Articolo metodologico

Generazione di cellule Knock-out NK umano primario ed espansa utilizzando Cas9 ribonucleoproteine

DOI:

10.3791/58237

⸱

14 giugno 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Childhood Cancer and Blood Disease, Nationwide Children's Hospital, 2Nuffield Division of Clinical Laboratory Sciences, Radcliffe Department of Medicine, University of Oxford, 3Center for Clinical and Translational Research, Nationwide Children's Hospital Research Institute

In questo articolo

Sommario

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Qui, presentiamo un protocollo per modificare geneticamente le cellule primarie o espanso umana naturale dell'assassino (NK) utilizzando Cas9 ribonucleoproteine (Cas9/RNP). Utilizzando questo protocollo, abbiamo generato le cellule NK umane carenti per trasformare il recettore del fattore di crescita – b 2 (TGFBR2) e ipoxantina fosforibosiltransferasi 1 (HPRT1).

Abstract

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CRISPR/Cas9 tecnologia sta accelerando ingegneria genoma in molti tipi cellulari, ma finora, consegna del gene e modificazione genetica stabile sono stati impegnativi in cellule primarie di NK. Ad esempio, consegna di transgene mediante trasduzione lentivirale o retrovirali ha provocato una resa limitata delle cellule NK geneticamente a causa della sostanziale procedura-collegata di apoptosi di cellule NK. Descriviamo qui un metodo privo di DNA per l'editing genomico umane primarie e ampliate delle cellule di NK utilizzando complessi di ribonucleoproteina Cas9 (Cas9/RNP). Questo metodo ha permesso efficiente knockout del TGFBR2 e HPRT1 geni in cellule di NK. Dati di RT-PCR ha mostrato una diminuzione significativa nel livello di espressione genica, e un'analisi di citotossicità di un prodotto rappresentativo delle cellule ha suggerito che le cellule NK RNP-modificato è diventato meno sensibile di TGFβ. Cellule geneticamente modificate potrebbero essere espansa post-elettroporazione dalla stimolazione con irradiato mbIL21-esprimendo le cellule di alimentatore.

Introduzione

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Immunoterapia del cancro è stato avanzato negli ultimi anni. Le cellule di T del recettore (auto) antigene chimerica geneticamente modificati sono un ottimo esempio di cellule immuni ingegnerizzate distribuito correttamente nell'immunoterapia del cancro. Queste cellule sono stati recentemente approvate dalla FDA per il trattamento contro CD19 + B delle cellule maligne, ma successo finora è stata limitata a malattie cuscinetto alcuni antigeni indirizzabile e targeting tale limitato repertorio antigenico è incline al fallimento di fuga immune. Inoltre, le cellule di T di auto sono state concentrate sull'uso di cellule T autologhe a causa del rischio di malattia dell'innesto - contro - ospite causata da cellule T allogeniche. Al contrario, le cellule NK sono in grado di uccidere il tumore obiettivi in maniera antigene-indipendente e non causano GvHD, che li rende un buon candidato per l'immunoterapia del cancro6,7,8,9.

CRISPR/Cas9 tecnologia è stata usata recentemente in ingegneria cellule immuni, ma geneticamente riprogrammazione delle cellule NK con plasmidi è sempre stato impegnativo. Questo è stato a causa di difficoltà nella consegna del transgene in un modo dipendente dalla DNA come trasduzione retrovirali e lentivirali causando sostanziale procedura-collegata di apoptosi di cellule NK e la produzione limitata di geneticamente le cellule NK4 , 9.

Molte cellule immuni innate esprimono alti livelli di recettori per pattern molecolari associati come Retinoic acid inducible gene ho (RIG-io), che consentono maggiore riconoscimento di DNA estraneo. Soppressione di queste vie ha permesso una maggiore efficienza di trasduzione in cellule di NK quando si utilizzano metodi basati sul DNA per modificazione genetica10.

Qui descriviamo il metodo per l'utilizzo di un editing genomico privo di DNA di cellule NK primarie ed espanse utilizzando complessi di ribonucleoproteina Cas9 (Cas9/RNP). Cas9/RNP è composto da tre componenti, ricombinante Cas9 proteina complessata con RNA di singolo-guida sintetico composto da complessato crRNA, tracerRNA. Questi Cas9/RNP sono capaci di scissione target genomici con maggiore efficienza rispetto agli approcci di DNA-dipendente stranieri a causa della loro consegna come funzionali complessi. Inoltre, uno sdoganamento rapido di Cas9/RNP dalle cellule può ridurre gli effetti di fuori bersaglio come induzione di apoptosi. Così, essi può essere utilizzati per generare il knock-out o knock-in quando combinato con il DNA per ricombinazione omologa6,7. Abbiamo mostrato che l'elettroporazione di Cas9/RNP è un metodo facile e relativamente efficiente che consente di superare i vincoli precedenti di modificazione genetica in cellule di NK.

