Un metodo basato su stampo netto della creazione senza impalcatura tridimensionale del tessuto cardiaco

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo basato su stampo netto per creare tessuti cardiaci senza impalcatura tridimensionale con soddisfacente integrità strutturale e comportamento sincrono pestaggio.

Abstract

Questo protocollo descrive un romanzo e facile metodo basato su stampo netto per creare tessuti cardiaci di tridimensionale (3D) senza materiale aggiuntivo impalcatura. Cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC-CMs), fibroblasti cardiaci umani (HCF) e cellule endoteliali di vena ombelicale umana (HUVECs) sono isolate e utilizzate per generare una sospensione cellulare con 70% iPSC-CMs, HCF 15% e 15% HUVECs. Sono co-coltivate in un sistema di "appendere goccia" attacco ultra-basso, che contiene micropori per condensazione centinaia di sferoidi in una sola volta. Le cellule di aggregazione e spontaneamente formano sferoidi pestaggio dopo 3 giorni di co-coltura. Sferoidi sono raccolte, seminati in una cavità dello stampo novello e coltivate su un agitatore in incubatrice. Sferoidi diventano un tessuto funzionale maturo circa 7 giorni dopo la semina. I tessuti multistrati risultanti è costituito da sferoidi fusi con soddisfacente integrità strutturale e comportamento sincrono pestaggio. Questo nuovo metodo ha un potenziale promettente come un metodo riproducibile ed economico per creare tessuti ingegnerizzati per il trattamento dello scompenso cardiaco in futuro.

Introduzione

L'obiettivo di ingegneria del tessuto cardiaco attuale è quello di sviluppare una terapia per sostituire o riparare la struttura e la funzione del tessuto del miocardio danneggiato¹. Metodi per creare modelli 3D del tessuto cardiaco che esibiscono le importanti proprietà contrattili ed elettrofisiologiche del tessuto cardiaco nativo sono stati rapidamente in espansione^2,3. Una varietà di strategie sono stati esplorati e utilizzati in studi^4,5. Questi vanno di metodi dall'uso di specifici idrogeli bioattivi naturali e sintetici, come gelatina, collagene, fibrina e peptidi⁶, a bio-inchiostro deposizione tecnologie² e multimateriali tecnologie⁷.

È stato dimostrato che senza impalcatura metodi possono produrre tessuti paragonabile come metodi basati su biomateriale, senza gli svantaggi di incorporare ponteggi stranieri materiale⁸. Oren Caspi et al hanno dimostrato che l'incorporazione di vari tipi di cellule consente la generazione di tessuto cardiaco ingegnerizzato umano altamente vascularized⁹. Mento et al ha sviluppato un metodo di stampa 3D per la creazione di patch cardiaci di sferoidi. Le patch risultante sono composte di cardiomiociti, fibroblasti e cellule endoteliali in un rapporto di 70:15:15¹⁰. Sferoidi sono stati indicati per essere efficaci "building blocks" della creazione del tessuto cardiaco senza impalcatura, come essi sono resistenti contro ipossia e possedere sufficiente integrità meccanica per l'impianto^11,12. Gli studi precedenti hanno dimostrato parecchi metodi di fabbricazione per la creazione di sferoide, compreso l'uso dell'impiccagione drop metodo, spinner boccette¹³, di sistemi microfluidici¹⁴e antiaderente cultura superfici non rivestite o rivestite con agarosio micro-stampi¹⁵. In questo protocollo, usiamo l'impiccagione dispositivo di discesa, che contiene micropori per condensazione centinaia di sferoidi in una sola volta.

