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Articolo metodologico

Liposomi antigenici per la generazione di anticorpi specifici per la malattia

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DOI:

10.3791/58285

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25 ottobre 2018

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1Janssen R&D, 2Department of Microbiology and Immunology, University of North Carolina, 3UNC Food Allergy Initiative, University of North Carolina, 4Department of Pediatrics, University of North Carolina, 5Department of Chemistry, University of Alberta, 6Department of Molecular Medicine, Scripps Research Institute, 7Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Alberta

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Descritto è la preparazione di nanoparticelle liposomiale antigeniche e loro uso nella stimolante della B-cellula attivazione in vitro e in vivo. Risposte anticorpali coerente e stabile ha condotto allo sviluppo di un nuovo modello di allergia dell'arachide. Il protocollo per la generazione di liposomi antigenici può essere estesa a diversi antigeni e modelli di immunizzazione.

Abstract

Risposte anticorpali forniscono immunità protettiva critico per una vasta gamma di agenti patogeni. Ci rimane un elevato interesse nel generare anticorpi robusti per la vaccinazione così come capire come patogeno anticorpo risposte sviluppano allergie e malattie autoimmuni. Non è banale generando risposte robusto dell'anticorpo antigene-specifiche. In modelli murini, spesso richiede più cicli di vaccinazioni con adiuvante che conduce ad una grande quantità di variabilità dei livelli di anticorpi indotti. Un esempio è in modelli murini di allergie arachidi dove modelli più robusti e riproducibile che riducono al minimo i numeri del mouse e l'uso dell'adiuvante sarebbe vantaggioso. Presentato qui è un modello murino altamente riproducibili di anafilassi allergia dell'arachide. Questo nuovo modello si basa su due fattori chiave: (1) antigene-specifici splenocytes passivamente vengono trasferiti da un mouse di arachidi-sensibilizzati in un ingenuo destinatario mouse, normalizzare il numero di memoria antigene-specifiche cellule di B e di T attraverso un gran numero di topi; e (2) destinatari topi sono successivamente potenziati con un forte immunogen multivalenti sotto forma di nanoparticelle liposomiale visualizzati l'allergene principale dell'arachide (Ara h 2). Il principale vantaggio di questo modello è la sua riproducibilità, che in ultima analisi, riduce il numero di animali utilizzati in ogni studio, riducendo al minimo il numero di animali che ricevono iniezioni multiple di adiuvante. L'assemblaggio modulare di questi liposomi immunogenici fornisce relativamente facile adattabilità ad altri modelli allergiche o autoimmuni che coinvolgono gli anticorpi patogeni.

Introduzione

Allergia alimentare colpisce l'8% dei bambini negli Stati Uniti e ha aumentato in prevalenza negli ultimi dieci anni1. Allergia alle arachidi colpisce l'1% dei bambini e non è in genere sovrasviluppata2. Anche se parecchi test clinici promettenti sono in corso per il trattamento di allergia alimentare, tra cui l'immunoterapia orale (OIT), l'immunoterapia sublinguale (SLIT) e immunoterapia epicutaneous (EPIT), non ci sono attualmente senza strategie di trattamento approvato dalla FDA per desensibilizzazione individui allergici arachidi3,4,5,6,7,8. Di conseguenza, individui allergici devono rigorosamente evitare allergeni per evitare anafilassi. Molte domande rimangono riguardanti percorsi di sensibilizzazione e di base dei meccanismi di sviluppo di allergia alimentare.

Modelli murini sono uno strumento prezioso per lo studio dei meccanismi dell'allergia, nonché sviluppando nuove tollerogeniche e desensibilizzazione terapie9,10,11,12. Ciò è particolarmente vero perché l'allergene principale dell'arachide (Ara h 2; AH2) negli esseri umani è anche descritto l'allergene dominante in vari modelli del mouse13,14. Mentre i modelli murini dell'allergia dell'arachide sono preziosi per studiare i meccanismi della sensibilizzazione e della tolleranza, uno svantaggio è che può essere variabile e richiedono l'uso di adiuvanti. Immunogeni più potenti sarebbe un modo per ridurre al minimo la variabilità intrinseca di tali modelli. Dal momento che le cellule B sono fortemente attivate dagli antigeni multivalenti, liposomi antigenici visualizzati l'allergene sono una buona opzione a causa della loro capacità di attivare potenzialmente B-cellule attraverso il recettore delle cellule di B (BCR) mentre avendo anche la proprietà di efficiente adescamento il vano della T-cellula attraverso essere ripreso non specifico di antigene-presentare le cellule.

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per coniugazione degli antigeni della proteina alle nanoparticelle liposomiale usando una strategia facile e modulare. Utilizzando un surrogato antigene, frammento Fab anti-IgM, dimostriamo come potente questi liposomi antigenici possono essere stimolante l'attivazione della B-cellula. Liposomi antigenici visualizzazione Ah2 antigene sono stati utilizzati per sviluppare un nuovo modello murino di sensibilità ha conferito. In questo modello, splenocytes dai topi di allergici alle arachidi verificati, contenente arachidi specifica memoria B - e T-cellule, vengono trasferiti in topi Congenici ingenuo. Le risposte dell'anticorpo di memoria sono indotti tramite l'iniezione di liposomi coniugato con Ah2 nei topi destinatari, al fine di indurre anticorpi contro Ah2. Seguita da un solo impulso con Ah2 solubile, anticorpi specifici Ah2 danno luogo a una forte risposta anafilattica quando questi topi sono successivamente impugnati con Ah2. Come topi sottoposti la reazione allergica rispondono in modo molto uniforme e non hanno ricevuto un adiuvante, questo approccio è un modello auspicabile allergia dell'arachide e i risultati suggeriscono che essa può avere utilità in altri modelli del mouse guidati dagli antigeni diretti a allergeni e, eventualmente, autoantigeni.

