Articolo metodologico

Fabbricazione di anisotropo polimerici artificiali Antigen Presenting Cells per l'attivazione delle cellule T CD8 +

DOI:

10.3791/58332

⸱

12 ottobre 2018

 ,  ,  , 
1Biomedical Engineering, Translational Tissue Engineering Center, Institute for Nanobiotechnology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Biomedical Engineering, Translational Tissue Engineering Center, Institute for Nanobiotechnology, Ophthalmology, Oncology, Neurosurgery, Materials Science and Engineering, Chemical and Biomolecular Engineering, and the Bloomberg-Kimmel Institute for Cancer Immunotherapy, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo un protocollo per in modo rapido e riproducibile generare articifical biologicamente ispirato, biodegradabile antigene che presenta le cellule (aAPC) con sintonizzabile dimensione, forma e presentazione di proteina di superficie per cellula T espansione ex vivo o in vivo .

Abstract

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Cellule presentanti l'antigene artificiale (aAPC) sono una promettente piattaforma per modulazione immune dovuto la loro capacità potente per stimolare le cellule T. Substrati acellulare offrono vantaggi chiave sopra basati su cellule aAPC, compreso un controllo preciso dei parametri di presentazione di segnale e le proprietà fisiche della superficie aAPC per modulare le interazioni con le cellule T. aAPC costruito da particelle anisotropiche, particelle particolarmente ellissoidali, hanno dimostrato di essere più efficace di contattare loro controparti sferiche a stimolando le cellule di T a causa di grippaggio aumentato e maggiore superficie disponibile per la cellula T, anche come ha ridotto l'assorbimento non specifico e migliorate proprietà farmacocinetiche. Nonostante il crescente interesse anisotropiche particelle, anche ampiamente accettato metodi di generazione di particelle anisotropiche come allungamento del film sottile può essere difficile da implementare e utilizzare in modo riproducibile.

A tal fine, descriviamo un protocollo per la fabbricazione rapida, standardizzato di biodegradabile aAPC anisotropo basati su particelle con dimensioni regolabili, forma e segnale presentazione per cellula T espansione ex vivo o in vivo, insieme ai metodi di caratterizzano la loro dimensione, morfologia e superficie contenuto proteico e per valutare la loro funzionalità. Questo approccio a fabbricare aAPC anisotropico è scalabile e riproducibile, che lo rende ideale per la generazione di aAPC per immunoterapie "standard".

Introduzione

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Cellule presentanti l'antigene artificiale (aAPC) hanno indicato la promessa come agenti immunomodulatori perché possono generare una risposta robusta cellula di T antigene-specifiche. Essenziale per queste piattaforme sono la loro capacità di presentare in modo efficiente i segnali cruciali per l'attivazione delle cellule T. AAPC acellular sono un'alternativa attraente ai aAPC basati su cellule perché sono più facili e meno costoso da fabbricare, affrontare sfide meno durante scale-up e traduzione e alleviare i rischi connessi con le terapie basate sulle cellule. AAPC acellulare consentono anche di un elevato grado di controllo sui parametri di presentazione di segnale e le proprietà fisiche della superficie che si interfaccia con le cellule di T1.

aAPC deve ricapitolare un minimo di due segnali essenziali per l'attivazione delle cellule T. Segnale 1 fornisce il riconoscimento dell'antigene e si verifica quando il recettore delle cellule T (TCR) riconosce e si impegna con un MHC di classe I o II cuscinetto suo antigene cognata, che culmina nella segnalazione attraverso il complesso TCR. Per ignorare il requisito di specificità dell'antigene, aAPC sistemi spesso sopportano un agonistica dell'anticorpo monoclonale contro il recettore CD3, che non specifico stimola il complesso TCR. Forme ricombinanti di MHC, particolarmente dei multimeri MHC, sono state utilizzate anche sulla superficie della aAPC per fornire la specificità dell'antigene2,3. 2 è un segnale di costimolazione che indirizza l'attività delle cellule T. Per fornire la costimolazione necessari per l'attivazione delle cellule T, il recettore CD28 generalmente viene stimolato con un anticorpo agonista presentato sulla superficie aAPC, sebbene altri recettori costimolazione quali 4-1BB siano stati correttamente mirate4. Proteine di segnale 1 e 2 sono in genere immobilizzati sulla superficie delle particelle rigide di sintetizzare aAPC. Storicamente, aAPC sono stati fabbricati da una varietà di materiali, tra cui polistirolo4,5 e ferro destrano6. Sistemi più recenti utilizzano polimeri biodegradabili come poli (acido lattico-co-glicolico) (PLGA) per generare aAPC che può essere facilmente accoppiato per proteine di segnale, sono adatti per amministrazione diretta in vivoe può facilitare il rilascio prolungato di incapsulato citochine o fattori solubili per aumentare l'attivazione delle cellule T7,8.

