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Articolo metodologico

Isolamento di F1-ATPasi dal Protista parassita Trypanosoma brucei

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DOI:

10.3791/58334

⸱

22 gennaio 2019

 , 
1Biology Centre, Czech Academy of Science, Institute of Parasitology, 2Faculty of Science, University of South Bohemia

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive la purificazione di F1-ATPase dal palco dell'insetto colta di Trypanosoma brucei. La procedura produce un complesso altamente puro, omogeneo e attivo adatto per studi strutturali ed enzimatici.

Abstract

F1-atpasi è una membrana-estrinseca ossidrilasico catalitica del F-tipo ATP sintasi, un enzima che utilizza la forza motrice protonica attraverso le membrane biologiche per la produzione di adenosina trifosfato (ATP). L'isolamento del intatta F1-ATPasi dalla sorgente nativo è un prerequisito essenziale per caratterizzare la composizione proteica, parametri cinetici e sensibilità agli inibitori dell'enzima. Un altamente puro e omogeneo F1-ATPasi possono essere utilizzato per studi strutturali, che forniscono la comprensione nei meccanismi molecolari di sintesi di ATP e idrolisi. In questo articolo viene descritta una procedura per la purificazione del F1-ATPase dal Trypanosoma brucei, l'agente causativo di trypanosomiases africano. F1-atpasi è isolato dalle vescicole mitocondriale, che sono ottenute da Lisi ipotonica da in vitro coltivate trypanosomes. Le vescicole sono frammentate meccanicamente di sonicazione e la F1-ATPasi viene rilasciato dalla membrana mitocondriale interna mediante l'estrazione di cloroformio. Il complesso enzimatico viene ulteriormente purificato di scambio anionico consecutivi e la cromatografia di esclusione dimensionale. Tecniche di spettrometria di massa sensibile ha mostrato che il complesso purificato è privo di contaminanti virtualmente qualsiasi proteina e, pertanto, rappresenta il materiale adatto per la determinazione della struttura di cristallografia a raggi x o cryo-microscopia elettronica. L'isolato F1-ATPasi esibisce attività idrolitica di ATP, che può essere inibito completamente da sodio azide, un potente inibitore delle F-tipo ATP sintasi. Il complesso purificato rimane stabile e attiva per almeno tre giorni a temperatura ambiente. Precipitazione con solfato di ammonio è usato per immagazzinaggio a lungo termine. Procedure simili sono state usate per la purificazione di F1- atpasi da tessuti di mammiferi e vegetali, lieviti o batteri. Così, il protocollo presentato può servire come guida per la F1-isolamento dell'atpasi da altri organismi.

Introduzione

I tipo F ATP sintasi sono membrana-limitano rotanti complessi multiproteici tale traslocazione del protone di coppia attraverso le membrane trasduzione di energia dei batteri, i mitocondri e cloroplasti con la formazione di ATP. Dettagli molecolari del meccanismo di rotazione di sintesi di ATP sono noti principalmente a causa di studi strutturali di purificato batterica e mitocondriale ATP sintasi e loro subcomplexes1. F-tipo trifosfato di adenosina synthase è organizzato in membrana-intrinseche ed estrinseche-membrana moiety. Parte della membrana-estrinseco, nota come F1-atpasi, contiene tre siti catalitici, dove si verifica la fosforilazione dell'adenosina difosfato (ADP) di ATP o la reazione inversa. F1-ATPasi possono essere rilasciato sperimentalmente da parte dell'intrinseca di membrana pur mantenendo la sua capacità di idrolizzare, ma non sintetizzare, ATP. Il settore di membrana-limita, chiamato Fo, media la traslocazione di proteine, che aziona la rotazione della parte centrale dell'enzima. La F1 e Fo settori sono collegati da steli centrali e periferici.