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Protocollo

Il metodo generale di accoppiamento proteina a lipido ed incorporare nei liposomi si basa in gran parte il precedente lavoro15. Tutte le procedure degli animali descritte di seguito sono state approvate da University of North Carolina a Chapel Hill istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC). Tutti i topi utilizzati nel modello di allergia dell'arachide sono femmine BALB/cJ acquistate da 3 settimane di età. La cura degli animali Università di Alberta e utilizzare Comitato (ACUC) ha approvato gli esperimenti che prevedono l'uso di milze del mouse per analisi ex vivo dai topi C57Bl/6 di almeno 6 settimane di età.

1. coniugazione di antigene della proteina di PEGylated lipidica

  1. Aggiungere 3 g di perle gel reticolato destrano con una gamma di frazionamento di 1.500 – 30.000 Dalton (Da) in un pallone di vuoto 250 mL. Aggiungere 60 mL di tampone fosfato salino (PBS) e mescolare continuamente con un ancoretta magnetica. Tappare il matraccio e allegare ad un vuoto di avviare degassamento su una zolla di mescolare per un minimo di 1 h.
  2. In una colonna di cromatografia di vetro 1,0 x 30 cm con il fatturato tappo chiuso, è possibile aggiungere PBS alla colonna per lavare. Aprire il tappo di fatturato e la colonna di scarico. Dopo il lavaggio, aggiungere l'impasto di perle de-gasati per la colonna. Aggiungere continuamente l'impasto fino a quando la colonna viene compresso a un'altezza di perlina di circa 24 cm.
  3. Una volta che la colonna ha una 'testa' di circa 4 – 5 cm di PBS sopra le perline imballate, hanno i seguenti passaggi pronti.
    1. Creare un sifone di flusso di gravità misurando un pezzo di tubo abbastanza a lungo per raggiungere una mensola 1 – 2 piedi sopra la parte superiore della colonna e creare un ciclo che scende nella parte inferiore della colonna e restituisce alla parte superiore della colonna. Aggiungere un tappo di fatturato a un'estremità del tubo, lasciando un lato della tubazione aperta. Inserire l'estremità del tubo aperto una bottiglia di 500 mL di PBS e posto sulla mensola sopra la colonna.
    2. Prendere l'estremità con il tappo di fatturato e collegare una siringa da 10 mL. Aprire la valvola del tappo di fatturato sulla linea della tubazione e disegnare PBS attraverso il tubo. Una volta che il PBS ha raggiunto tre quarti della strada attraverso il tubo, rapidamente rimuovere la siringa e aggiungere il tappo di fatturato nella parte superiore della colonna — liquido deve essere in esecuzione sulla colonna.
      Nota: La quantità di 'testa' del PBS lasciato sulla parte superiore della colonna deve essere compresa tra 1 e 3 cm. L'importo minimo per lavare la colonna è 3 volumi di colonna.
  4. Determinare la quantità di proteina (talpe) da collegare al lipido basato sul suo peso molecolare (MW).
    Nota: Il frammento Fab di anti-topo di capra IgM (stesso un IgG) viene utilizzato qui come un antigene universale surrogato per stimolazione policlonale delle cellule B. Di conseguenza, il frammento Fab di IgG di capra ha un MW di circa 48 kiloDalton (kDa) ed è disponibile in commercio in una quantità totale di 1,3 mg. Così, la quantità di proteina per essere collegate è 27,1 µmol.
  5. Determinare il coefficiente di estinzione della proteina di interesse. Se sconosciuto, misurare l'assorbanza di proteina a 280 nm utilizzando un spettrofotometro e dividere il valore per il numero di moli280 calcolato al punto 1.4.
    Nota: L'estinzione co-efficiente di Fab di IgG di capra a 280 nm è 64.600 M-1.
  6. Per garantire tale traccia quantità di ammina-contenente tampone vengono rimossi, dissalare la proteina sulla colonna creata nei passaggi da 1.1 – 1.3 e raccogliere le frazioni proteiche in provette per microcentrifuga da 1,5 mL (~ 500 µ l per ogni frazione).
    1. Chiudere la valvola del tappo di fatturato collegata alla parte superiore della colonna e rimuovere la parte superiore della colonna. Se non già aperto, aprire la valvola del tappo di fatturato nella parte inferiore della colonna e aspettare fino a quando la 'testa' di PBS colpisce la parte superiore delle perline.
    2. Aggiungere lentamente nella proteina di interesse nella parte superiore delle perline usando un vetro pipetta Pasteur, facendo attenzione a ridurre al minimo la dispersione verso l'alto delle perle.
    3. Una volta che la 'testa' della soluzione della proteina ha raggiunto la cima dei branelli, aggiungere 1 mL di PBS delicatamente tramite una pipetta Pasteur. Ripetere tre volte. Aggiungere PBS per creare una testa di 4 – 5 cm e ripetere il passaggio 1.3 per lavare la colonna.
      Nota: Questo passaggio può essere ignorato se è certo che nessun buffer contenenti sia presente.
  7. Determinare le frazioni che contengono proteine misurando i valori A280 e piscina le frazioni che danno circa 90% di recupero della proteina.
    Nota: Questo in genere diluisce la proteina 1.5-2 volte. Determinare la concentrazione di proteina dopo pool. Concentrare la proteina in questa fase, se necessario, utilizzare un concentratore di centrifugazione.
  8. Aggiungere 2,5 molare equivalente del reticolante eterobifunzionali alla proteina.
