Un flusso di lavoro utilizzando una centrifuga di flusso cytometry o differenziale è stato sviluppato per individuare, quantificare e isolare i corpi apoptotici da un campione di apoptotic di elevata purezza.
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Articolo metodologico
Rilevamento e isolamento di corpi apoptotici di elevata purezza
In questo articolo
Sommario
Abstract
I membri principali della famiglia delle vescicole extracellulari, con ApoBDs essendo uno del più grande tipo di corpi apoptotici (ApoBDs), microvescicole ed esosomi. È stato proposto che ApoBDs può aiutare la liquidazione delle cellule, come pure la comunicazione intercellulare attraverso traffico biomolecole. Gli approcci convenzionali utilizzati per l'identificazione e l'isolamento di ApoBDs sono spesso limitati dalla mancanza di quantificazione accurata e purezza basso del campione. Qui, descriviamo un flusso di lavoro per confermare l'induzione di apoptosi, convalidare ApoBD formazione e isolare ApoBDs di elevata purezza. Inoltre, contorni e confrontare approcci di centrifugazione differenziale basato per isolare ApoBDs e fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS). Inoltre, la purezza del ApoBDs isolato verrà confermata utilizzando un stabilire in precedenza flusso cytometry-based colorazione e metodo analitico. Presi insieme, utilizzando l'approccio descritto, THP-1 del monocito apoptosi e apoptotica delle cellule lo smontaggio è stato indotto e validato, e ApoBD generati dai monociti THP-1 sono stati isolati per una purezza del 97-99%.
Introduzione
Apoptosi, una forma ben studiata di morte cellulare programmata, sono necessaria per mantenere l'omeostasi fisiologica e rimuovere le cellule potenzialmente dannose all'interno del corpo umano1. Dopo l'induzione dell'apoptosi, cellule apoptotiche (ApoCells) possono subire una serie di cambiamenti morfologici e smontare in piccole vescicole di membrana-limita, chiamate ApoBDs. Nel complesso, questo processo è noto come smontaggio delle cellule apoptotiche e può essere diviso in 3 fasi distinte sulla base di morfologia2,3. Passaggio 1 (membrana plasmatica blebbing) è caratterizzata dalla ....
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Protocollo
1. induzione di apoptosi
- Centrifugare il campione di cellule a 300 x g per 5 min ed eliminare il surnatante per rimuovere eventuali detriti cellulari pre-esistenti.
Nota: Quando si utilizza cellule aderenti, cellule del seme in anticipo e lavare con soluzione tampone fosfato (PBS) prima di induzione di apoptosi: 1x. - Determinare il numero di cell e raccogliere le cellule.
Nota: A seconda post-dell'isolamento di test, si consiglia un numero di cellulare iniziale di almeno 1 x 107 cellule. - Risospendere in completa per i media (mezzo rispettivo contenente siero fetale di vitello di 10% (vol/vol), 50 UI/mL penicillina, 50 µ g/....
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Risultati
Utilizzando la procedura descritta qui, è stato indotto apoptosi monociti THP-1 e ApoBDs sono stati rilevati e isolato tramite un FACS-based o un approccio di centrifugazione differenziale (Figura 1). In primo luogo, l'apoptosi è stata indotta da irradiazione UV e campioni sono stati raccolti dopo 2-3 h di incubazione, quando le cellule hanno esibito apoptotica morfologie, compreso blebbing, formazione di protrusione della membrana apoptotici e la generazione.......
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Discussione
Dalla sua descrizione iniziale nel 1950, il campo dell'apoptosi ha avanzato notevolmente, diventando una zona prominenti di ricerca. Nonostante il vasto interesse e gli sforzi profusi, alcuni aspetti dell'apoptosi, in particolare la formazione di ApoBDs, non sono stati studiati bene a causa della mancanza di adeguate metodologie. Queste comprendono in particolare la limitazione in progressione di apoptosi e ApoBD formazione contemporaneamente usando la citometria a flusso tradizionale analisi A5/PI e le impurità di isola.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo ha funzionato è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Health e il Medical Research Council (GNT1125033 e GNT1140187) e Australian Research Council (DP170103790) a I.K.H.P.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cellule, ad es. monociti THP-1 umani in coltura (numero di clone: TIB-202) | ATCC-RPMI | ||
| 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Miscela penicillina-streptomicina | Life Technologies | 15140122 | |
| FSC | Gibco | 10099-141 | |
| 1x PBS | - | - | |
| Annexin V FITC | BD | ||
| ioduro | Technologies | T3605 | TO-PRO-3 può causare irritazione della pelle, degli occhi e delle vie respiratorie. Evitare il contatto diretto. |
| 10x tampone legante l'annessina V | BD Bioscience | 556454 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1001710526 | |
| Provetta per centrifuga (15 mL) | Cellstar | 188271 | |
| Provetta per microcentrifuga (1,5 mL) | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Incubatore per colture tissutali (37 ° C, 5% CO2) | - | - | |
| Centrifuga | Beckman Coulter | 392932 | |
| FACS ARIA III Citometro a flusso, configurato con due laser per il rilevamento FITC e APC | BD Bioscience-FACS | ||
| Canto II Citometro a flusso, configurato con due laser per il rilevamento FITC e APC | BD Bioscience-FACS | ||
| Diva 6.1.1 software | BD Bioscience | - | |
| FlowJo 8.8.6 software | - | - | |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | - |
Riferimenti
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews. Immunology. 14, 166-180 (2014).
- Atkin-Smith, G. K., Poon, I. K. Disassembly of the Dying: Mechanisms and Functions. Trends....
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Ristampe e permessi