Questo studio presenta un romanzo e l'efficiente metodo senza impalcatura per la creazione di tessuto cardiaco, che comprende il seeding manualmente sferoidi in una cavità dello stampo quadrato e incubando il tessuto su un agitatore per maturazione. In condizioni di coltura statica usuale, diffusione dell'ossigeno è limitato agli aspetti esterni del costrutto del tessuto, con conseguente necrosi centrale. Tuttavia, con la muffa netta, tutte le sferoidi seminati nello stampo sono immersi nei media con un costante movimento fluidico, consentendo per la maggiore diffusione di sostanze nutritive e di ossigeno. Inoltre, questo metodo basato su stampo consente la creazione simultanea di patch di tessuto di diverse dimensioni con il minimo sforzo manuale e il tessuto risultante può essere facilmente rimosso dallo stampo. Questo nuovo metodo consente la creazione efficiente e riproducibile di patch cardiache senza impalcatura, multistrata.

Protocollo

1. preparazione dei cardiomiociti

1. Piastre da 6 pozzetti cappotto con membrana basale matrix e cultura umana indotta cellule staminali pluripotenti (hiPSCs) come precedentemente descritto¹⁷.
2. Differenziarsi hiPSCs in hiPSC-CMs utilizzando metodi precedentemente descritti¹⁸.
3. Alla post-differenziazione 16-18 d, sospendere i cardiomiociti risciacquando ogni pozzetto con 2 mL di tampone fosfato salino (PBS): 1x senza calcio o magnesio, seguita da incubazione con 1 mL/bene di tripsina o cella reagente di dissociazione (Vedi tabella di Materiali) per 5 min a temperatura ambiente.
4. Neutralizzare il reagente di dissociazione tripsina o cella (Vedi Tabella materiali) utilizzando un volume uguale di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) cell supporti completati con B-27 (27/B-RPMI cell supporti). Pipettare su e giù per allentare eventuali cellule aderite.
5. Raccogliere i cardiomiociti sospesi con una pipetta sierologica di 10 mL e trasferirli in una provetta conica da 50 mL.
6. Centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 min a temperatura ambiente per ottenere un pellet cellulare.
7. Risospendere il pellet in 10 mL di RPMI/B-27 cell supporti.
8. 20 µ l di sospensione cellulare si combinano con una quantità uguale di soluzione di blu di Trypan 0,4% e mescolare delicatamente.
9. Utilizzare un emocitometro manuale per contare e ottenere la vitalità delle cellule e di concentrazione della sospensione delle cellule.

2. preparazione dei fibroblasti

1. Avviare una coltura di una linea cellulare di (tipo adulto ventricolare) fibroblasti cardiaci umani (HCF) come descritto in precedenza¹⁶.
2. Sospendere il HCF incubando li con una quantità appropriata di tripsina o cella reagente di dissociazione (Vedi Tabella materiali) per 5 min a temperatura ambiente¹⁶. Per un pallone T175, 10 mL di reagente di dissociazione di tripsina o cella è stato usato.
3. Neutralizzare il reagente di dissociazione tripsina o cella (Vedi Tabella materiali) utilizzando un volume uguale di mezzo, quindi trasferire il campione in una provetta conica da 50 mL e centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 min a temperatura ambiente per ottenere una pellet.
4. Risospendere il pellet in 10 mL di mezzo di sviluppo del fibroblasto (Vedi Tabella materiali).
5. 20 µ l di sospensione cellulare HCF si combinano con una quantità uguale di soluzione di blu di trypan 0,4% e mescolare delicatamente.
6. È possibile utilizzare un contatore di cellule automatizzato o manuale emocitometro per contare e ottenere la vitalità delle cellule e di concentrazione della sospensione delle cellule nuove.

