Questo protocollo descrive l'impianto di una finestra di vetro sul midollo spinale del mouse per facilitare la visualizzazione mediante microscopia intravitale.
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Articolo metodologico
Laminectomia e impianto della finestra del cavo spinale nel mouse
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo protocollo descrive un metodo per la laminectomia del midollo spinale e impianto della finestra di vetro per l'imaging in vivo del midollo spinale del topo. Un vaporizzatore digitale integrato viene utilizzato per ottenere un piano stabile di anestesia a bassa portata di isoflurane. Una singola colonna vertebrale viene rimossa e un vetro di copertura disponibile in commercio viene sovrapposto a un sottile letto di agarose. Una piastra posteriore in plastica stampata in 3D viene quindi apposta sulle spine vertebrali adiacenti utilizzando adesivo tissutale e cemento dentale. Una piattaforma di stabilizzazione viene utilizzata per ridurre l'artefatto di movimento dalla respirazione e dal battito cardiaco. Questo metodo rapido e senza morsetti è adatto per la microscopia acuta multi-fotone a fluorescenza. I dati rappresentativi sono inclusi per un'applicazione di questa tecnica alla microscopia a due fotoni della vascolatura del midollo spinale in topi transgenici che esprimono eGFP:Claudin-5 - una proteina di giunzione stretta.
Introduzione
I modelli animali transgenici che esprimono proteine fluorescenti, se combinati con la microscopia intravitale, forniscono una potente piattaforma per affrontare la biologia e la fisiopatologia. Per applicare queste tecniche al midollo spinale, sono necessari protocolli specializzati per preparare il midollo spinale per l'imaging. Una di queste strategie è quella di condurre un impianto della laminectomia e del midollo spinale. Le caratteristiche principali di un protocollo ideale di microscopia includono la conservazione della struttura e della funzione del tessuto nativo, la stabilità del campo di imaging, il tempo di elaborazione rapido e la riproducibilità dei risultati. Una sfida particolare consiste nello stabilizzare il campo di imaging contro il movimento indotto dalla respirazione e dal battito cardiaco. Sono state riportate diverse strategie ex vivo e in vivo per raggiungere questi obiettivi1,2,3,4,5. La maggior parte dei metodi in vivo prevede il bloccaggio dei lati della colonna vertebrale2,4 ed è spesso seguito dall'impianto di un apparato metallico rigido3,4 per la stabilità durante l'intervento chirurgico e applicazioni di imaging a valle. Bloccare la colonna vertebrale può potenzialmente compromettere il flusso sanguigno e indurre il rimodellamento della proteina emato-encefalica (BBB).
Lo scopo di questo metodo è quello di rendere il midollo spinale intatto disponibile per l'imaging ottico nel topo vivente riducendo al minimo l'invasività del protocollo e migliorando i risultati. Descriviamo una singola procedura di impianto di laminectomia e vetro coperto abbinata a una piastra posteriore stampata in plastica ovale minimamente invasiva che raggiunge ancora una robusta stabilità meccanica. La piastra posteriore è direttamente aderisceto alle spine vertebrali anteriori e posteriori con cemento dentale. La piastra posteriore è dotata di bracci di estensione laterali con fori a vite che si attaccano rigidamente allo stadio del microscopio tramite un braccio metallico. Questo ancora efficacemente la vertebra anteriore e posteriore intatta allo stadio del microscopio, fornendo resistenza meccanica al manufatto di movimento che altrimenti sarebbe introdotto dalla respirazione e dal battito cardiaco. Il metodo è stato ottimizzato per la laminectomia di una singola vertebra al livello toracico 12, omettendo i morsetti utilizzati in strategie alternative per la stabilità durante l'imaging in vivo. La procedura è rapida, prendendo circa 30 min per mouse.
Questo protocollo può essere utilizzato per studiare i meccanismi della malattia della BBB. Il BBB è un sistema microvascolare dinamico composto da cellule endoteliali, muscoli lisci vascolari, periciti e processi del piede astrocito che forniscono un ambiente altamente selettivo per il sistema nervoso centrale (SNC). I dati rappresentativi descrivono l'applicazione di questo protocollo in topi transgenici progettati per esprimere proteine fluorescenti verdi potenziate (eGFP):Claudin-5, una proteina di giunzione stretta BBB. I file di stampa backplate forniti possono anche essere personalizzati per applicazioni alternative.