Oltre alla presenza di proteine di segnale necessario, impegno del ricevitore su una superficie sufficientemente grande durante l'interazione aAPC/T è essenziale per l'attivazione delle cellule T. Così, parametri fisici di aAPC quali dimensioni e forma drasticamente alterano la loro area di contatto disponibile e influenzano la loro capacità di stimolare le cellule T. AAPC micron imprese hanno dimostrato di essere più efficace a stimolando le cellule di T di loro su scala nanometrica controparti9,10. Tuttavia, nano-aAPC possono avere biodistribuzione superiore e migliore drenaggio ai linfonodi che possono migliorare la loro prestazione in vivo sopra micro-aAPC11. Forma è un'altra variabile di interesse in sistemi basati su particelle aAPC. Anisotropo aAPC hanno recentemente dimostrato di essere più efficace di particelle isotropiche a stimolando le cellule di T, principalmente a causa di interazione avanzata con cellule bersaglio accoppiato con l'assorbimento riduttore delle cellule aspecifiche. Le cellule legano preferenzialmente all'asse lungo del ellissoidale particelle, e il più grande raggio di curvatura e la superficie più piatta consentono più contatto tra la aAPC e la cellula T12. L'asse lungo di particelle ellissoidali inoltre scoraggia la fagocitosi, con conseguente tempo di circolazione aumentata rispetto a particelle sferiche seguendo in vivo amministrazione12,13. A causa di questi vantaggi, ellissoidale particelle mediano una maggiore espansione di antigene-specifiche cellule T in vitro e in vivo rispetto a particelle sferiche, un effetto osservato al micro e nanoscales12, 13. Ci sono varie strategie per fabbricare particelle anisotropiche, ma film sottile lo stretching è un metodo ampiamente accettato semplice utilizzato per generare una gamma di particelle diverse forme14. A seguito di sintesi, particelle sono gettate nel film e allungate in una o due dimensioni ad una temperatura sopra la temperatura di transizione vetrosa del materiale della particella. Il film è poi sciolto per recuperare le particelle. Nonostante la crescente interesse in particelle anisotropiche, approcci attuali per fabbricazione aAPC basati su particelle sono per lo più limitati ai sistemi isotropi e metodi di alterare la forma delle particelle possono essere difficile da implementare, incompatibile con alcune sintesi aAPC strategie e mancanza di precisione e riproducibilità15. La nostra tecnica di allungamento del film sottile può essere eseguita manualmente o in modo automatico per generare velocemente anisotropiche particelle sintetizzate da una varietà di polimeri biodegradabili, estesa per un rapporto di aspetto desiderato in una o due dimensioni15.

Basato sul nostro lavoro precedente, abbiamo sviluppato un approccio basato su particelle biodegradabile combinato con scalabile tecnologia a film sottile che si estende per generare velocemente aAPC con forma e dimensioni sintonizzabile ad un modo standardizzato per cellula T espansione ex vivo o in vivo. La nostra strategia di coniugazione di proteina può essere utilizzato per accoppiare qualsiasi proteina di interesse per i gruppi carbossilici sulla superficie della particella ad una densità desiderata, dando questo sistema aAPC un elevato grado di flessibilità. Descriviamo anche metodi per caratterizzare la dimensione, la morfologia e la proteina di superficie contenuta di aAPC e per valutare la loro funzionalità in vitro. Questo protocollo può essere facilmente adattato per espandere le cellule immunitarie ex vivo o in vivo per una varietà di applicazioni di immunoterapia.

