Articolo metodologico

Adipo-Clear: Un tessuto metodo di compensazione per l'Imaging tridimensionale del tessuto adiposo

DOI:

10.3791/58271

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28 luglio 2018

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1Laboratory of Molecular Metabolism, The Rockefeller University, 2Laboratory of Brain Development and Repair, The Rockefeller University, 3Laboratory of Molecular Genetics, The Rockefeller University

In questo articolo

Sommario

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A causa del contenuto elevato del lipido, tessuto adiposo è stato impegnativo per visualizzare usando i metodi istologici tradizionali. Adipo-Clear è un tessuto tecnica che permette di etichettatura robusto e imaging fluorescente volumetrica ad alta risoluzione del tessuto adiposo di compensazione. Qui, descriviamo i metodi per la preparazione del campione, pretrattamento, colorazione, compensazione e montaggio per l'imaging.

Abstract

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Tessuto adiposo gioca un ruolo centrale nell'omeostasi energetica e termoregolazione. Esso è composto da diversi tipi di adipociti, così come precursori degli adipociti, cellule immunitarie, fibroblasti, vasi sanguigni e le proiezioni del nervo. Sebbene il controllo molecolare di specifica del tipo di cellula e come interagiscono queste cellule sono state sempre più delineate, una comprensione più completa di queste cellule adiposo-residente si può visualizzare la loro distribuzione e architettura durante l'intero tessuto. Approcci attuali di immunoistochimica e immunofluorescenza per analizzare l'istologia adiposa si basano su sezioni sottili di paraffina. Tuttavia, sezioni sottili catturano solo una piccola porzione di tessuto; di conseguenza, le conclusioni possono essere prevenute da quale parte del tessuto è analizzato. Abbiamo quindi sviluppato un tessuto adiposo compensazione tecnica, Adipo-Clear, per consentire la completa visualizzazione tridimensionale di modelli cellulari e molecolari in tessuti adiposi interi. Adipo-Clear è stato adattato da iDISCO / iDISCO +, con specifiche modifiche apportate a rimuovere completamente il lipido immagazzinato nel tessuto, preservando la morfologia del tessuto nativo. In combinazione con microscopia di fluorescenza di luce-foglio, dimostriamo qui l'uso del metodo Adipo-Clear per ottenere immagini ad alta risoluzione volumetriche di un intero del tessuto adiposo.

Introduzione

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Fino a poco tempo, il tessuto adiposo fu concepito come un insieme amorfo di cellule adipose. Negli ultimi decenni, la nostra comprensione è cresciuta più sofisticato, con grasso ora riconosciuta per essere un organo complesso contenente diversi tipi di adipociti, così come precursori degli adipociti, cellule immunitarie, fibroblasti, il sistema vascolare e proiezioni del nervo. Interazioni tra queste cellule adiposo residenti hanno pronunciato effetti sul tessuto adiposo e organismal fisiologia e patofisiologia1. Anche se gli studi emergenti hanno dipanato importanti meccanismi molecolari alla base di determinate interazioni, una comprensione ....

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Protocollo

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Sperimentazione e cura degli animali sono state eseguite secondo procedure approvate dal comitato di utilizzo presso la Rockefeller University e istituti di cura degli animali.

1. tessuto preparazione

  1. Eseguire standard perfusione intracardiaca con ~ 20 mL di 1x tamponato fosfato salino (PBS) a 4 ° C fino a quando il sangue viene completamente rimosso dal tessuto.
  2. Passare il perfusato ~ 20 mL di soluzione fissante (4% paraformaldeide (PFA) in PBS 1X) a 4 ° C fino a quando il collo e la coda sono notevolmente irrigidito.
    Attenzione: PFA è tossico. Evitare il contatto con pelle, occhi e mucose. Soluzioni dovrebbero esser....

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Risultati

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Adipo-Clear preparato intero grasso pastiglie possono essere imaged in 3D per analizzare come interazioni cellulari e morfologia del tessuto sono interessate negli stati magri ed obesi. Questo metodo può essere applicato facilmente per analizzare la struttura adiposa generale raccogliendo il segnale di autofluorescenza del tessuto nel canale verde. Precedentemente abbiamo indicato che l'autofluorescenza segnale in overlay adiposo favorevolmente con perilipina macchiatura, un indicatore co.......

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Discussione

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Adipo-Clear è un metodo semplice e robusto per l'eliminazione del tessuto adiposo, che può essere facilmente eseguito in una configurazione di laboratorio regolari. In confronto ad altri metodi di schiarimento solvente come iDISCO / iDISCO +10,11,12, Adipo-Clear è particolarmente ottimizzata per la rimozione del tessuto adiposo e altri tessuti con alto contenuto di grassi. Il passo di delipidizzazione rimuove completamente i lip.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Christina Pyrgaki, Tao Tong e Alison North da centro di risorse di Bioimmagini presso la Rockefeller University per assistenza e supporto. Ringraziamo anche Xiphias Ge Zhu per l'editing di film. Questo lavoro è stato supportato da Human Frontier Science programma organizzazione (PC).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1x soluzione salina tamponata con fosfatoCorning21-040-CV
ParaformaldeideSigma AldrichP6148-1KG
MetanoloFisher ScientificA412SK-4
Triton X-100Sigma AldrichX100-500ML
Tween 20Sigma AldrichP2287-500ML
EparinaSigma AldrichH3393-100KU
DiclorometanoSigma Aldrich270991
Perossido di idrogeno 30%Fisher Scientific325-100
Etere benzilicoSigma Aldrich108014
AgarosioInvitrogeno16500500
Sodio azideSigma Aldrich71289-5G
GlicinaFisher ScientificBP381-1
Coniglio policlonale anti-Tirosina IdrossilasiMilliporeAB1521:200 diluizione
Capra policlonale anti-CD31/PECAM-1R& D SystemsAF3628Concentrazione finale di 2 µ g/mL
Monoclonale di Ratto anti-CD68, Clone FA-11Bio-RadMCA1957Concentrazione finale di 2 µ g/mL
Asino anti-coniglio IgG (H+L) Alexa Fluor 647Jackson ImmunoResearch711-605-152Concentrazione finale di 5-10 &; g/mL
Asino anti-capra IgG (H+L) Alexa Fluor 568InvitrogenA11077Concentrazione finale di 5-10 µ g/mL
Asino anti-ratto IgG (H+L) Alexa Fluor 647Jackson ImmunoResearch712-605-153Concentrazione finale di 5-10 &; g/mL
Cameradi imaging ibidi80287
Microscopio a foglio leggeroLaVision BioTecUltramicroscope II
Software di imagingSoftware LaVision BioTecImspector Software
visualizzazione per microscopiaBitplaneImaris
di

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What We Talk About When We Talk About Fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
  2. Barbatelli, G., et al. The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown ....

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Metodo Adipo ClearMicroscopia a foglio di luceProcesso di delipidazioneProcedura di immunocolorazioneInclusione in agarosioAdattamento dell indice di rifrazioneProgenitori degli adipociti

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