regolare il livello del blocco finché è allo stesso livello della lama di rasoio.
    4. Riempire il bagno intorno al supporto con fresco CO2-mezzo indipendente a 4 ° C. Tagliare il blocco con il vibratome usando una velocità media fino a quando il blocco viene tagliato in modo uniforme, portando ad una superficie liscia. Impostare la posizione 0.
    5. Aspirare il terreno intorno al blocco di gelatina fino a quando è completamente asciutto e poi prendere la piastra di coltura 12-pozzetti contenenti i tessuti da incubatore a 37 ° C.
    6. Usando il forcipe, aprire con cautela l'inserto di cultura sulla parte superiore del blocco di gelatina. Taglio, con le forbici, tutte le parti delle membrane che non contengono celle (fuori dal ring dove le cellule non sono state coltivate). Aspirare l'intero medio residuo.
    7. Aggiungere 1 mL di soluzione 8% gelatina liquida a 37 ° C al fine di coprire le membrane. Rimuovere delicatamente l'eccesso. Aspettare 5-8 minuti per consentire la gelatina a solidificare.
    8. Aggiungere fresco CO2-mezzo indipendente (a 4 ° C) per il bagno fino a quando la membrana è coperto.
    9. Taglio, con il vibratome in una posizione di-100 µm, con una velocità media, rimanendo consapevoli di come si comporta il blocco. Alla fine della sezione, fare attenzione a mantenere l'orientamento del tessuto.
    10. Con un bisturi, tagliare un angolo per identificare l'orientamento della sezione.
    11. Raccogliere la membrana incorporata in gelatina con una spatola e posizionarlo in una piastra a 6 pozzetti riempita con il mezzo di conservazione a 4 ° C, fino a quando l'innesto nell'occhio destinatario.
    12. Al momento del trapianto, regolare le dimensioni dell'impianto per la dimensione dell'occhio destinatario sotto un microscopio chirurgico (1 – 3 per i ratti, 10 – 15 mm2 per primati non umani).

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Risultati

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Prosciutti contengono uno strato epiteliale che deve essere rimossi prima della semina delle cellule RPE. Un trattamento enzimatico della membrana viene eseguito con la termolisina sotto agitazione. In ordine di non perdere la polarità della membrana (l'epitelio è su un lato), è fissato su un supporto quale composizione potrebbe essere diversa a seconda del provider (Figura 1A). L'adesione della membrana al suo sostegno in questa fase di verifica e se necessa...

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Discussione

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Abbiamo descritto un metodo per la coltura di cellule RPE su un'impalcatura biologica e la sua preparazione per l'impianto in modelli animali. Una delle fasi critiche del protocollo è il mantenimento dell'orientamento del prosciutto lungo tutta la procedura fino alla sua inclusione in gelatina. Infatti, viene rimosso l'epitelio nativo della membrana e relativa membrana dello scantinato diventa esposto9. Le cellule RPE devono essere seminati in cima a questa membrana dello scantinato. Al momento di...

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Dichiarazioni

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Olivier Goureau è l'inventore su in attesa di brevetti relazionati alla generazione di cellule retiniche da cellule staminali pluripotenti umane. Gli altri autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori vorrei ringraziare Jérôme Larghero e Valérie Vanneaux (Hôpital Saint Louis, Parigi, Francia) per il loro contributo durante la messa a punto del metodo descritto qui.

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da ANR [GPiPS: RFCS005-2010-ANR; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], la Fondation pour la Recherche Médicale [programma di Bio-ingegneria - DBS20140930777] e da LABEX REVIVE [ANR-10-LABX-73] Olivier Goureau e Christelle Monville. È stato sostenuto dal NeurATRIS, un'infrastruttura di ricerca traslazionale (Investissements d'Avenir) per bioterapie in neuroscienze [ANR-11-INBS-0011] e INGESTEM, l'infrastruttura nazionale (Investissements d'Avenir) Ingegneria per pluripotenti e cellule staminali differenziate [ANR-11-INBS-000] di Christelle Monville. Karim Ben M'Barek è stato sostenuto da borse di studio dal DIM Stempole e LABEX REVIVE [ANR-10-LABX-73]. Staminali sono parte dell'Istituto per le Malattie Rare supportato dall'Association Française contre les Myopathies (AFM) bioterapie-Téléthon.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cabina di biosicurezza sterileTechGen InternationalNon applicabile
Sistema di smaltimento dei rifiuti liquidi per aspirazioneVacuubrandBVC 21
CO2-controllato +37  ° incubatore di cellule CThermo Electron CorporationBVC 21 NT
200  µ Pipetta L: P200GilsonF144565
1  Pipetta mL: P1000GilsonF144566
Pipet aidDrummond75001
+4  ° C frigoriferoLiebherrNon applicabile
VibratomoLeicaVT1000S
Forbici finiWPI501758
Pinza (x2)WPI555227F
BagnomariaGrant subaqua proSUB6
Bilancia di precisioneSartoriusCP225D
CentrifugaEppendorff5804
MicroscopioOlympusSC30
Agitatore a dondolo orizzontaleIKA-WERKEIKA MTS 214D
VortexVWRLAB DANCER S40
Bisturi monousoWPI500351
film di paraffina plasticaVWRPM992
0.200 &; m filtro per siringa monousoSARTORIUS16532
Siringa senza ago 50 mLDutscher50012
Flaconi 250 mLDutscher28024
15 mL provette Falcon steriliDutscher352097
50 mL provette Falcon steriliDutscher352098
inserto per colturaScaffdexC00001N
60  mm di coltura cellulare: B6Dutscher353004
Piastra per coltura cellulare a 12 pozzettiCorning3512
Piastre di coltura a 6 pozzettiCorning3506
Lamette da barbaTed Pella, Inc121-9
Colla cianoacrilicaCastorama3178040670105
PBS 1x (500  mL)SigmaD8537
TermolisinaRoche5339880001
DMEM, glucosio alto, GlutaMAXInvitrogen61965-026
KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS)Invitrogen12618-013
MEM-NEAA (100x)Invitrogen11140-035
b-mercaptoetanolo (50  mM)Invitrogen31350-010
Penicillina/StreptomicinaInvitrogen15140122
Mezzo CO2-indipendenteGIBCO18045-054
GelatinaMERCK104078
membrana amniotica umanaBanca dei tessuti Ospedale St Louis (Parigi, Francia)Non applicabile

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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