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Protocollo

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Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della Johns Hopkins University.

1. fabbricazione di particelle PLGA sferica di dimensioni sintonizzabile

  1. Preparazione di materiali per la sintesi delle particelle
    1. Preparare la soluzione al 5% p/p di alcol polivinilico (PVA).
      1. Aggiungere 500 mL di acqua deionizzata (DI) in un matraccio di Erlenmeyer con un'ancoretta magnetica e collocare su piastra riscaldante agitatore a 500 giri/min e monitor di temperatura con il termometro. Boccetta di coprire con carta stagnola per evitare l'evaporazione.
      2. Quando la temperatura dell'acqua raggiunge circa 70 ° C, aggiungere 25 g totale di PVA in piccoli lotti nel corso del tempo, in attesa di PVA sciogliere prima di aggiungere altro.
      3. Una volta che tutti i PVA è dissolto (in genere 30-60 min), lasciate filtro soluzione fredda e sterile. Conservare a 4 ° C per uso futuro.
    2. Preparare soluzione casting film 10% w/w PVA e 2% w/w glicerolo.
      1. Aggiungere 500 mL di acqua DI un matraccio di Erlenmeyer con un'ancoretta magnetica. Aggiungere 8 mL di glicerolo a temperatura ambiente e mescolare di triturazione.
      2. Immergere la muffola su piastra riscaldante agitatore a 500 giri/min e monitor temperatura con il termometro. Boccetta di coprire con carta stagnola per evitare l'evaporazione.
      3. Quando la temperatura della soluzione raggiunge circa 70 ° C, aggiungere 50 g totale di PVA in piccoli lotti nel corso del tempo, in attesa di PVA sciogliere prima di aggiungere più.
      4. Una volta che tutti i PVA è dissolto (in genere 60 min), lasciate filtro soluzione fredda e sterile utilizzando un sistema di filtro vuoto bottiglia-top con un diametro dei pori di 0.22 μm. Conservare a temperatura ambiente per un utilizzo futuro.
    3. Preparare una soluzione PVA di 50 mL 1% w/w. Aggiungere 40 mL di acqua distillata e 10 mL di soluzione PVA 5% (fatto in 1.1.1) in un becher da 100-150 mL.
    4. Preparare una soluzione PVA 100 mL 0,5% w/w. Aggiungere 90 mL di acqua distillata e 10 mL di soluzione di PVA 5% un becher da 150-250 mL.
    5. Aggiungere un ancoretta magnetica al 0,5% soluzione di PVA e posto in una cappa chimica su una piastra di agitazione a temperatura ambiente a 500 giri/min.
  2. Sintesi di microparticelle
    1. Pesare 100 mg di poli (acido lattico-co-glicolico) (PLGA) in un flaconcino di scintillazione e sciogliere in 5 mL di diclorometano (DCM). Vortex per sciogliere il PLGA.
    2. Posizionare omogeneizzatore ai 50 mL di soluzione PVA 1% in modo che l'omogeneizzatore è più vicino al fondo del becher possibile senza toccarlo. Accendere omogeneizzatore e regolare la velocità desiderata — 3.200 giri/min per 5 μm particelle di diametro, 5.000 giri/min per 3 μm, 15.000 rpm per 1 μm (aumentando la dimensione delle particelle di omogeneizzazione velocità diminuisce). Una volta alla velocità desiderata, aggiungere la soluzione PLGA Becher e omogeneizzare per 1 minuto.
    3. Dopo omogeneizzazione, versare l'1% PVA, soluzione di microparticelle PLGA nella soluzione di PVA 100 mL 0,5% su un piatto di mescolare e agitare per almeno 4 ore per evaporazione del solvente in una cappa chimica.
    4. Lavare le particelle 3 volte in acqua deionizzata.
      1. Versare la soluzione di particelle in provette coniche da 50 mL e centrifugare a 3000 x g per 5 minuti. Versare il surnatante e aggiungere circa 20 mL di acqua deionizzata.
      2. Risospendere le particelle nel Vortex. Una volta risospeso, riempire provette coniche da 50 mL con acqua deionizzata.
      3. Lavare nuovamente allo stesso modo altre due volte.
  3. Sintesi di nanoparticelle
    1. Pesare 200 mg di PLGA in un flacone di scintillazione e sciogliere in 5 mL di DCM. Vortex per sciogliere il PLGA.
    2. Inserire un becher con 50 mL di soluzione di 1% PVA nel contenitore pieno di ghiaccio. Posizionare la sonda sonicatore nel becher più vicino alla parte inferiore come possibile senza toccare. Iniziare la sonicazione e immediatamente aggiungere soluzione PLGA nel becher. Sottoporre ad ultrasuoni con una potenza di 12 W per 2 minuti per generare nanoparticelle con un diametro approssimativo di 200 nm.
    3. Dopo sonicazione, versare l'1% PVA, soluzione di nanoparticelle PLGA in una soluzione PVA 100 mL 0,5% su un piatto di mescolare e agitare per almeno 4 ore per evaporazione del solvente in una cappa chimica.
    4. Versare la soluzione di particelle in provette coniche da 50 mL e centrifugare a 3.000 x g per 5 minuti per eliminare le microparticelle. Rimuovere il surnatante e versare in provette da centrifuga ad alta velocità.
    5. Lavare le particelle 3 volte con acqua distillata. Centrifugare a 40.000 x g per 15 minuti. Versare il surnatante e risospendere in acqua distillata nel Vortex. Lavare nuovamente allo stesso modo altre due volte.