    1. In primo luogo, pesano circa 5 mg di succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionato (SPDP, MW = 314 g/mol) in un tubo del microcentrifuge. Per determinare il volume di sciogliere il SPDP, prendere la concentrazione nella proteina molare e moltiplicarlo per 250 x per generare una soluzione di 100 x che vi darà un eccesso molare di 2,5 nella reazione.
      Nota: ad esempio, se la concentrazione nella proteina è 50 µM, di SPDP a 12,5 mM è necessaria una soluzione. Per 5 mg di SPDP, corrisponde all'1,27 mL di solfossido dimetilico (DMSO).
  9. Aggiungere SPDP alla proteina di interesse ad una diluizione di 1: 100. Posizionare la reazione su un agitatore oscillante a temperatura ambiente (TA) per circa 1 h.
  10. Per rimuovere l'eccesso SPDP e proteggere il legame disolfuro endogeno, nella proteina nella fase successiva riduzione, equilibrare e lavare la colonna creata passaggi 1.1 – 1.3 in 100 mM sodio acetato (NaOAc) a pH 5,5 o creare una colonna identica esclusivamente per l'uso in questo buffer.
  11. Dopo 1 h di incubazione con SPDP, dissalare la proteina sulla colonna equilibrata in 100 mM NaOAc. Eseguire questo passaggio in modo identico come passo 1.6 tranne usando 100 mM NaOAc (pH 5,5) come eluente. Raccogliere le frazioni, determinare A280e le frazioni superiore della piscina. Lavare la colonna in PBS.
  12. Preparare una soluzione di 2,5 M di DTT (MW = 154 g/mol) in doppia acqua distillata acqua (ddH2O). Aggiungere 25 mM DTT frazioni raccolte di proteine per 5-10 min.
  13. Misurare A280 della proteina e Dividi questo numero per il coefficiente di estinzione. Inoltre, determinare la A343. Calcolare il rapporto di collegamento basato sulla molarità di proteina (A280) e del linker (A343).
    Nota: Disattivare l'auto-calibrazione A340 se utilizzando uno spettrofotometro nanodrop. La misura di343 rappresenta l'assorbanza del gruppo 2-thione piridina (coefficiente di estinzione = 7550 M-1) che viene rimosso dal reticolante SPDP tramite il DTT. Un rapporto molare del linker: rapporto di proteine di 1,2 – 1,5 avviene in genere quando si esegue la reazione con un 2,5 eccesso molare di SDPD su una vasta gamma di proteine.
  14. Eseguire frazioni raccolte sopra la colonna lavata in PBS come descritto sopra. Raccogliere le frazioni, determinare A280e frazioni superiore della piscina. Determinare la concentrazione di proteina di A280 dopo le frazioni di pool.
  15. Preparare DSPE-PEG (2000)-Maleimide (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000)-Maleimide. Questo sarà aggiunto per la proteina con un rapporto molare 10:1. Preparare un brodo di 100 x di DSPE-PEG (2000)-Maleimide per ottenere la concentrazione desiderata.
    1. Ad esempio, se la concentrazione nella proteina è 10 µM dopo passo 1.14, preparare un brodo di DSPE-PEG (2000)-Maleimide a 10mm. Pesare con attenzione DSPE-PEG (2000)-Maleimide (MW = 3000 g/mol) e aggiungere la quantità appropriata di DMSO. Vari cicli di Vortex delicato e sonicating possono ottenerla completamente dissolto.
  16. Determinare il volume complessivo delle frazioni dal passaggio 1.14 e trasferire la soluzione con attenzione in un piccolo (10-25 mL) pallone da (RBF). Aggiungere la quantità appropriata di 100 x DSPE-PEG (2000)-Maleimide alla proteina di raggiungere un 1x, 10 volte concentrazione molare in eccesso, finale. Agitare delicatamente la soluzione per assicurarsi che il DMSO è completamente dispersa.
  17. Eseguire reazione durante la notte sotto azoto in un RBF sigillato. Utilizzare un setto di gomma e inserire in una cappa aspirante.
    1. Rimuovere l'atmosfera da puntura del setto con un ago di 20 G collegato ad una siringa da 3 mL alla fine del tubo collegato ad un vuoto e girare a vuoto per 3 – 5 s.
    2. Sostituire l'atmosfera con azoto. Riempire un palloncino attaccato ad una siringa da 3 mL tagliata a metà con azoto e inserire un ago di 20 G. Puntura del setto per riempire l'atmosfera all'interno il pallone a fondo tondo con azoto. Ripetere la rimozione dell'atmosfera e sostituzione con azoto una volta di più e lasciare il palloncino di azoto fissato durante la notte.
  18. Preparare una colonna di tallone gel separati del dextrano con collegamenti incrociati con una gamma di frazionamento di 4.000 – 150.000 Da in una colonna di cromatografia di vetro 1,0 x 50 cm (secondo i punti 1.1-1.3).
  19. Il giorno seguente, rimuovere la proteina dal pallone fondo tondo preparato nel passaggio 1.17 ed Esegui (seguire il metodo utilizzato nel passaggio 1.6) sopra la colonna di tallone gel reticolato destrano (dal punto 1.18).
    Nota: L'importo totale per caricare sulla colonna dovrebbe essere non più di 2 mL. Se è stata utilizzata una reazione più grande, diviso in due ed eseguire su colonne separate oppure eseguire su una colonna di diametro più grande.
    1. Raccogliere le frazioni, determinare la A280, frazioni superiore piscina e determinare la concentrazione di proteina. La presenza del lipido non influenzerà le misurazioni.
  20. Memorizzare le frazioni raccolte finale della proteina del lipido-collegata a 4 ° C fino a che pronto per l'uso.

