Generazione di cellule Knock-out NK umano primario ed espansa utilizzando Cas9 ribonucleoproteine

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per modificare geneticamente le cellule primarie o espanso umana naturale dell'assassino (NK) utilizzando Cas9 ribonucleoproteine (Cas9/RNP). Utilizzando questo protocollo, abbiamo generato le cellule NK umane carenti per trasformare il recettore del fattore di crescita – b 2 (TGFBR2) e ipoxantina fosforibosiltransferasi 1 (HPRT1).

Abstract

CRISPR/Cas9 tecnologia sta accelerando ingegneria genoma in molti tipi cellulari, ma finora, consegna del gene e modificazione genetica stabile sono stati impegnativi in cellule primarie di NK. Ad esempio, consegna di transgene mediante trasduzione lentivirale o retrovirali ha provocato una resa limitata delle cellule NK geneticamente a causa della sostanziale procedura-collegata di apoptosi di cellule NK. Descriviamo qui un metodo privo di DNA per l'editing genomico umane primarie e ampliate delle cellule di NK utilizzando complessi di ribonucleoproteina Cas9 (Cas9/RNP). Questo metodo ha permesso efficiente knockout del TGFBR2 e HPRT1 geni in cellule di NK. Dati di RT-PCR ha mostrato una diminuzione significativa nel livello di espressione genica, e un'analisi di citotossicità di un prodotto rappresentativo delle cellule ha suggerito che le cellule NK RNP-modificato è diventato meno sensibile di TGFβ. Cellule geneticamente modificate potrebbero essere espansa post-elettroporazione dalla stimolazione con irradiato mbIL21-esprimendo le cellule di alimentatore.

Introduzione

Immunoterapia del cancro è stato avanzato negli ultimi anni. Le cellule di T del recettore (auto) antigene chimerica geneticamente modificati sono un ottimo esempio di cellule immuni ingegnerizzate distribuito correttamente nell'immunoterapia del cancro. Queste cellule sono stati recentemente approvate dalla FDA per il trattamento contro CD19 + B delle cellule maligne, ma successo finora è stata limitata a malattie cuscinetto alcuni antigeni indirizzabile e targeting tale limitato repertorio antigenico è incline al fallimento di fuga immune. Inoltre, le cellule di T di auto sono state concentrate sull'uso di cellule T autologhe a causa del rischio di malattia dell'inn....

Protocollo

Buffy coats donatore sano sono stati ottenuti come materiale di partenza da Central Ohio regione American Red Cross. Questa ricerca è stata determinata per essere esentato ricerca ospedale pediatrico Nationwide di Board Review istituzionale.

1. espansione e purificazione delle cellule NK umana

1. Isolare i PBMCs da Buffy-Coat¹².
   1. Livello 35 mL di campione di buffy-coat su 15 mL di Ficoll-Paque.
   2. Centrifugare a 400 x g per 20 minuti senza freno e raccogliere i PBMC dall'interfaccia.
   3. Lavare i PBMC recuperati tre volte con l'aggiunta di almeno un volume uguale di PBS, centrifugazione a....

Risultati

Efficienza di elettroporazione

Per ottimizzare l'elettroporazione di Cas9/RNP, abbiamo testato 16 programmi diversi con trasduzione di GFP non-targeting siRNA e plasmide del DNA in cellule NK. Analisi di citometria a flusso ha mostrato che l' EN-138 aveva la più alta percentuale di efficienza attuabilità e la trasduzione delle cellule (35% GFP positive cellule vive) per entrambe le particelle (.......

Discussione

Modificazione del DNA-dipendente delle cellule di NK è stato impegnativo^4,9. Abbiamo, pertanto, introdotto direttamente un complesso ribonucleoproteico sinteticamente preformati (RNP) e la proteina Cas9 come proteina purificata nel primario ed espansa di cellule NK⁸. Questo metodo ci ha permesso di eliminare la tappatura, alle costole, e altri processi trascrizionali e traslazionali iniziato dalla RNA polimerasi II, che può causare l'apopt.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
RosettaSep&commercio; Cocktail di arricchimento delle cellule NK umane	Tecnologie delle cellule staminali	15065	La rosettaSep™ Il cocktail di arricchimento delle cellule NK umane è progettato per isolare le cellule NK dal sangue intero mediante selezione negativa.
Ficoll-Paque® PLUS	GE Healthcare - Scienze della vita	17-1440-02
Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA	Integrated DNA Technologies	1072532	TracrRNA che contiene modifiche chimiche proprietarie che conferiscono una maggiore resistenza alla nucleasi. Si ibrida al crRNA per attivare l'enzima Cas9
Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA	Tecnologie		Prodotto sinteticamente come Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, basato sulla sequenza di gRNA progettato che ha come bersaglio il gene dell'interesse
Alt-R® Kit di rilevamento per l'editing del genoma	Tecnologie del DNA integrate	Ogni kit contiene l'endonucleasi T7EI, il tampone di reazione T7EI e i controlli del saggio T7EI.
Platino® Taq DNA polimerasi ad alta fedeltà	Invitrogen	11304-011
4D-Nucleofector™ Sistema	Lonza	AAF-1002B
Proteina IL-2 ricombinante umana	Novartis	65483-0116-07
P3 Cellula primaria 4D-Nucleofector&commercio; X Kit	Lonza	V4XP-3032	Contiene pmaxGFP™ Vettore, Nucleofector e commercio; Soluzione, Supplemento, 16 pozzetti Nucleocuvette™ Strisce
Non targeting: siRNA personalizzato, standard 0,05 2mol ON-TARGETplus	Dharmacon	CTM-360019
Alt-R® S.p. Cas9 Nucleasi 3NLS	Tecnologie integrate del DNA	1074181	Cas9 Nucleasi
DNeasy® Sangue & Manuale dei tessuti	Qiagen	69504
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
Calcein AM	ThermoFisher	C3099
TGFβ	Biolegend	580706
Alt-R® Kit di controllo CRISPR-Cas9,	Integrated DNA Technologies	1072554	include tracrRNA, crRNA a controllo positivo HPRT, crRNA a controllo negativo#1, miscela di primer HPRT e tampone duplex privo di nucleasi.
IDTE pH 7.5 (soluzione 1X TE)	Integrated DNA Technologies	11-01-02-02
Alt-R® Potenziatore di elettroporazione Cas9	Tecnologie DNA integrate	1075915	Potenziatore di elettroporazione Cas9

DNA integrate 1075931 Human