2. fabbricazione di particelle polimeriche di forma sintonizzabile

  1. Dopo il lavaggio particelle di PLGA tre volte, risospendere le particelle in circa 1 mL di acqua deionizzata. Aggiungere la soluzione di casting film alle particelle per concentrazione di particelle finale delle particelle di 2,5 mg/mL.
  2. Dispensare la sospensione di particelle in aliquote di 10 mL nei piatti Petri rettangolare 75 x 50 mm per lo stretching unidimensionale o in aliquote da 15 mL in 100 x 100 mm quadrati di Petri per allungamento bidimensionale. Togliere bolle mediante pipetta sia o bolle che spinge al lato e lasciate asciugare durante la notte film in una cappa chimica.
  3. Una volta seccato film, rimuovere film da piatti di plastica con le pinzette e tagliare i bordi delle pellicole con le forbici. Salvare i bordi in una provetta conica 50 mL per essere utilizzato come particelle sferiche.
    1. Caricare un film sulla pellicola sottile automatizzato stretching dispositivo montando un film sui blocchi di alluminio. 1D stretching, per montare film sui blocchi di alluminio di un asse della barella (Figura 2) inserendo due bordi corti della pellicola tra due pezzi di gomma del neoprene. Utilizzando una chiave a brugola, avvitare le manopole in metallo sulla parte superiore in gomma per tenere il film in posizione. Per l'allungamento 2D, montare tutti e quattro i bordi sui quattro blocchi di alluminio per allungare su entrambi gli assi (Figura 2).
    2. Misurare e registrare la lunghezza del film fra blocchi di alluminio su un asse per lo stretching 1D o entrambi gli assi per lo stretching 2D. Calcolare la distanza necessaria per la pellicola di stirata in una o due direzioni basate piega-stretching desiderata.
    3. Posizionare il dispositivo di stretching film-caricato in un forno a 90 ° C e portare il film a temperatura più di 10 minuti. Posto una grande Coppa al forno con una piccola quantità di acqua.
    4. Film estensibile.
    5. Al termine della dilatazione, rimuovere il dispositivo di allungamento dal forno e lasciare raffreddare la pellicola a temperatura ambiente per 20 minuti.
    6. 1D stretching, per tagliare la pellicola dal dispositivo d'allungamento ai bordi. Per l'allungamento 2D, tagliare e salvare il centro quadrato del film che è allungato uniformemente su entrambi gli assi. Mettere film in provette coniche con 2 pellicole per tubo e scartare il resto del film.
    7. Aggiungere circa 25 mL di acqua DI ogni provetta conica e agitare fino a quando i film sono dissolti.
    8. Una volta che i film sono particelle disciolte, lavare 3 volte con acqua distillata.
      1. Per microparticelle, riempire provette coniche da 50 mL e centrifugare a 3000 x g per 5 minuti, versare il surnatante, aggiungere circa 20 mL di acqua deionizzata e vortexare per risospendere le particelle.
      2. Per le nanoparticelle, particelle di trasferimento alle provette da centrifuga ad alta velocità e centrifugare a 40.000 x g per 15 minuti, versare il surnatante, aggiungere circa 20 mL di acqua deionizzata e vortexare per risospendere le particelle.
    9. Dopo il terzo lavaggio, risospendere le particelle in circa 1 mL di acqua deionizzata. Registrare il peso del tubo del microcentrifuge e aggiungere particelle al tubo. Congelare le particelle in un congelatore a-80 ° C per 1 ora o freeze flash in azoto liquido. Una volta congelato, lyophilize particelle durante la notte.
    10. Una volta liofilizzato, pesare le particelle nel tubo del microcentrifuge e sottrarre peso registrato del tubo vuoto per determinare il peso delle particelle liofilizzate.