TGFβ è una citochina immunosoppressiva principale, che inibisce l'attivazione e le funzioni delle cellule NK. È stato suggerito che il pathway TGFβ di targeting può aumentare le funzioni delle cellule immuni. Siamo presi di mira la regione codifica ectodomain di TGBR2 che lega TGFβ11. I risultati rappresentativi mostrano una diminuzione significativa del livello di espressione di mRNA di questo gene e dimostrano ulteriormente che le cellule NK modificate diventano resistenti a TGFβ. Inoltre, le celle modificate mantenere vitalità e potenziale proliferativo, come essi sono in grado di essere espanso post-elettroporazione utilizzando cellule di alimentatore irradiati. Di conseguenza, il metodo seguente è un promettente approccio per manipolare geneticamente le cellule NK per qualsiasi ulteriore clinico o scopi di ricerca.

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Protocollo

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Buffy coats donatore sano sono stati ottenuti come materiale di partenza da Central Ohio regione American Red Cross. Questa ricerca è stata determinata per essere esentato ricerca ospedale pediatrico Nationwide di Board Review istituzionale.

1. espansione e purificazione delle cellule NK umana

  1. Isolare i PBMCs da Buffy-Coat12.
    1. Livello 35 mL di campione di buffy-coat su 15 mL di Ficoll-Paque.
    2. Centrifugare a 400 x g per 20 minuti senza freno e raccogliere i PBMC dall'interfaccia.
    3. Lavare i PBMC recuperati tre volte con l'aggiunta di almeno un volume uguale di PBS, centrifugazione a 400 x g per 5 minuti e aspirando il PBC lavare. Cellula NK può essere isolata in questa fase di RosettesSep13.
  2. Espandere le cellule NK stimolando con irradiati 10 x 106 mbIL21-esprimendo le cellule di alimentatore ai giorni 0, 7 e 14. Sostituire il supporto con fresco RPMI contenente 10% FBS, 1% glutammina, 1% penicillina streptomicina e 100 UI/mL del-2 per il volume intero media ogni altro giorno.

2. gRNA progettazione e selezione

  1. Scegliere i loci genomici specifici su target, utilizzando gli strumenti online, ad esempio, NCBI, Ensemble.
    Esempio.
    Descrizione: Trasformando il fattore di crescita recettore beta 2 (TGFBRR2) ectodomain
    Visualizzare record: PF08917
    Mostra InterPro: IPR015013
    Posizione: 49-157 aa
    Sequenza di mirati: Essone 4 del gene TGFBR2 (ENSG00000163513)
  2. Per progettare il gRNAs, utilizzare strumenti di web design CRISPR come http://crispr.mit.edu e 'Benchling.'
    1. Immettere nella sequenza del DNA scelta nel passaggio 2.1. Scegliere umani (hg 19) come un genoma di destinazione. CRISPR Guide (20 nucleotidi seguirono da una sequenza di PAM: NGG) verranno analizzati dalla sequenza inserita in precedenza. Viene inoltre illustrato possibili fuori bersaglio corrispondenze in tutto il genoma selezionato.
    2. Scegliere i migliori tre gRNAs che hanno il punteggio più alto, basato sulle loro tariffe on target e fuori bersaglio. Ad esempio, la tabella 1 Mostra il RNAs CRISPR progettato per indirizzare essone 4 del gene TGFBR2 suggerito da strumenti di web design CRISPR.
  3. Ordinare il RNAs CRISPR come sintetica sequenza-specifico crRNAs.
  4. Ordinare un conservato, transattivanti RNA (tracrRNA) per interagire attraverso parziale omologia con il crRNA.

3. progettazione eliminazione primer di Screening

  1. Disegnare primers che abbracciano i siti di fenditura gRNA per analisi di mutazione di T7E1.
  2. Uso primer almeno 100 bp lontano dal sito di clivaggio previsto affinché piccola inserzione-omissione (indels) presso il sito di destinazione sgRNA apparirà su gel di agarosio 1.5% seguendo l'analisi di mutazione. La tabella 2 Mostra i primer che sono utilizzati per amplificare il ectodomain TGFBR2.

4. trasduzione di cellule NK umane primario e ampliato

Nota: Trasduzione degli elementi Cas9/RNP in NK avviene mediante elettroporazione con sistema 4D come segue.