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Protocollo
Tutti gli esperimenti seguono i protocolli dell'Università dell'Illinois, del Chicago Institutional Animal Care e del Comitato d'uso. Questa è una procedura terminale.
1. Preparazione del reagente
- Preparare il fluido spinale cerebrale artificiale (aCSF) per contenere 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Glucosio, 10 m HEPES, 2 mM MgCl2, 6H2O, 2 mM CaCl22H2H in ddH2O. Filtro Sterile e congelamento in singoli usi. Riscaldare aCSF a bagnomaria a 39 gradi centigradi prima dell'uso.
- Caldo basso punto di fusione agarose (2%) in aCSF fino a completa dissoluzione in un bagno d'acqua impostato a 65 gradi centigradi. Durante la laminectomia, raffreddare l'agarose siè a 39 gradi centigradi in un bagno d'acqua, in modo che possa essere pronto vicino alla temperatura fisiologica per il passaggio 5.2.
Nota: La soluzione agarose può essere immagazzinata a -20 gradi centigradi in aliquote monouso. - Preparare il carprofene sterile 50 mg/mL in acqua batteristatica. Conservare a 4 gradi centigradi.
- Pulire i copricopre con il 70% di etanolo, tre lavamenti di ddH2O e conservarli a secco in un contenitore privo di polvere.
2. Stampa 3D backplate
- Utilizzare il software CAD 3D per creare un modello per le dimensioni illustrate nella Figura 1. L'interno è un'ellisse più larga sulla superficie inferiore rispetto alla stampante e tagliata con un taglio loft a un'ellisse più piccola che forma un lume sulla superficie opposta. Due bracci sporchi con fori per accettare viti si estendono lateralmente, per l'attaccamento alla forcella di fissaggio posteriore. Da questa struttura 3D, creare un file mesh 3D triangolato (. STL).
Nota: Vedere le figure 1Be file supplementari 1 e 2. - Caricare il file mesh 3D triangolato su una stampante 3D.
- Stampare le backplate utilizzando un ugello hot-end da 0,4 mm e un'altezza dello strato di 0,2 mm. Selezionare la temperatura dell'ugello di 205 gradi centigradi, la temperatura del letto di 45 gradi centigradi e la velocità di stampa di 45 mm/s.
- Valutare visivamente le backplates stampate in 3D risultanti per verificarne l'integrità strutturale(Figura 1E); il cedimento strutturale lordo (lumen assente, parete collassata) indica difetti di stampa (Figura 1F).
3. Preparazione chirurgica
- Preriscaldare la piastra di riscaldamento.
- Caricare l'isoflurane nella siringa di consegna mentre si lavora in una cappa di fumi chimici. Collegare la siringa di consegna all'unità isoflurane.
- Selezionare un mouse vecchio di 8 mesie201212-settimana. Pesare l'animale. Indurre l'anestesia utilizzando 2% isoflurane in una camera di induzione. Iniettare il carprofena a 5 mg/kg sottocutaneo.
- Posizionare il naso-cono e fornire isoflurane al 2% con una portata di 150 mL/min per la manutenzione diun piano chirurgico di anestesia (Figura 2A. Avvolgere il pad di riscaldamento con un cuscinetto assorbente usa e getta per facilità di pulizia.
- Posizionare un animale sul pad di riscaldamento alla stazione chirurgica e installare il cono naso. Lubrificare il termometro con gelatina di petrolio e inserirlo 5 mm nel retto. Nastro la sonda termometro alla coda per la stabilità. Applicare unguento oftalmico agli occhi del mouse.
- Per mantenere l'idratazione, applicare 200 gradi della soluzione della suoneria latata mediante iniezione sottocutanea ogni 30 min fino alla fine dell'esperimento.
- Spruzzare il dorsum con il 70% di etanolo, rimuovere la pelliccia con i clipper e pulire il sito con povidone-iodio.
4. Laminectomia
- Posizionare l'animale tra le barre dell'orecchio; questi mantengono la posizione della testa del mouse rispetto al naso-cone.
- Verificare che l'animale sia profondamente anetizzato come valutato dalla mancanza di riflesso pizzico interdigitale e di un modello respiratorio costante.
- Fare un'incisione rostral-caudale di 1,5 cm alla linea mediana sopra la regione lombare toracica/superiore inferiore utilizzando #11 lama (Figura 2). Separare la pelle afferrandola con pinze tallarate smussate e/o dita guantate. Utilizzare pinze per separare e staccare tutto il tessuto connettivo trasparente rimanente sotto la pelle. La muscolatura superficiale dovrebbe ora essere esposta; spostare questo con una lancia chirurgica schiuma.
