Analisi della sintesi proteica dell'epididimo e secrezione

Wei Zhou; Petra Sipilä; Geoffry N. De Iuliis; Matthew D. Dun; Brett Nixon

doi:10.3791/58308

È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Analisi della sintesi proteica dell'epididimo e secrezione

8.9K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/58308

⸱

25 agosto 2018

Wei Zhou¹^,² , Petra Sipilä³ , Geoffry N. De Iuliis¹^,² , Matthew D. Dun²^,⁴ , Brett Nixon¹^,²

¹Priority Research Centre for Reproductive Science, School of Environmental and Life Sciences, University of Newcastle, ²Hunter Medical Research Institute, ³Department of Physiology, Turku Center for Disease Modeling, Institute of Biomedicine, University of Turku, ⁴School of Biomedical Sciences and Pharmacy, Faculty of Health and Medicine, University of Newcastle

In questo articolo

Sommario

Qui, segnaliamo la localizzazione di immunofluorescenza della dinamina per illustrare i protocolli per il rilevamento delle proteine nelle sezioni dell'epididimo paraffina-incastonato del mouse e quelli di una linea di cellulari immortalizzate epididimaria (mECap18). Inoltre descriviamo i protocolli per l'isolamento delle proteine secretorie da sia fluido epididimario e media condizionato delle cellule.

Abstract

L'epididimo mammiferi genera uno dei fluidi intraluminale più complessi di qualsiasi ghiandola endocrina al fine di sostenere la maturazione post-testicolare e la conservazione degli spermatozoi. Tale complessità presenta dovuto l'attività secretiva e assorbente combinata delle cellule epiteliali di rivestimento. Qui, descriviamo le tecniche per l'analisi della sintesi proteica dell'epididimo e secrezione focalizzando l'attenzione sulla famiglia delle proteine modello della dinamina (DNM) mechanoenzymes; GTPasi grandi che hanno il potenziale per regolare gli eventi traffico di membrana bi-direzionale. Per lo studio dell'espressione proteica in tessuto epididimario, descriviamo solida metodologia per l'etichettatura di immunofluorescenza di proteine bersaglio nelle sezioni di paraffina e la successiva rilevazione della distribuzione spaziale di queste proteine tramite microscopia di immunofluorescenza. Inoltre descriviamo la metodologia ottimizzata per l'isolamento e la caratterizzazione di esosomi come vescicole, noto come epididymosomes, che sono secreti nel lume dell'epididimo di partecipare a comunicazione intercellulare con la maturazione delle cellule dello sperma. Come un approccio complementare, descriviamo anche la rilevazione di immunofluorescenza delle proteine bersaglio in una linea cellulare di SV40-immortalato mouse caput epididimario epiteliali (mECap18). Inoltre discutiamo l'utilità della linea cellulare mECap18 come un modello adatto in vitro con cui esplorare il regolamento di attività secretiva dell'epididimo. Per questo scopo, si descrivono i requisiti coltura per il mantenimento della linea cellulare mECap18 e l'uso di regimi di inibizione farmacologica selettiva che sono in grado di influenzare il loro profilo di proteine secretorie. Questi ultimi sono prontamente valutati tramite raccolta del medium condizionato di cultura, la concentrazione di proteine secrete tramite precipitazione di acido tricloroacetico/acetone e la loro successiva analisi tramite SDS-PAGE e immunoblotting. Sosteniamo che questi metodi combinati sono adatti per l'analisi dei bersagli proteici epididimaria alternativo come un preludio alla determinazione del loro ruolo funzionale in maturazione degli spermatozoi e/o deposito.

Introduzione

Gli spermatozoi di tutte le specie di mammiferi acquisiscono il potenziale per visualizzare avanti motilità progressiva e di fecondare un ovulo durante la loro discesa prolungata attraverso l'epididimo, una regione altamente specializzata del sistema del maschio condotto extra-testicolari, che possono prendere 7-14 giorni per navigare (a seconda della specie)¹. A causa della estrema condensazione della cromatina paterna e lo spargimento della maggior parte del citoplasma che accompagna il cytodifferentiation degli spermatozoi all'interno dei testicoli, la loro successiva maturazione funzionale è guidato esclusivamente dalla loro interazione con....