3. superficie proteina coniugazione per creare cellule presentanti l'antigene artificiale

  1. Preparare 2-(N-morfolino) buffer di ethanesulfonic acido (MES). Effettuare una soluzione 0,1 M di MES in acqua e regolare il pH a 6.0 mediante titolazione con 1M di idrossido di sodio (NaOH).
  2. Risospendere liofilizzato PLGA/PBAE micro/nanoparticelle a 20 μg/mL in tampone MES nel Vortex. Riempire un tubo del microcentrifuge in polipropilene con 900 μL di tampone di MES e aggiungere 100 μL della soluzione di particelle al tubo.
  3. Preparare soluzione EDC/NHS. Sciogliere 40 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) e 48 mg N-hydroxysulfoxuccinimide (NHS) in 1 mL di tampone MES.
  4. Aggiungere 100 μL di soluzione EDC/NHS per le particelle e il vortice di mescolare.
  5. Incubare la provetta su un inverter a temperatura ambiente per 30 minuti.
  6. Rotazione verso il basso microparticelle a 5.000 x g per 5 minuti, o nanoparticelle a 17.000 x g per 5 minuti. Scartare il surnatante e risospendere in 1 mL di PBS di Vortex (microparticelle) o sonicating al 2-3 W per 5 secondi (nanoparticelle).
  7. Per microparticelle, aggiungere 8 μg della proteina segnale desiderato 1 e 10 μg anti-topo CD28 (clone 37.51) le particelle. Per le nanoparticelle, aggiungere 16 μg segnale 1 e 20 μg anti-mouse CD28. Aggiungere PBS per portare il volume nel tubo a 1,1 mL.
  8. Incubare la provetta su un inverter a 4 ° C durante la notte.
  9. Il giorno dopo, lavare le particelle. Rotazione verso il basso microparticelle a 5.000 x g per 5 minuti, o nanoparticelle a 17.000 x g per 5 minuti. Eliminare il supernatante e risospendere le particelle in 1 mL di PBS sterile di Vortex (microparticelle) o sonicazione a 2-3 W per 5 secondi (nanoparticelle). Ripetere due volte.
  10. Risospendere le particelle alla concentrazione desiderata nel terreno di coltura per un uso immediato. Per l'archiviazione a lungo termine, risospendere le particelle a 10 mg/mL in una soluzione di saccarosio di 100 mM. Congelare, lyophilize e memorizzare le particelle a-80 ° C.