- Utilizzare schiuma lance chirurgiche (o una curette) per cancellare la restante, muscolatura più profonda della vertebra bersaglio (toracico 12). Per creare un sedile per la piastra posteriore, anche cancellare il muscolo dall'aspetto posteriore del toracico 11, e l'aspetto anteriore del torace 13. Controllare qualsiasi sanguinamento applicando una leggera pressione con una lancia chirurgica o utilizzare un impulso minimo con una pistola cautaria. Continuare a rimuovere il muscolo rimanente lontano dai tendini
- Una volta rimossi i muscoli, staccate attentamente i tendini tagliando con le pinze. Ci dovrebbe essere un sacco di spazio per visualizzare e manipolare il cavo quando questo passaggio è completo. Controllare che la materia dura dello spazio intervertebrale, l'osso laminare semitrasparente, il vaso sanguigno superficiale centrale sotto l'osso e l'arteria radiante anteriore siano ora chiaramente visibili.
- Umide la regione con aCSF calda. Utilizzare il microdrill per assottigliare ripetutamente l'osso laminare con tratti rettilinei paralleli all'asse lungo del midollo spinale (Figura 2, Figura 3). Se lo si desidera, utilizzare una fase di scorrimento per ruotare la piattaforma chirurgica per un maggiore comfort ergonomico (ad esempio, un operatore destrorso può ruotare la piattaforma chirurgica in senso antiorario per la fase di perforazione).
Nota: La fase di planata utilizzata è costituita da una piastra di alluminio superiore che scorre 15 mm rispetto alla piastra di base fissa. - Afferrare delicatamente il processo spinoso superficiale con pinze e sollevare la vertebra; l'osso dovrebbe sollevarsi facilmente. Se c'è resistenza, ripetere il diradamento osseo con il trapano e, se necessario, utilizzare le forbici da bagno, facendo attenzione a puntare le punte delle forbici verso l'alto per evitare di danneggiare il tessuto.
Nota: Al fine di mantenere la dura intatta, è essenziale non tirare l'osso. - Utilizzare #4 pinze per eliminare eventuali frammenti ossei. Utilizzare una lancia chirurgica per applicare una leggera pressione costante per controllare qualsiasi sanguinamento. Risciacquare il tessuto con aCSF caldo. Non lasciare che il tessuto si asciughi.
5. Impianto in vetro coperto
- Applicare delicatamente un vetro di copertura borosilicato da 3 mm sul cavo esposto.
- Assicurarsi che l'agarose sia raffreddato a 39 gradi centigradi. Utilizzando una piccola spatola, applicare caldo 2% agarose / aCSF al bordo del vetro di copertura e consentire l'azione capillare per disegnarlo sotto la superficie.
Nota: A temperature inferiori a 39 gradi centigradi, l'agarose può iniziare a gelare. In questo caso, riscaldarsi utilizzando un bagno d'acqua o un forno a microonde. Alcuni operatori preferiscono applicare prima una goccia di agarose e posare la copertura-vetro sulla parte superiore. - Applicare l'adesivo tissutale ai processi articolari ossei esposti della vertebra adiacente intatta al livello toracico 11 vertebrale vertebrale e al livello toracico 13 della colonna vertebrale. Applicare adesivo tissutale aggiuntivo in un anello intorno al sito della laminectomia, sopra il tendine adiacente e il processo trasversale.
Nota: l'adesivo del tessuto è necessario per una corretta aderenza del cemento dentale nelle fasi successive. I processi articolari formano un sedile naturale su cui la piastra posteriore può poggiare stabilmente (Figura 3). L'adesione ai processi articolari formerà i punti più forti di attaccamento. - Mescolare il cemento dentale con l'accelerante in un vassoio di miscelazione in porcellana. Utilizzare una piccola spatola per trasferire il cemento dentale sullo strato adesivo dei tessuti. Utilizzare cemento dentale per aderire la piastra posteriore al campo chirurgico, centrato sopra la finestra. Lasciare curare 10 minuti affinché il cemento dentale guarisca.
Nota: L'aderesi saldamente della piastra posteriore ai processi articolari anteriori e posteriori fornisce la stabilità strutturale fondamentale dell'impianto. - Utilizzare ulteriore cemento dentale per riempire la base interna della piastra posteriore, e la parte inferiore della piastra posteriore : interfaccia del tessuto.