2. preparazione dei liposomi

  1. Pesare i lipidi: DSPE-PEG(2000) (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000, MW = 2805.5 g/mol; Colesterolo (3b-idrossi-5-cholestene, 5-Cholesten-3b-olo), MW = 386.7 g/mol; e DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), MW = 790.1 g/mol crea una soluzione di 5 mg/mL di DSPC, 4 mg/mL soluzione di colesterolo e 2 mg/mL di soluzione di DSPE-PEG(2000) in cloroformio.
  2. Assicurare che il rapporto molare dei lipidi nei liposomi è: 57% DSPC, 38% colesterolo e 5% DSPE-PEG(2000), come rappresentato nella tabella 1.
    Nota: È importante controllare la quantità di antigene il liposoma, che generalmente varia da 0,01 – 0,1%. Nella tabella 1, 0,1% di anti-topo di capra frammento Fab di IgM legata al pegilato lipido è utilizzato. È fondamentale tenere conto del molare 10 volte in eccesso di DSPE-PEG (2000)-con che è stato aggiunto per la proteina nel passaggio 1.15, per garantire che la quantità totale di PEGylated lipidica non superi il 5%.
  3. Prendere in considerazione gli importi finali del lipido (µmol) durante la creazione di lipidi per estrusione. Vedere la tabella 1 per un esempio di calcolo delle concentrazioni molari del lipido per la creazione di liposomi ad una concentrazione di lipidi totale 1,25 µM.
  4. Una volta che è stata calcolata la quantità corretta di ogni lipido vengano sommati, combinare tutto in una provetta di vetro borosilicato 12 mL.
  5. Saltare attentamente il cloroformio.
    1. Utilizzare il tubo e una siringa da 3 mL con ago, preparato nel passaggio 1.17.1, saltare attentamente cloroformio nel tubo con azoto. Soffiare dolcemente un flusso di azoto sulla soluzione durante la rotazione il tubo con l'altra mano. Fare attenzione a ridurre al minimo gli spruzzi o causando il liquido eseguire modo fino al lato del tubo, come può essere più difficile ottenere questo in soluzione nel passaggio successivo.
  6. Aggiungere 100 µ l di DMSO in ogni provetta e lyophilize questa soluzione durante la notte. Coprire la parte superiore del tubo con un panno da laboratorio non statico, sicuro con un elastico e congelare a-80 ° C.

3. liposoma estrusione

  1. Aggiungere 1 mL di PBS contenente la proteina lipido-collegato al tubo 12 mL contenente i lipidi. Sottoporre ad ultrasuoni la soluzione per circa 30 s a 1 min in un bagno di acqua di sonicazione. Riposare per 5 minuti o più tra ogni turno e ripetere 3-4 volte.
  2. Preparare un estrusore come indicato dal produttore.
    1. Aggiungere i supporti del filtro per il supporto della membrana interna, posto poche gocce (da 10 µ l) di PBS sul film di paraffina. Con una pinzetta, afferrare un bordo del supporto filtro e immergerlo nella goccia 10 µ l.
    2. Posizionare il filtro all'interno l'o-ring. Eseguire questa operazione per entrambi i lati. Con una pinzetta, afferrare un filtro di 0,8 µm sul bordo e immergere nella goccia 10 µ l e cappotto esterno dell'o-ring con PBS. Inserire il filtro di 0,8 µm delicatamente l'o-ring così il filtro fa non sopra si blocchi il supporto della membrana interna.
  3. Posizionare il blocco di riscaldamento estrusore su una piastra calda per pre-riscaldare l'estrusore. Accendere la piastra bassa e consentire l'estrusore riscaldamento blocco raggiungere la temperatura desiderata. Per evitare potenziali problemi con l'aggregazione proteica, non riscaldare il blocco ultimi 37 ° C.
  4. Caricare il campione lisati mediante una delle siringhe d'espulsione collocate nell'estrusore. Posizionare la siringa estrusore in altra estremità dell'estrusore. Assicurarsi che lo stantuffo della siringa vuota è impostato su zero. La siringa vuota riempirà come il lipide viene estrusa attraverso la membrana di policarbonato 0,8 µm. Cercare di evitare il passaggio di bolle e indietro attraverso la membrana.
  5. Posizionare l'estrusore completamente assemblato nel blocco riscaldante. Spingere lentamente lo stantuffo della siringa riempita con i lipidi per la siringa vuota. A seconda della concentrazione di lipidi, questo sarà difficile da spingere attraverso. Ripetere 20 volte.
  6. Rimuovere l'estrusore completamente assemblato dal blocco riscaldante. Lentamente, rimuovere la siringa riempita dall'estrusore, essere sicuri di raccogliere eventuali lipidi che possono fuoriuscire durante la rimozione. Inserire i liposomi in una cuvetta pulita. Ripetere i passaggi da 3.4 – 3.6 utilizzando policarbonato 0,2 µm e 0,1 µm membrane.
  7. Creare una colonna di perlina di 0,7 x 50 cm2 agarosio reticolato con gamma di separazione di 0,7-10 Mega Dalton (MDa) equilibrato in PBS. Aggiungere i liposomi ed eseguire come descritto al punto 1.6. Le frazioni contenenti liposomi saranno diminuito trasmissione della luce nella gamma 250-400 nm.
  8. Memorizzare i liposomi a 4 ° C e non congelare.