4. caratterizzazione e valutazione di aAPC

  1. Caratterizzazione della aAPC dimensione e forma (Figura 3)
    1. Caratterizzano microparticella dimensioni e forma di particelle imaging mediante microscopia elettronica a scansione (SEM). Per SEM particelle liofilizzate imaging, diffuse sul nastro di carbonio aderito ad un alluminio virare e polverizza cappotto con oro-palladio.
    2. Analizzare le dimensioni e le proporzioni delle particelle utilizzando software di analisi di immagine.
    3. Per determinare la dimensione delle particelle, imposta scala utilizzando la barra della scala e misurare il diametro della particella. Ripetere per circa 100 particelle determinare il diametro medio delle particelle e generare un istogramma delle dimensioni delle particelle.
    4. Per determinare il rapporto di aspetto, misurare la distanza tra l'asse e l'asse corto di particelle e dividere l'asse lungo di asse corto. Ripetere per circa 50 particelle di ogni forma per determinare le proporzioni delle particelle media per ogni forma e generare istogrammi.
    5. Caratterizzano la forma e dimensioni delle nanoparticelle da imaging particelle mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Analizzare le dimensioni e le proporzioni delle nanoparticelle utilizzando software di analisi di immagine, come descritto in 5.1.2. In alternativa, misurare dimensioni delle nanoparticelle sferiche tramite diffusione dinamica della luce (DLS) o nanoparticle tracking analysis (NTA).
  2. Efficienza di coniugazione di proteina
    1. Preparare aAPC secondo metodi 1-3, ma nel passaggio 3,7 utilizzare proteine segnale fluorescente contrassegnati 1 e anti-topo CD28. Dopo coniugazione e il lavaggio, risospendere il aAPC in 1 mL di PBS per una concentrazione finale di 2 mg/mL aAPC.
    2. Preparare gli standard della proteina in una micropiastra a 96 pozzetti in polistirene nero. Aggiungere 5 µ g di proteine di segnale fluorescente contrassegnati 1 alla PBS nel primo pozzetto della piastra e fare 10 diluizioni 1:2 in PBS lungo la riga della piastra. Lasciare il vuoto bene ultimo. Ripetere questo passaggio per generare un'altra serie di norme con fluorescente identificati anti-CD28.
    3. Aggiungere 100 μL della soluzione aAPC in replicati pozzetti della micropiastra polistirolo nero in triplice copia.
    4. Leggere la fluorescenza su un lettore di fluorescenza alle lunghezze d'onda appropriate. Usare i valori di fluorescenza dagli standard della proteina per generare le curve standard per ogni anticorpo fluorescente. Utilizzando la curva standard, calcolare le concentrazioni di segnale 1 e anti-CD28 in ciascun pozzetto del campione e quindi calcolare la quantità di proteina di superficie ed efficienza di coniugazione (Figura 4A, Figura 5A).
  3. Valutazione di aAPC per stimolazione in vitro di cellule T CD8 +
    1. Preparare il supporto di B' (medium RPMI supplementato con L Glutammina, 10% FBS, soluzione all'1% Non-essenziale amminoacido, piruvato di sodio 1%, 1% soluzione di vitamine MEM, 92 μM β-mercaptoetanolo, 10 ng/mL ciprofloxacina e 30 U/mL IL-2.
    2. Sacrificare un mouse Nero 6 tramite esposizione di anidride carbonica.
    3. Raccogliere la milza dal mouse secondo un protocollo precedentemente stabilito16. Raccogliere la milza in una provetta conica da 50 mL con 10 - 15 mL di PBS. Con un pestello, schiacciare la milza attraverso un colino di cella di 70 µm in una provetta conica da 50 mL. Durante schiacciare, lavare il filtro con 40 mL di PBS.
    4. Spin il splenocytes a 300 x g per 5 minuti. Versare il sovranatante e risospendere il splenocytes in 4 mL di tampone di lisi Ack per lisare le cellule di anima rosse. Lasciare il tubo a sedere indisturbati per 1 minuto, quindi aggiungere PBS per portare il volume nel tubo a 20 mL.
    5. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 minuti. Versare il supernatante e risospendere le cellule in 1 mL di PBS. Contare le celle utilizzando un emocitometro.
    6. Girare le cellule a 300 x g per 5 minuti e risospendere nel desiderato volume di tampone di separazione cellulare. Isolare le cellule di T di CD8 + dalla sospensione singola cella usando una selezione negativa CD8 + T cell kit di isolamento, seguendo il protocollo del produttore.
    7. A seguito di separazione magnetica, spin cellule T CD8 + a 300 x g per cinque minuti e rimuovere il tampone di separazione cellulare. Risospendere le cellule in 1 mL di PBS e contare le celle. Marcare le cellule con carboxyfluorescein succinil estere (CFSE) secondo il protocollo del produttore.
    8. Incubare 8.333 cellule T CD8 + e 0,0833 mg (o dose desiderata) di aAPC in media 150 B' μL in ogni pozzetto di un 96 piastra di coltura del tessuto-trattati bene U-inferiore.
    9. Incubare a 37 ° C per 7 giorni. Dopo 3-4 giorni, è necessario aggiornare il terreno di coltura aggiungendo mezzo fresco di 75 μL in ogni pozzetto.
    10. Dopo 3 giorni di incubazione, analizzare CFSE etichettati cellule su un citometro a flusso per valutare la proliferazione. Ogni picco l'istogramma di CFSE cytometry di flusso rappresenta una generazione di cellule dovuto la diluizione di CFSE ad ogni divisione cellulare successivi.
    11. Dopo 7 giorni, è necessario utilizzare un emocitometro per contare il numero di cellule in ciascun pozzetto. Prima del conteggio, macchia le cellule morte con una soluzione di blu di Trypan. Escludere le cellule morte dalla conta finale. Normalizzare la concentrazione di cella finale alla concentrazione iniziale per calcolare la fold-espansione (Figura 4 e Figura 5).

