Misurazione della concentrazione di ioni nello strato limite Unstirred con pipetta aperta Patch-Clamp: implicazioni nel controllo dei canali ionici dal liquido di flusso

Sommario

Canali ionici mechanosensitive sono spesso studiati in termini di flusso fluido/taglio forza sensibilità con registrazione di patch-clamp. Tuttavia, a seconda del protocollo sperimentale, l'esito il fluidi flusso-regolamenti dei canali ionici possa essere errata. Qui, forniamo metodi per prevenire e correggere tali errori con una base teorica.

Abstract

Flusso del fluido è un importante stimolo ambientale che controlla molti processi fisiologici e patologici, quali vasodilatazione indotta da flusso fluido. Sebbene i meccanismi molecolari per le risposte biologiche a forza di flusso fluido/taglio completamente non sono capiti, fluido regolazione mediata da flusso di ioni canale gating può contribuire criticamente. Di conseguenza, sensibilità di forza di flusso fluido/taglio dei canali ionici è stato studiato utilizzando la tecnica del patch-clamp. Tuttavia, a seconda del protocollo sperimentale, i risultati e l'interpretazione dei dati può essere errate. Qui, presentiamo la prova sperimentale e teorica per errori relativi al flusso di fluido e fornisce metodi per la stima, la prevenzione e la correzione di questi errori. Cambiamenti nella giunzione potenziale tra l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl e fluido di balneazione sono stati misurati con una pipetta aperta riempita con 3M KCl. flusso del fluido potrebbe quindi spostano la giunzione liquido/metallo potenziali per circa 7 mV. Al contrario, misurando lo spostamento di tensione indotto dal flusso del fluido, abbiamo stimato la concentrazione di ioni nello strato limite unstirred. In condizioni statiche, le concentrazioni di ione reale adiacente all'ingresso di canale Ag/AgCl riferimento elettrodo o ione alla superficie della membrana cellulare possono raggiungere come basso come approssimativamente il 30% di quello nella condizione di flusso. Ponendo un'agarosi 3M ponte di KCl tra l'elettrodo di riferimento e del liquido di balneazione può impedire questo problema di spostamento potenziale di giunzione. Tuttavia, l'effetto di unstirred strato adiacente alla superficie della membrana cellulare non poteva essere risolto in questo modo. Qui, forniamo un metodo per misurare le concentrazioni di ione reale nello strato limite unstirred con una pipetta aperta patch-clamp, sottolineando l'importanza dell'utilizzo di un sale di agarosio-ponte mentre studiava fluido regolamento indotta da flusso di correnti di ioni. Pertanto, questo nuovo approccio, che prende in considerazione le reali concentrazioni di ioni nello strato limite unstirred, può fornire la comprensione utile il disegno sperimentale ed interpretazione di dati legate alla sollecitazione di taglio fluido regolazione dei canali ionici .

Introduzione

Flusso del fluido è un importante segnale ambientale che controlla molti processi fisiologici e patologici come la vasodilatazione indotta da flusso fluida e fluido shear forza-dipendente vascolare rimodellamento e sviluppo^{1,2, 3,4,5}. Sebbene i meccanismi molecolari per le risposte biologiche a forza di taglio di flusso del fluido completamente non sono capiti, si ritiene che fluido regolazione mediata da flusso di ioni canale gating criticamente può contribuire alle risposte indotta da flusso fluido

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali della Konkuk University.

1. agarosio sale ponti tra la soluzione del bagno e l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl

Nota: Agarosio 3M KCl sale ponti sono prodotte come precedentemente descritto¹² con variazioni minori.

1. Formazione di ponti
   1. Piegare i tubi capillari di vetro fuoco per formare una forma a U come appropriato. Il diametro interno dei capillari dovrebbe essere abbastanza grande per ridurre la resistenza in serie durante la registrazione correnti di grandi ioni. Tubi con un diame....

Risultati

A cellula intera tensione-dipendente tipo L Ca^{2 +} canale (VDCC_L) correnti sono state registrate in miociti arteriosa mesenterica enzimaticamente dispersi ratto, come descritto in precedenza¹¹. I miociti arteriosi sono stati dializzati con una soluzione di pipetta Cs-ricco sotto la configurazione nistatina-perforato con soluzione di balneazione privo di cationi bivalenti per facilitare il flusso di corrente attraverso VDCC_L

Discussione

In questo studio, abbiamo dimostrato un metodo per misurare la concentrazione reale di Cl^– nello strato unstirred adiacente l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl determinando la giunzione metallo liquido potenziale con una pipetta di patch-clamp aperto riempita con un alta KCl concentrazione. Il cambiamento nella concentrazione di Cl^– nello strato limite può causare uno spostamento del potenziale di giunzione quando si passa da statico a condizioni di flusso fluido. Semplicemente utilizzando un'agarosi.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Camera a bagno aperto RC-11	Warner instruments, USA	W4 64-0307
Ag/AgCl elettrodo in pellet	World Precision Instruments, USA	EP1
Agarose	Sigma-aldrich, USA	A9793
Amplificatore a morsetto	di tensione HEKA, Germania	EPC8
Amplificatore a morsetto di tensione	Molecular Devices, Stati Uniti	Axopatch 200B
Pompa per liquidi	KNF Flodos, Svizzera	FEM08