Nota: L'applicazione supplementare del cemento dentale migliora l'aderenza e riduce il rischio di perdita di liquido di immersione obiettivo al microscopio (saline) dal fondo della piastra posteriore. - Far avanzare il supporto della piastra posteriore con forcella nella posizione appropriata sopra la finestra. Fissare la piastra posteriore nel supporto backplate con viti.
Nota: Questo protocollo utilizzava un supporto per la piastra posteriore su misura (Figura 2G-u2012H). - Applicare la salina sulla piastra posteriore per verificare la perdita. In caso di perdite di liquido, asciugare l'area e applicare più cemento dentale.
6. Preparazione dell'imaging
- Trasferire l'animale sulla piattaforma chirurgica al tavolo ottico.
Nota: La nostra piattaforma chirurgica, il supporto backplate e il supporto del cono naso isoflurano possono essere trasportati tra le stazioni di imaging chirurgiche e a due fotoni come un'unità, applicando l'anestesia isoflurane continua (Figura 2D,H). Unità simili possono essere assemblate da forcelle, travi e montani di supporto ottenibili da fonti commerciali(ad esempio. ThorLabs). Per la microscopia intravitale, ci dovrebbero essere almeno 11 pollici di spazio tra l'obiettivo del microscopio e la tabella ottica per ospitare l'altezza della piattaforma chirurgica. - Apporre la piattaforma chirurgica al tavolo ottico utilizzando un montante in acciaio inossidabile e la forcella di bloccaggio controanno.
- Applicare la salina fresca nel pozzo della piastra posteriore. Abbassare una lente per l'immersione dell'acqua nel pozzo.
- Utilizzare la luce trasmessa o l'epifluorescenza per identificare l'area di interesse e messa a fuoco. Passare alla modalità di scansione laser ed eseguire l'imaging in vivo secondo l'appropriata lunghezza d'onda di eccitazione laser a due fotoni, dicrochi e filtri bandpass per i fluorofori presenti nel tessuto6.
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Risultati
Le vetrate impiantate e la microscopia a due fotoni intravitale forniscono uno strumento utile per valutare i cambiamenti dinamici nelle proteine del SNC. L'integrità funzionale della BBB è influenzata dall'espressione, dalla localizzazione subcellulare e dai tassi di turnover delle proteine di giunzione strette7. Studi precedenti hanno dimostrato che le proteine di giunzione strette subiscono un rimodellamento rapido e dinamico a stato costante8<...
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Discussione
Il metodo qui descritto consente l'imaging stabile del midollo spinale nei topi attraverso una finestra di vetro. Questo metodo è stato applicato per valutare il rimodellamento BBB in topi transgenici eGFP:Claudin5/- che esprimono una proteina di giunzione bBB fluorescente, ma potrebbe essere applicato altrettanto bene per gli studi su eventuali proteine fluorescenti o cellule nel midollo spinale.
Sono stati sviluppati diversi metodi per laminectomia e stabilizzazione del midollo spinale. Tutt...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
S.E. Lutz è supportato dal National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, sotto Grant KL2TR002002 e dai fondi di start-up dell'Università dell'Illinois Chicago College of Medicine. Simon Alford è supportato da RO1 MH084874. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali della NIH. Gli autori ringraziano Dritan Agalliu nel Dipartimento di Neurologia del Columbia University Medical Center per i topi Tg eGFP:Claudin-5, discussioni scientifiche e approfondimenti sullo sviluppo del protocollo chirurgico e delle applicazioni di imaging. Gli autori ringraziano Sunil P. Gandhi del Dipartimento di Neurobiologia e Comportamento dell'Università della California, Irvine per aver progettato il primo prototipo dell'apparato stereotassico e del controllore della temperatura animale, la discussione del protocollo chirurgico e formazione in microscopia a due fotoni. Gli autori ringraziano anche Steve Pickens (W. Nuhsbaum, Inc.) per l'assistenza nella personalizzazione dello stereomicroscopio chirurgico, e Ron Lipinski (Whale Manufacturing) per la lavorazione delle parti stereotassiche.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Stampante 3D | Raise3D | Pro2 | Per la stampa di piastre posteriori |