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Risultati

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Uno schema per il film sottile 2D automatico dispositivo di allungamento è dato in Figura 1. Un disegno schematico e una descrizione per un film sottile di 1D stretching dispositivo è dato Ho et al.17 la barella viene costruita dalle parti di alluminio mediante fresatura standard e tecniche di lavorazione. Simile alla barella 1D, 2D barella è costituito da manopole metalliche e rotaie di guida. Viti di trasmissione bidirezionale vengon...

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Discussione

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Questo protocollo in dettaglio un metodo versatile per la precisa generazione di particelle polimeriche anisotropiche. Il film sottile che allunga la tecnica qui descritta è scalabile, altamente riproducibile e poco costoso. Tecniche alternative per la generazione di particelle anisotropiche soffrono di molte limitazioni, tra cui il costo elevato, bassa velocità effettiva e granulometria limitata. Il film sottile stretching approccio è anche vantaggioso perché le particelle sono modificate per essere anisotropo dopo la s...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EBA (DGE-1746891) e KRR (DGE-1232825) grazie al programma NSF Graduate Research Fellowship per supporto. Grazie RAM nazionali di ricerca servizio premio NIH NCI F31 (F31CA214147) e le ricompense di successo per College scienziati Fellowship per supporto. Gli autori ringraziano il NIH (R01EB016721 e R01CA195503), la ricerca per prevenire la cecità James e Carole gratis Catalyst Award e l'Istituto di Bloomberg-Kimmel JHU per immunoterapia del cancro per il supporto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Poli(alcool vinilico), MW 25000, 88% idrolizzatoPolysciences, Inc.02975-500
Termometro digitale GlycerolSigma-AldrichG9012
FlukeN/A Nomedel modello: Fluke 52 II
Sonda di temperatura a immersioneFlukeN/ANome del modello: Fluke 80PK 22
Digital Hotplate & AgitatoreBenchmark ScientificH3760-HS
Agitatore multipuntoThermo Fisher Scientific50093538
Resomer RG 504 H, Poli(D,L-lattide-co-glicolide)Sigma-Aldrich719900
DiclorometanoSigma-AldrichD65100
OmogeneizzatoreIKA 
SonicatorSonics & Materiali, Inc.N/ANumero di modello: VC 505
Sonicator insonorizzazioneSonics & Materiali, Inc.N/ACodice articolo: 630-0427
Sonda sonicatriceSonics & Materiali, Inc.N/ACodice articolo: 630-0220
Microtip del sonicatoreSonics & Materiali, Inc.N/ACodice articolo: 630-0423
Centrifuga ad alta velocitàBeckman CoulterN/A Numerodi modello: J-20XP (fuori produzione), modello alternativo: J-26XP
Rotore per centrifuga ad alta velocitàBeckman Coulter369691Numero di modello: JA-17
Provette per centrifuga in policarbonato ad alta velocitàThermo Fisher Scientific3118-005050 mL, tappo a vite
Petri monouso rettangolare piattoVWR International25384-32275 x 50 x 10 mm