4. calcio Flux per monitorare l'attivazione della B-cellula di liposomi antigenici

  1. Eutanasia topi da anidride carbonica (CO2) o sovradosaggio isoflurano, secondo procedure operative standard. Confermare l'eutanasia dei topi di dislocazione cervicale.
  2. Sterilizzare gli strumenti chirurgici e carcasse di topi utilizzando etanolo al 70%. Uso 10 cm di lunghezza, punta di 0,8 mm, curvo forcipe iris per separare la pelle che copre la cavità toracica dalla gabbia toracica. Utilizzare 10 cm lungo, dritto per dissezione Forbici per fare un'incisione distale con un'incisione bilaterale.
  3. Utilizzo di curve iris pinze e le forbici per dissezione per estrarre la milza dalla cavità addominale. Rimuovere il tessuto adiposo circostante della milza e poi metterlo in una provetta da 15 mL di conica polistirolo riempita con RPMI1640 Media contenente siero di vitello fetale 1% (FCS) e penicillina-streptomicina.
  4. Trasferimento della milza e media sopra un filtro di cella di 40 µm montato su un tubo conico da 50 mL. Utilizzando l'estremità di gomma di un pistone della siringa da 3 mL, schiacciare delicatamente la milza. Lavare il filtro cella 40 µm con i media. Ripetere questo processo fino a quando solo il tessuto grasso è lasciato nel colino cella µm 40. Sciacquare il setaccio con 3-5 mL di media per aumentare il recupero delle cellule.
  5. Centrifugare la cella omogeneato a 300 x g per 5 minuti a TA. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e aggiungere 10 mL di tampone di lisi RBC x 1 al pellet. Pipettare su e giù, lasciare per 2 – 3 min a RT e poi Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a TA.
  6. Eliminare il supernatante e risospendere il globulo rosso impoverito splenocytes in 10 mL di media. Determinare i numeri di cellulari totali utilizzando un emocitometro o altra cellula anomala. Agglomerare le cellule mediante centrifugazione, come descritto in precedenza.
    Nota: La concentrazione finale ideale necessaria per caricamento Indo-1 degli splenocytes è 10 – 20 x 106 cellule/mL, ma una concentrazione più bassa delle cellule può essere utilizzata.
  7. Risospendere splenocytes a 15 x 106 cellule/mL in flusso di calcio (RPMI1640 mezzo contenente 1% FCS, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES), 1 mM di cloruro di magnesio (MgCl2), 1 mM glicole etilenico-bis (buffer di caricamento Etere di β-amminoetil)-N, N, N', N'-tetraacetico acido (EGTA) e 5% penicillina-streptomicina). Aggiungere a 1,5 µM Indo-1 da una soluzione madre di DMSO 1mm, capovolgere la provetta diverse volte per mescolare. Proteggere dalla luce e incubare le cellule a bagnomaria a 37 ° C per 30 min.
  8. Dopo l'incubazione di 30 min, aggiungere a 5 volte l'ammontare del flusso di calcio tampone di caricamento. Centrifugare a 300 x g per 7 min a RT.
  9. Per gating sui linfociti B, macchia di cellule con CD5-PE, anti-topo di 1: 200 e 1: 200 di anti-topo B220-PE/Cy7 in 0,5 mL di tampone a 4 ° C per 20 min, al riparo dalla luce di caricamento.
  10. Lavare gli splenocytes in flusso di calcio caricamento buffer e centrifugare a 300 x g per 7 min a RT. Risospendere le cellule a 10 – 20 x 106 cellule/mL in tampone (Hank equilibrata soluzione salina (HBSS) contenente 1% FCS, 1 mM MgCl2 e 1 mM di corsa del flusso di calcio cloruro di calcio (CaCl2)). Conservare il ghiaccio, riparo dalla luce fino al momento di eseguire il citometro a flusso.
  11. Installazione citometria a flusso con controlli non macchiate e singola macchia per compensazione.
    1. Eseguire le cellule marcate per configurare le porte in modo appropriato (Vedi Figura 2A). Installazione di Indo-1 (viola) contro Indo-1 (blu) trama, regolare le tensioni nei canali Indo-1 per inserire le celle di macchiatura ad un pendio di 45 – 60 ° per massimizzare il segnale: rapporto di rumore della viola Indo-1: blu cambiamento nel rapporto dopo stimolazione B-cellula.
      Nota: Assicurarsi che le tensioni non sono troppo elevate, tale che una percentuale significativa delle cellule (> 5%) sono contro la parte superiore della trama.
    2. Creare un cancello diagonale che incapsula la parte di sinistra superiore (Violet+blu–) della trama, tale che senza stimolazione < 10% delle cellule sono nel cancello, che idealmente dovrebbe aumentare a > 75% dopo stimolazione.
  12. Aggiungere 0,5 mL di cellule a un con un massimo di 5 mL provetta polistirolo (fluorescenza-attivato cella ordinamento tubo (FACS)) e caldo le cellule a 37 ° C per 3 – 5 min in un bagno d'acqua. Posizionare il tubo di FACS nella camera principaleè di 37 ° C che è connesso a un bagno di acqua di ricircolo.
    1. Eseguire il tubo nella pluritubulare sul citofluorimetro e Avvia acquisizione, senza memorizzare i dati, a circa 5.000 – 10.000 eventi/s. Una volta che le cellule si sono stabilizzati (15 – 30 s), avviare dati di acquisizione e raccolta di dati per almeno 10 s per stabilire lo sfondo.
    2. Presso il marchio di s 10, rapidamente rimuovere la provetta dal citometro a flusso, aggiungere la stimolazione (liposomi antigenica 5-50 mM in 2-20 mL), impulso vortice e restituire tubo citofluorimetro FACS. Mantenere l'acquisizione dati e archiviazione attraverso questo tempo e raccogliere dati per 3 – 5 min.
  13. Analizzare i dati nel software di analisi appropriato sotto le funzioni di cinetica.