3. preparazione delle cellule endoteliali

1. Avviare una coltura di una linea di cellule endoteliali (HUVEC) di vena ombelicale umana come descritto in precedenza¹⁷. Sospendere il HUVECs incubando li con una quantità appropriata di tripsina o cella reagente di dissociazione (Vedi Tabella materiali) per 3 min a temperatura ambiente¹⁷. Neutralizzare il reagente di dissociazione tripsina o cella (Vedi Tabella materiali) utilizzando un volume uguale di mezzo, poi il trasferimento in una provetta conica da 50 mL e centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 min a temperatura ambiente per ottenere una pallina.
   Nota: Per un pallone T175, 10 mL di reagente di dissociazione di tripsina o cella è stato usato.
2. Risospendere il pellet in 10 mL di mezzo di crescita delle cellule endoteliali (Vedi Tabella materiali).
3. Combinare 20 µ l della sospensione HUVEC e macchia con una pari quantità di soluzione di blu di Trypan 0,4% e mescolare delicatamente.
4. È possibile utilizzare un contatore di cellule automatizzato o un emocitometro manuale per contare e ottenere la vitalità delle cellule e di concentrazione della sospensione delle cellule.

4. creazione di appendere goccia sferoidi

1. Posizionare l'impiccagione dispositivo di discesa che contiene 850 micropori (ciascuna con un diametro di 350 µm) in piastre da 6 pozzetti sterili.
2. Isolare i tre tipi di cellule, come descritto in precedenza: hiPSC-CMs, HCF e HUVECs. Combinarle in un rapporto di 70% iPSC-CMs, HCF 15% e 15% HUVECs in una provetta conica da 50 mL con RPMI/B-27 media delle cellule ad una concentrazione di 2.475.000 cellule per mL.
3. Dispensare 4 mL della sospensione delle cellule (2.475.000 cellule / mL) in ciascun pozzetto di un bassissimo allegato sistema goccia, (con un diametro di micropori di 350 µm), seduto in una piastra a 6 pozzetti d'attaccatura.
4. Sferoidi formeranno spontaneamente entro 12 h di erogazione la sospensione cellulare nell'impiccagione dispositivo goccia. Continuare alla cultura per un totale di 72 h (3 d) a 37 ° C, 5% CO₂e 95% di umidità per la maturazione di sferoidi.
5. Dopo 72 h di cultura, raccogliere le sferoidi attraverso i pori nella parte inferiore dell'impiccagione goccia sistema posizionando il dispositivo in un piatto con il mezzo e agitando delicatamente per rilasciare le sferoidi da appendere goccia dispositivo.

5. 3D Patch creazione usando il romanzo muffa netta

1. La base, piatto quadrato fondo, fondo netto e 10 lato a strati le reti vengono assemblate per creare lo stampo romanzo con l'aiuto di un paio di pinze sterili. In primo luogo, impilare e allineare la base, piatto quadrato fondo e fondo rete utilizzando i paletti d'angolo. Quindi, stack e le reti di 10 lato in direzione per creare una rete di fine acciaio inossidabile rebbi alternata di strato.
2. Sciacquare il ripieno base con PBS o mezzo per ridurre la tensione superficiale e, quindi, trasferire lo stampo montato sulla base di riempimento.
3. Bagnare la cavità dello stampo netto con PBS o mezzo nello stesso metodo. Riempire lentamente gli sferoidi nella cavità presupposta della dimensione desiderata (2 x 2 x 1 mm, 4 x 4 x 1 mm, o 6 x 6 x 1 mm).
   Nota: Assicurarsi che il 120% del volume previsto di sferoidi è alimentato nella cavità affinché gli aggregati di cellule sono in stretto collegamento e rimanere statici.
4. Assemblare la parte superiore netto e piastra superiore quadrata sul post di angolo e fissare i tappi e tubi di detenzione per prevenire un washout di sferoidi.
5. Trasferire il sistema di stampo netto riempito su una piastra a 6 pozzetti con 6 mL di RPMI/B-27 cell supporti o in un contenitore sterile con abbastanza medio per coprire lo stampo intero assemblato.
6. Incubare la piastra a 6 pozzetti con il sistema di stampo riempito con un agitatore oscillante per 7-10 giorni a 3.000-4.000 x g.
   Nota: La durata dell'incubazione è decisa dalle dimensioni delle patch cardiaci. Con le patch più grande, il tempo di incubazione dovrà essere aumentato per maturazione di patch cardiaci.