Piatto di Petri monouso quadratoVWR International10799-140100 mm x 100 mm
LEAF  CD3 antitopo purificatoε AnticorpoBiolegend100314
InVivoMab anti-topo CD28, clone 37.51Bio X CellBE0015-1
N-(3-Dimetilamminopropil)-N′-etilcarbodiimmide cloridratoSigma-AldrichE6383
N-Idrossisulfosuccinimide sale sodicoSigma-Aldrich56485
MESSigma-AldrichM3671
Alexa Fluor 488 anti-topo CD3 AnticorpoBiolegend100212
APC anti-topo CD28 AnticorpoBiolegend102109
Corning  Micropiastra in polistirene solido a 96 pozzettiSigma-AldrichCLS3915fondo piatto, polistirene nero
Provette LoBind per proteine, 1,5 mLEppendorf22431081
RPMI 1640 Medium (+ L-glutammina)ThermoFisher Scientific11875093
Siero fetale bovinoSigma-AldrichF4135inattivata termicamente, filtrata sterile
Sigma-Aldrich17850
2-MercaptoetanoloSigma-AldrichM6250
IL-2 umano ricombinante (senza vettore)Biolegend589102
MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali (100X)ThermoFisher Scientific11140050
MEM Vitamin Soluzione (100X)ThermoFisher Scientific11120052
CD8a+  Kit di isolamento delle cellule T,topo Miltenyi Biotech130-104-075
Kit di proliferazione cellulare CellTrace CFSEThermoFisher ScientificC34554
Colonne LS MiltenyiBiotech130-042-401
Separatore MidiMACSMiltenyi Biotech130-042-302
MACS MultistandMiltenyi Biotech130-042-303
Citometro a flussoAccuri C6
Synergy 2 Lettore di micropiastre multi-rilevamentoBioTek
autoMACS Tampone di corsaMiltenyi BIotech130-091-221
Filtro cellulareThermoFisher Scientific22363548sterile, 70 &; m rete in nylon
ACK Lysing BufferThermoFisher ScientificA1049201
C57BL/6J (Nero 6)Topo The Jackson Laboratory000664Maschio, di almeno 7 settimane
Piastre per colture tissutali con fondo a U VWR353227Piastre sterili in polistirene trattato per colture tissutali a 96 pozzetti
Alimentatore da 40 V CCProbotixLPSK-4010
PTFE Filo rivestitoMouser602-5858-100-01Questo è per una bobina da 100 piedi, ma un filo equivalente funzionerà
Driver per motori passo-passoProbotixMondoStep5.6
Kit connettore IDCProbotixIDCM-10-12
MicrocontrolloreProbotixPBX-RF
4A FusibiliRadio Shack2701026Fusibili equivalenti funzioneranno anche
Cavo DB25 maschio-maschioProbotixDB25-6
Cavo da USB-A a USB-BGraffette 2094915cavo equivalente funzioneranno anche
Connettori Amphenol a 8 pin maschio e femminaMouser654-97-3100A-20-7P e 654-97-3106A20-7S
Motore passo-passoProbotixHT23-420-8
Vite di comando destrorsoRoton60722
Vite di comando sinistrorsoRoton60723
VitiMcMaster Carr92196A151
Gomma neopreneMcMaster Carr8698K51
Dado di piombo flangiato destrorsoRoton91962
Dado di piombo flangiato sinistrorsoRoton91963
Computer di controllo LinuxProbotixLCNC-PCQualsiasi computer con specifiche corrispondenti e sistema operativo Linux funzionerà
di filtraggio sottovuoto per flaconi CorningSigma-AldrichCLS431097
Trypan Blue Solution, 0,4 %ThermoFisher Scientific15250061
0003725001 Ciprofloxacina Piruvato di sodio (100 mM)ThermoFisher Scientific 11360070 Sistema

Riferimenti

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