  1. Cella Preparazione
    1. Per primario delle cellule NK, incubare appena isolate cellule NK nel medium RPMI in presenza di 100 UI/mL del-2 per 4 giorni ed eseguire l'elettroporazione al giorno 5. Sostituire il supporto ogni altro giorno, come descritto in precedenza e il giorno prima di trasduzione.
    2. Per cellule NK espanse, stimolano le cellule al giorno 0 con cellule di alimentatore irradiati con un rapporto di 1:1 ed eseguire l'elettroporazione al giorno 5 o 6 o 7. Sostituire il supporto ogni altro giorno, come descritto in precedenza e il giorno prima di trasduzione.
    3. Il giorno dell'elettroporazione, preparare una boccetta di T25 riempita con 8 mL di RPMI freschi contenenti 100 UI/mL del-2 per le cellule in fase di elettroporazione e boccette pre-incubate in un 37 ° C e 5% CO2 incubatrice umidificata.
      Nota: Le celle scongelate o che hanno subito 2nd o 3rd stimolazione può essere individulamente in qualsiasi momento dopo il loro recupero come descritto.
    4. Prendere 3-4 × 106 cellule per condizione per 26 µ l di miscela di trasduzione.
      Nota: Altissima concentrazione di cellule NK in soluzione di elettroporazione migliora il tasso di trasduzione.
    5. Lavare le cellule 3 volte con PBS per rimuovere tutti i FBS, che contiene comunemente RNasi attività. Spin loro giù ogni volta a 300 x g per 8 minuti.
      Nota: Considera 7 condizioni di elettroporazione per Cas/RNP come singolo gRNA (gRNA1, gRNA2, gRNA3) e una combinazione di due gRNAs (gRNA1 + gRNA3, gRNA2, gRNA1 + gRNA3, gRNA2) e un controllo con nessun Cas9/RNP.
  2. Formare il crRNA:tracerRNA / complessi
    1. Risospendere crRNAs (gRNA1, gRNA2 e gRNA3) e tracerRNA in 1 x TE soluzione a concentrazioni finali di 200 μM. 2.2 mix μL di ogni gRNA di 200 μM con 200 μM tracerRNA, come mostrato nella tabella 3.
    2. Riscaldare i campioni a 95 ° C per 5 minuti e lasciare per raffreddare sulla parte superiore del banco a temperatura ambiente (15-25 ° C). Archivio risospese RNAs e crRNA: tracerRNA/complesso a-20 ° C per un uso successivo.
  3. Formano il complesso RNP
    Nota:     per risparmiare tempo, formare il RNP complesso durante il lavaggio punto 4.1.5.
    1. Per crRNA:tracrRNA singola reazione duplex, diluire Cas9 endonucleasi a 36 μM, come mostrato nell'esempio in tabella 4.
    2. Per la trasduzione di combinazione dei crRNA:tracrRNA duplex, diluire Cas9 endonucleasi a 36 μM come mostrato nell'esempio in tabella 5.
    3. Aggiungere dell'endonucleasi Cas9 crRNA:tracrRNA duplex lentamente mentre agitando la punta della pipetta, oltre 30 s a 1 minuto.
    4. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 15-20 min. Se non è possibile utilizzare la miscela dopo incubazione, mantenere la miscela sul ghiaccio fino all'utilizzo.
  4. Elettroporazione
    1. Aggiungere il supplemento intero alla soluzione di elettroporazione P3 e tenerlo a temperatura ambiente.
    2. Risospendere il pellet cellulare (3-4 × 106 cellule dal punto 4.1.5) in 20 μL di soluzione di elettroporazione 4D primaria P3. Evitare le bolle d'aria durante il pipettaggio.
      Nota: le celle non devono essere lasciate per lungo tempo nella soluzione di P3.
    3. Immediatamente aggiungere 5 µ l di RNP complesse (punto 4.3) alla sospensione di cellule.
    4. Aggiungere 1 μL 100 del rinforzatore di elettroporazione Cas9 μM a Cas9/RNP/cella di mescolare.
    5. Trasferimento mix Cas9/RNP/celle in 20 μL elettroporazione strisce.
    6. Picchiettare delicatamente le strisce per assicurarsi che il campione copre la parte inferiore delle strisce.
    7. Avviare il sistema di elettroporazione 4D e scegliere il programma EN-138 .