6. rimozione del cerotto dallo stampo netto romanzo

1. Rimuovere il sistema di stampo dal supporto e posizionarlo sulla stuoia di movimentazione sterilizzati in un piatto di 10 cm sterile.
2. Rimuovere il tubo di supporto, tappi, la piastra superiore quadrata e la rete superiore. Sfilare con attenzione le reti di lato a strati uno con un paio di pinze sterili. Dopo il decannulation, è ottenere un patch cardiaci intatto in cima a fondo netto.
3. Pick up il fondo netto con la patch utilizzando pinze sterili e trasferire il fondo netto in un piatto di 35 mm con 5 mL di terreno RPMI/B27. Allentare leggermente la patch dal fondo netto agitando lentamente la rete nel piatto, o con un raschietto di cellule sterili. Dopo il distacco dal fondo netto, il tessuto cardiaco possa essere coltivato con RPMI/B27 media.
4. Continuare a incubare la patch cardiaca 3D digalleggiante nel piatto 35 mm. Pestaggio sincrono funzionale può essere osservato più presto 24 h dopo la rimozione dallo stampo.
5. Dopo aver rimosso la patch dallo stampo netto, osservare che la sua forma è mantenuta con l'integrità e l'intensità del battito sincrono aumenta con il tempo.
   Nota: Il netto 3D basati su stampo cardiaco patch ha esibito integrazione elettrica della componente cardiosfere dopo il decannulation. Abbiamo osservato una frequenza di battito che variano da 60 a 80 battiti al minuto che ha persistito per più di 60 giorni.

Risultati

Nei nostri esperimenti, abbiamo utilizzato una sospensione cellulare di 70% iPSC-CMs, HCF 15% e 15% HUVECs in RPMI/B-27 media delle cellule ad una concentrazione di 2.475.000 cellule per mL. Dopo aver creato la sospensione cellulare, abbiamo erogato 4 mL di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di un bassissimo allegato blocco sistema goccia, come descritto al punto 4.3 del protocollo. L'uso dell'impiccagione goccia sistema ha provocato la formazione spontanea di centinaia di battere ...

Discussione

Il significato di questo metodo risiede nella sua riproducibilità e l'efficacia del tessuto cardiaco multistrato risultante. Nel campo dell'ingegneria del tessuto cardiaco, uno degli attuali obiettivi è quello di identificare un metodo per costruire palpitante, multistrata e funzionale 3D patch cardiache. Segnaliamo un metodo efficace e riproducibile di creare tessuti cardiaci multistrati di semina diretta manuale di sferoidi composti di cardiomiociti, cellule endoteliali e fibroblasti in un romanzo stampo netto. Lo stam...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Fibroblasti cardiaci umani (HCF)	Sciencell	6310
FM-2 Consiste in terreno di coltura basale	Sciencell	2331	HCF
Cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC)	Lonza	CC-2935
EGM+Bullet Kit	Lonza	CC5035	HUVEC terreno di coltura
E8 media	Invitrogen	A1517001	HiPSC
Geltrex	Invitrogen	A1413202
TrypLE Express Enzyme (1X)	Thermo Fisher	12604013	Tripsina e reagente di dissociazione cellulare
Terreni RPMI	Invitrogen	11875093	terreni RPMI con integratore di B-27 sono terreni di coltura hiPSC-CM
Integratore di B-27 (50x)	Thermo Fisher	17504044	terreni RPMI con integratore di B-27 sono terreni di coltura hiPSC-CM
Trypan Blue Soluzione, 0,4%	Thermo Fisher	15250061
Nuovo stampo a rete	TissueByNet Co., Ltd	NM25-1
Piastra di goccia sospesa	Kuraray Co., Ltd	MPc350
Piastre a 6 pozzetti	Sigma-Aldrich	CLS-3516