5. preparazione dell'estratto dell'arachide

  1. Estrarre proteine arachidi mescolando farina di arachidi in un rapporto di 1:5 (wt:vol) di tampone fosfato salino (PBS) con 1 M di cloruro di sodio (NaCl). Mescolare la soluzione sulla piastra magnetica per 2 h a temperatura ambiente mantenendo a pH 8,5.
  2. Soluzione di centrifuga a 3.000 x g per 45 min a 4 ° C. Decantare e filtro-sterilizzare surnatante in sequenza attraverso un filtro di 0,4 µm, seguito da un filtro da 0,2 µm. Determinare la concentrazione della proteina dall'analisi di (BCA) acido bicinconinico utilizzando albumina di siero bovino (BSA) come standard.
  3. Ridurre e denaturare un campione delle proteine dell'arachide con 50 mM dithiothreitol (DTT) in un tampone contenente litio solfato dodecilico a pH 8,4, che permette per attività massima del riducente e calore a 70 ° C per 10 min.
  4. Eseguire 10 µ g di proteina denaturata arachidi su un gel di poliacrilammide prefabbricati di 4 – 12% di Bis-Tris progettato per fornire una ottimale separazione gel di pendenza con peso molecolare pre-macchiato standard.
  5. Macchia il gel con disulfonated trifenilmetano e decolorare con ddH2O. Identify conosciuto maggiori allergeni dell'arachide Ara h 1, 2 e 3 nelle preparazioni di estratto. Ara h 1 appare al 63 kDa, Ara h 2 dovrebbe apparire come due isoforme alle 17 e 19 kDa e Ara h 3 appare al 37 kDa (subunità acida).

6. sensibilizzazione dei topi all'arachide

  1. Risospendere la tossina del colera 1 mg in 1 mL di acqua ultrapura. Preparare 200 µ l diluito Estratto dell'arachide che contiene 2 mg arachidi proteine e 10 µ g tossina del colera in PBS.
  2. Amministrare 200 µ l di Estratto dell'arachide contenente colera tossina (2 mg di proteina dell'arachide e 10 µ g di tossina colera) via orale mediante sonda gastrica per ogni topo femmina di 4 – 5 settimane vecchio BalB/cJ. Ripetere una volta a settimana per tre settimane (cioè, i giorni 0, 7 e 14).
  3. Amministrare 300 µ l diluito Estratto dell'arachide (contenente 5 mg di proteina dell'arachide e 10 µ g di tossina colera) via orale mediante sonda gastrica per ogni mouse nella quarta settimana (cioè, giorno 21).

7. sfida topi con Estratto dell'arachide

  1. Il giorno 28, preparare un estratto dell'arachide a una concentrazione finale di 1 mg/mL in PBS. Misurare la temperatura corporea basale con un termometro rettale (circa 37,5 e 38,5 ° C). Somministrare 200 µ l (200 µ g) di Estratto dell'arachide tramite iniezione intraperitoneale (i.p.).
  2. Misurare la temperatura corporea con il termometro rettale ogni 15 min per 1 h dopo l'iniezione. Un tuffo nella temperatura corporea indica allergia alle arachidi.
    Nota: L'ipotermia è un marchio di garanzia di anafilassi in topi. Questa sfida dimostrerà che i topi sono allergici alle arachidi. In genere, il 90% dei topi Balb/cJ che subiscono il protocollo di sensibilizzazione sviluppare reazioni allergiche durante sfida caratterizzata da almeno una diminuzione di temperatura di 2 – 3 ° C.