| PLA Filamento per stampa 3D | Inland | PLA+-175-B | Materiale per stampa 3D in plastica nera |
| Software CAD 3D Software Dassault | Systèmes | Solidworks | utilizzato per progettare forme 3D Software per |
| stampanti 3D | Raise3D | Software Ideamaker | Software utilizzato per interfacciarsi con la stampante 3D |
| Piastra posteriore ovale stampata in 3D | personalizzata | Campo di imaging stabilizzante | |
| Microscopio da dissezione chirurgica | Leica | M205 C | Dotato di Leica FusionOptics, obiettivo Planapo 0,63x della serie M e tavolino scorrevole |
| Fotocamera per microscopio Fotocamera | a colori Leica | MC170 | HD per la visualizzazione del campo chirurgico |
| Tavolino scorrevole | Leica | 10446301 | Lo stadio di planata è costituito da due piastre metalliche. La piastra di base è fissa. La piastra superiore scorre su un'interfaccia ingrassata per consentire il movimento rotatorio e lineare. |
| Stazione chirurgica e forcella di stabilizzazione | Whale Manufactoring | Laminectomia | personalizzata |
| Unità di erogazione di isoflurano a basso flusso SomnoSuite | Kent Scientific | SS-01 | Somministrazione chirurgica di anestesia con vaporizzatore digitale integrato |
| Perno di montaggio da 1,5 pollici in acciaio inossidabile | ThorLabs | P50/M | Per il montaggio della stazione chirurgica su tavolo ottico per l'imaging |
| a due fotoniForca di serraggio svasata per montaggio da 1,5" Post | ThorLabs | PF175 | Per stabilizzare la stazione chirurgica montare su tavolo ottico per l'imaging a due fotoni |
| Microdrill osseo ideale | Apparecchio Harvard | 72-6065 | Assottigliamento dell'osso per laminectomia |
| Bagno d'acqua | Fisher | Scientific 15-462-10 | Soluzione salina riscaldante |
| Pistola per cauterizzazione | FST | 18010-00 | Cauterizzazione minore sanguina |
| Termoforo | Benchmark BF11222 | 1,9" x 4,5" riscaldatore in silicone con 20" Elettrocateteri in teflon, 10W, 5V | |
| Sonda rettale termoaccoppiata di tipo K | Physitemp | RET3 | Misurazione della temperatura corporea del mouse |
| vaselina | Sigma | 8009-03-8 | Sonda rettale lubrificante |
| Regolatore termico regolato in feedback | NA personalizzato | Le | alternative disponibili in commercio includono la serie Physitemp TCAT |
| PVA Lance chirurgiche per gli occhi | Beaver-visitec international | 40400-8 | Trimmer elettrico per l'assorbimento del sangue |
| Wahl | 41590-0438 | Lama per rifilare la pelliccia di topo | |
| , #11 | FST | 14002-14 | Pinze per strumenti chirurgici |
| , #5 | FST | 11254-20 | Pinze per strumenti chirurgici |
| , #4 | FST | 14002-14 | |
| Pinza dentata per strumenti chirurgici Titatnium | WPI | 555047FT | Strumento chirurgico |
| Forbici per iride in titanio | WPI | 555562S | Strumento chirurgico |
| Adesivo per tessuti Vetbond | 3M | 084-1469SB | Preparazione della superficie del tessuto per acrilico dentale |
| Vassoio di miscelazione in ceramica | Jack Richeson | 420716 | Miscelazione dell'agente acrilico dentale con l'accelerante |
| Orthojet acrilico dentale | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Incollaggio permanente della piastra posteriore al tessuto |
| Piccolo vetro di copertura rotondo, spessore #1, 3 mm | Harvard apparatus | 64-0720 | finestra ottica |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | Per aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | Per aCSF |
| Glucosio | Fisher Scientific | 50-99-7 | Per aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | Per aCSF |
| MgCl2& punto medio; 6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | Per aCSF |
| CaCl2· 2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Per aCSF |
| Carprofene | Rimadyl | QM01AE91 | Analgesia |
| Acqua batteriostatica | Henry Schein | 2587428 | Diluente per carprofene |
| Isoflurano | Henry Schein | 11695-6776-2 | Anestesia |
| Soluzione di ringer lattato | Baxter | 0338-0117-04 | Idratazione per il topo |
| Agarosio High EEO | Sigma | A9793 | punto di gel 34-37 gradi C |
| Unguento lubrificante oftalmico | Akwa Lacrime | 68788-0697 | Prevenire l'essiccazione corneale |
| MOM Microscopio a due fotoni | Sutter |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