5. post trasduzione

  1. Lasciare che le celle riposare per 3 minuti nelle strisce.
  2. Aggiungere 80 µ l di terreno di coltura pre-equilibrato per la cuvetta e trasferire delicatamente il campione in palloni.
  3. 48 ore dopo la trasduzione, estrarre il DNA genomico da 5 × 105 celle per le eliminazioni di gene di screening.
  4. Amplificare il gene di interesse utilizzando il primer disegnati nel passaggio 3.2 con kit di Taq DNA polimerasi.
  5. Formare eteroduplici amplicone PCR per T7EI digestione e incubare il prodotto per 30-60 minuti con un enzima di T7EI a 37 ° C.
    Nota: Il T7EI assay è comodo per lo screening di quanto è veloce, semplice e fornisce pulito risultati elettroforesi rispetto all'utilizzo di analisi surveyor. Tuttavia, questo metodo non può rilevare inserimenti ed eliminazioni di < 2 basi che vengono generate dal non-omologo fine entrare in attività (NHEJ) nel Cas9 RNP esperimenti14.
  6. Eseguire il DNA digerito il 1,5% del gel dell'agarosi a 110 V per 30-45 minuti, ogni 15 minuti visualizzare il gel.
  7. Stimolare il resto delle cellule con il mbIL21-esprimendo le cellule di alimentatore con un rapporto di 1:1.
  8. Cinque giorni dopo stimolazione estrarre il RNA per livello di espressione genica mediante qPCR.
  9. Saggi di calceina condotta come precedentemente segnalato12. Brevemente, caricare le cellule bersaglio con calceina (nell'esempio illustrato, è stato utilizzato 3 celle DAOY µ g/mL/1.000.000). Preparare le cellule NK per saggi di citotossicità di una notte di riposo in IL2 (100 UI/mL) più o meno 10 ng/mL TGFβ solubile. Condurre la calceina saggi nelle stesse citochine come le cellule NK erano riposate in una notte.

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Risultati

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Efficienza di elettroporazione

Per ottimizzare l'elettroporazione di Cas9/RNP, abbiamo testato 16 programmi diversi con trasduzione di GFP non-targeting siRNA e plasmide del DNA in cellule NK. Analisi di citometria a flusso ha mostrato che l' EN-138 aveva la più alta percentuale di efficienza attuabilità e la trasduzione delle cellule (35% GFP positive cellule vive) per entrambe le particelle (...

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Discussione

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Modificazione del DNA-dipendente delle cellule di NK è stato impegnativo4,9. Abbiamo, pertanto, introdotto direttamente un complesso ribonucleoproteico sinteticamente preformati (RNP) e la proteina Cas9 come proteina purificata nel primario ed espansa di cellule NK8. Questo metodo ci ha permesso di eliminare la tappatura, alle costole, e altri processi trascrizionali e traslazionali iniziato dalla RNA polimerasi II, che può causare l'apopt...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DAL serve/ha servito come consulente per corriere Therapeutics, ossidiana Therapeutics, Intellian Therapeutics, Merck Research Laboratories e Miltenyi Biotec e dispone di equità/Leadership in CytoSen Therapeutics.

Ringraziamenti

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Riconosciamo Brian Tullius per il suo gentile aiuto nella redazione del manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
RosettaSep&commercio; Cocktail di arricchimento delle cellule NK umaneTecnologie delle cellule staminali15065La rosettaSep™ Il cocktail di arricchimento delle cellule NK umane è progettato per isolare le cellule NK dal sangue intero mediante selezione negativa.
Ficoll-Paque® PLUSGE Healthcare - Scienze della vita17-1440-02
Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNAIntegrated DNA Technologies1072532TracrRNA che contiene modifiche chimiche proprietarie che conferiscono una maggiore resistenza alla nucleasi. Si ibrida al crRNA per attivare l'enzima Cas9
Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNATecnologieProdotto sinteticamente come Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, basato sulla sequenza di gRNA progettato che ha come bersaglio il gene dell'interesse
Alt-R® Kit di rilevamento per l'editing del genomaTecnologie del DNA integrateOgni kit contiene l'endonucleasi T7EI, il tampone di reazione T7EI e i controlli del saggio T7EI.
Platino® Taq DNA polimerasi ad alta fedeltàInvitrogen11304-011
4D-Nucleofector™ SistemaLonzaAAF-1002B
Proteina IL-2 ricombinante umanaNovartis65483-0116-07
P3 Cellula primaria 4D-Nucleofector&commercio; X KitLonzaV4XP-3032Contiene pmaxGFP™ Vettore, Nucleofector e commercio; Soluzione, Supplemento, 16 pozzetti Nucleocuvette™ Strisce
Non targeting: siRNA personalizzato, standard 0,05 2mol ON-TARGETplusDharmaconCTM-360019
Alt-R® S.p. Cas9 Nucleasi 3NLSTecnologie integrate del DNA1074181Cas9 Nucleasi
DNeasy® Sangue & Manuale dei tessutiQiagen69504
RNeasy Mini KitQiagen74104
Calcein AMThermoFisherC3099
TGFβBiolegend580706
Alt-R® Kit di controllo CRISPR-Cas9,Integrated DNA Technologies1072554include tracrRNA, crRNA a controllo positivo HPRT, crRNA a controllo negativo#1, miscela di primer HPRT e tampone duplex privo di nucleasi.
IDTE pH 7.5 (soluzione 1X TE)Integrated DNA Technologies11-01-02-02
Alt-R® Potenziatore di elettroporazione Cas9Tecnologie DNA integrate1075915Potenziatore di elettroporazione Cas9
DNA integrate 1075931 Human

Riferimenti

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