8. isolamento degli Splenocytes dai topi allergici e trasferimento adottivo

  1. Isolare il splenocytes dai topi allergici alle arachidi ed ingenuo.
    1. Il giorno 30, eutanasia sia ingenuo e topi allergici alle arachidi confermati attraverso la somministrazione di 3 L/min di CO2 in una camera a gas. Confermare l'eutanasia dei topi dal thoracotomy bilaterale. Sterilizzare gli strumenti chirurgici e la carcassa del mouse utilizzando etanolo al 70%. Utilizzare pinze per separare la pelle che copre la cavità toracica dalla gabbia toracica. Utilizzare forbici per dissezione rette per praticare un'incisione bilaterale rompere le costole di sinistra e destra.
    2. Utilizzare pinze e le forbici per dissezione per estrarre la milza dalla cavità addominale. Rimuovere il tessuto adiposo circostante milza prima di reinserirli nel tubo conico di polistirene da 15 mL, riempito con medie di 10 mL RPMI 1640.
    3. In una cappa a flusso laminare sterile, versare un polistirolo 35mm di Petri della milza e dei media. Tenere ingenuo e allergiche splenocytes separata di Petri e media durante l'isolamento delle cellule. Utilizzare sterilizzate pinze e le forbici per dissezione per tagliare la milza in tre pezzi e tornare alla capsula di Petri.
    4. Utilizzando il bordo grezzo, glassato di due vetrini, delicatamente omogeneizzare (in RPMI) i pezzi di milza finché non tessuto bianco rimane tra le diapositive. Modificare le diapositive tra gruppi.
    5. Trasferimento cellulare omogeneato da capsula di Petri attraverso un colino di cella µm 70 montato su un tubo conico da 50 mL. Passare i rimanenti frammenti di milza attraverso il filtro con uno stantuffo da una siringa da 1 mL. Sciacquare il setaccio con 5 mL di RPMI per massimizzare il recupero delle cellule. Trasferire filtrato un tubo conico di polistirene da 15 mL e centrifugare (450 x g, 10 min, RT).
    6. Aspirare il supernatante e aggiungere pellet e risospendere in tampone di lisi delle cellule di anima rosse 2 mL (0.83% di cloruro di ammonio in tampone Tris 10 mM, pH 7,2). Miscelare e incubare a temperatura ambiente per 2 – 3 min. aggiungere 10 mL di PBS - 2% di FBS e centrifugare a 300 x g per 7 minuti a TA.
    7. Lavare le cellule nuovamente con 12 mL di PBS - 2% FBS completamente rimuovere qualsiasi residuo cloruro di ammonio e centrifugare a 300 x g per 7 min a RT. Risospendere cella pellet in 2 mL di terreno RPMI 1640. Contare le celle utilizzando un analizzatore ematologico automatico o un emocitometro.
  2. Utilizzando un ago 5/8-pollice su una siringa da insulina 1 mL, da 27 G per via endovenosa iniettare 15 x 106 allergica o ingenuo splenocytes estratte come descritto sopra (in 200 µ l) tramite la coda della vena in topi ingenuo (unsensitized).

9. iniezione dei topi con Ara h 2 antigenica liposomi

  1. Preparare Ah2 liposomi contenenti 0,1% Ah2 presso lipidica di 2,5 mM. Per calcolare la concentrazione di proteine, il coefficiente di estinzione di Ah2 è 15.000 M-1. Diluire i liposomi a 300 µM in PBS sterile.
  2. Un giorno dopo il trasferimento adottivo (giorno 31) di allergica o ingenuo splenocytes, iniettare per via endovenosa 200 µ l di PBS o liposomi antigenici Ah2 (300 µM) contenente un totale di 1,38 µ g di Ah2 tramite vena caudale dei topi BALB/cJ che ha ricevuto gli splenocytes nel passaggio 8.2.

10. boost e sfida dei topi con Ara h 2

  1. Due settimane dopo l'iniezione con liposomi Ah2, giorno 45, usare una lancetta animale di 4 mm per raccogliere 50 – 200 µ l di sangue dallo svincolo sottomandibolare del mouse. Raccogliere il sangue in un tubo di separatore di siero senza eparina; separare il siero mediante centrifugazione a 6.000 x g per 15 min. usare il siero raccolto successivamente ai anticorpi antigene-specifiche di misura.
  2. Giorno 46, due settimane dopo l'iniezione di topi con liposomi (punto 9.2), Spinta topi da un'iniezione i.p. di 200 µ l di PBS o 200 µ g di Ah2 solubile (purificata come descritto in precedenza16).
  3. Il giorno 60, raccogliere 50-200 µ l di sangue dallo svincolo sottomandibolare del mouse e sangue di processo come descritto in precedenza.
  4. Giorno 61, sfidare ogni gruppo di topi con un'iniezione i.p. di 200 µ l di 300 µ g Ah2 solubile. Misurare le temperature corporee con sonda rettale ogni 15min come illustrato nella sezione 7.

11. quantificazione di Ara h 2-specific IgE e IgG1 da ELISA

  1. Rivestire un 96 pozzetti enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA)-piastra compatibile con 100 µ l HSA-DNP (2,4-dinitrophenyl aptene coniugato all'essere umano siero albumina, 20 µ g/mL) per la curva standard o Ah2 (5 µ g/mL) per campioni di siero raccolti nei passaggi 10.1 e 10.3, diluito in tampone di rivestimento (tampone carbonato-bicarbonato 50 mM, pH 9,6) a 4 ° C durante la notte o 37 ° C per > 1 h.
  2. Lavare tre volte con 200 µ l PBS-T (PBS con 0.05% Tween-20) e bloccare i pozzetti con 200 µ l PBS-T contenente 2% BSA a 37 ° C per > 2 h.
  3. Per ELISA: Ah2 specifico IgE, aggiungere 50 µ l IgE-anti-DNP norme (2 – 0,002 µ g/mL, preparato da diluizioni seriali 1:2) o i campioni di siero del mouse (01:20 diluizione) e incubare per una notte a 4 ° C. Per ELISA: Ah2 specifico IgG1, aggiungere 100 µ l purificato standard di IgG1-anti-DNP (2 – 0,002 µ g/mL, preparato da diluizioni seriali 1:2) o del mouse di campioni di siero (diluizione 1: 500) e incubare per una notte a 4 ° C o 1 h a 37 ° C.
  4. Lavare tre volte con 200 µ l di PBS-T. Per Ah2-specific IgE ELISA, aggiungere 100 µ l delle pecore del anti-Mouse IgE (0,5 µ g/mL) e incubare a 37 ° C per 1 h. Per ELISA: Ah2 specifico IgG1, aggiungere 100 µ l HRP capra anti-topo IgG1 (diluito 1: 40.000 in PBS-T - 2% BSA). Incubare a 37 ° C per 1 h.
  5. Lavare tre volte con 200 µ l di PBS-T. Per Ah2-specific IgE ELISA, aggiungere 100 µ l biotinylated-asino anti-pecore IgG (0,5 µ g/mL) e incubare a 37 ° C per 45 min. Per ELISA: Ah2 specifico IgG1, andare al passaggio 11,7.
  6. Lavare tre volte con 200 µ l di PBS-T. Per ELISA: Ah2 specifico IgE, aggiungere 100 µ l neutro addebitato avidina-perossidasi (ad es., NeutrAvidin-HRP, 0,3 µ g/mL) e incubare a 37 ° C per 30 min.
  7. Aggiungere 100 µ l 3, 3', 5, 5'-tetrametilbenzidina (TMB) substrato, incubare per 10-15 minuti o fino a quando i campioni girare blu scuro, quindi aggiungere 100 µ l TMB stop soluzione. Leggere la piastra a 450 nm.

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Risultati

Coniugazione della proteina di interesse con DSPE-PEG(2000) può essere dimostrato mediante l'esecuzione di un riducente con un incremento di peso molecolare rispetto alla proteina non coniugata. Figura 1A Mostra un gel rappresentativo di coniugazione di frammento F(ab) di IgM anti-topo a PEG-DSPE, che mostra un bandshift di kDa di 2 – 3 per la proteina denaturata. Notare che circa il 50% della proteina sembra essere modificato, che è atteso dato che stechiome...

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Discussione

I metodi descritti qui sono un protocollo generale per la coniugazione di una proteina di un lipide che consente la visualizzazione della proteina sulle nanoparticelle liposomiale. Per le proteine multi-unità secondaria molto grande, questo protocollo potrebbe aver limitato l'utilità. Il metodo ideale sarebbe l'introduzione di un tag site-specific che consente una strategia di collegamento chimico biortogonali essere utilizzato. Se esprimenti la proteina recombinantly, questo può essere possibile utilizzando strategie si...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni dal dipartimento della difesa (W81XWH-16-1-0302 e W81XWH-16-1-0303).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Collettore di frazioni modello 2110BioRad7318122
CholestrolSigmaC8667grado Sigma 99%
SPDPThermo Fisher Scientific21857
DSPCAvanti850365
DSPE-PEG 18:0Avanti880120
DSPE-PEG MaleimideAvanti880126
ExtruderAvanti610000siringa da 1 mL con supporto/blocco riscaldante
Filtri 0,1 & micro; mFiltri Avanti610005
0,8 &; mAvanti610009
10 mm Supporti FiltroAvanti6100014
Flacone Fondo Tondo in VetroSigmaZ100633
Tappi RibaltabileThermo Fisher ScientificP-301398
TuboThermo Fisher ScientificP-198194
Leur LockThermo Fisher Scientifick4201634503
Perline Sephadex G50 GELife Sciences17004201
Perline Sephadex G100GE Life Sciences17006001
Siero Fetale di Vitello Inattivato al CaloreThermo Fisher Scientific10082147
HEPES (1 M)Thermo Fisher Scientific15630080
EGTASigmaE3889
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
1x tampone per lisi dei globuli rossiThermo Fisher Scientific00-4333-57
Indo-1InvitrogenI1203
CD5-PEBioLegend100608
B220-PE-Cy7BioLegend103222
HBSSThermo Fisher Scientific14170112senza calcio e magnesio
MgCl2SigmaM8266
CaCl2SigmaC4901
Fab anti-topo IgMJackson ImmunoResearch115-007-020
F(ab')2 anti-topo IgMJackson ImmunoResearch115-006-020
Farina di arachidiGolden Peanut Co.52127112% di grassi arrosto chiaro, 50% di proteine
Aghi per l'alimentazione animaleCadence Science792022g x 1,5", 1,25 mm - dritto
Termometro a microsondaPhysitempBAT-12
Sonda rettale per topiPhysitempRet-3
Tossina del colera, da Vibrio choleraList Biological Laboratories, Inc.prive di azide100B
Pierce23225
Tampone carbonato-bicarbonatoSigmaC3041
TMB Stop SolutionKPL50-85-06
SureBlue TMB Microwell Perossidasi SubstratoKPL5120-0077
96 pozzetti Piastra Immulon 4HBXThermo Scientific3855
Ara h 2N/AN/Apurificato come in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology
HSA-DNPSigmaA-6661
IgE di topo anti-DNP IgEchimico accuratoBYA60251
IgE anti-topoIl sito di legamePC284
IgG anti-pecora biotinilato d'asinochimico accurato
NeutrAvidin protein, HRPThermoFisher Scientific31001
IgG1 di topo anti-DNPAccuratochimico MADNP105
HRP di capra anti-topo IgG1Southern Biotech1070-05
1 mL Siringhe da insulinaBD329412U-100, 0,40 mm (27 G) x 16,0 mm (5/8")
Vetrini per microscopio SuperfrostFisher Scientific12-550-1425 mm x 75 mm x 1,0 mm
ACK Lysing Buffergibco di Life TechnologiesA10492-01100 mL
RPMI 1640Medium Thermo Fisher Scientific 11875093500 mL
Filtro cellulareCorning35235070 μ m Nylon, bianco, sterile, confezionato singolarmente
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein GelsInvitrogenNP0322BOX10 gel NuPAGE
LDS tampone, 4xInvitrogenNP0008250 mL
SeeBlue Plus2 Standard precoloratoInvitrogenLC5925500 &; L
NuPAGE MES/SDS tampone di corsa, 20xInvitrogenNP0002500 mL
GelCode Blue StainThermo Scientific24590500 mL
Kit per il dosaggio delle proteine BCA solubile JNS065003

Riferimenti

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