I primi tentativi di purificare la F1-atpasi da lievito e cuore bovino mitocondri data indietro al 1960. Questi protocolli utilizzati estratti di mitocondri, che sono stati interrotti di sonicazione, frazionato da precipitazione del solfato dell'ammonio o protamina, seguita da cromatografia opzionale passo (s) e trattamento termico2,3,4 ,5,6. La purificazione è stato notevolmente migliorata e semplificata mediante l'uso di cloroformio, che prontamente rilascia la F1-ATPasi dalla membrana mitocondriale frammenti7. L'estrazione di cloroformio è stato poi utilizzato per estrarre F1- atpasi da vari animali, vegetali e fonti batteriche (ad es., del fegato del ratto8, mais9, Arum maculatum10e Escherichia coli 11). Ulteriore purificazione del cloroformio-rilasciato F1-ATPasi mediante cromatografia di affinità o di esclusione (SEC) ha reso una proteina altamente pura complessa, che era adatta per la determinazione della struttura ad alta risoluzione di cristallografia a raggi x, come documentato dalle strutture di F1-atpasi da cuore bovino12,13 e14di Saccharomyces cerevisiae. F1-strutture dell'atpasi inoltre sono stati determinati da organismi che sono difficili da coltivare e, quindi, la quantità di materiale biologico iniziale era limitata. In questo caso, la F1-subunità ATPasi sono stati artificialmente espresso e assemblate per formare il complesso dentro e. colie l'enzima intero eterologa è stato purificato mediante cromatografia affinità tramite una subunità taggata. Tale approccio ha portato alla determinazione di F1-strutture di atpasi da due specie di batteri termofile, Geobacillus stearothermophilus15 e thermarum Caldalkalibacillus16, 17. Tuttavia, questa metodologia è piuttosto inadatta per eucariotica F1- ATPasi dato che si basa sull'apparato protheosynthetic procariote, elaborazione post-traduzionale e assiemi complessi.

L'estrazione basata su cloroformio utilizzato in precedenza per isolare F1- atpasi da unicellulari digenetic parassiti Trypanosoma cruzi18 e T. brucei19, importanti patogeni mammiferi causando americano e Trypanosomiases africano, rispettivamente e da malattie monogenica insetto parassita Crithidia fasciculata20. Queste purificazioni ha condotto soltanto a una semplice descrizione del F1- atpasi, poiché nessuna applicazione a valle sono stata usata per caratterizzare la composizione, struttura e proprietà enzimatiche del complesso. Questo articolo viene descritto un metodo ottimizzato per F1-purificazione dell'atpasi dalla fase del ciclo di vita dell'insetto colta di T. brucei. Il metodo è sviluppato basato su protocolli stabiliti per l'isolamento di bovini e lievito F1- ATPasi21,22. La procedura produce altamente puro e omogeneo enzima adatto in vitro enzimatico e inibitorio saggi, proteomica dettagliata caratterizzazione mediante spettrometria di massa23e struttura determinazione24. Il protocollo di purificazione e la conoscenza del F1-ATPasi struttura a livello atomico si apre la possibilità di progettare le schermate per identificare piccole molecole inibitori e facilitare lo sviluppo di nuovi farmaci contro trypanosomiases africano. Inoltre, il protocollo può essere adattato per purificare F1-atpasi da altri organismi.

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Protocollo

1. tamponi e soluzioni

  1. Preparare le soluzioni elencate di seguito. Degassare tutti i buffer per cromatografia liquida. Aggiungere gli inibitori di proteasi, benzamidine e ADP appena prima dell'uso.
    1. Preparare il tampone di buffer a: 50 mM Tris con acido cloridrico (Tris-HCl) pH 8.0, saccarosio 0,25 M, 5 mM benzamidine, 5mm aminocaproico acido (ACA) e proteasi inibitori (10 amastatin µM, 50 µM Bestatina, 50 µM pepstatina, 50 µM leupeptina e 50 µM diprotin A).
    2. Preparare di tampone b: 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.25 M saccarosio, acido etilendiamminotetracetico 4mm (ed), 5 mM benzamidine, 5mm ACA, 1mm ADP e inibitori della proteasi (10 amastatin µM, 50 µM Bestatina, 50 µM pepstatina, 50 µM leupeptina e 50 µM diprotin A).
    3. Preparare il tampone di Q-colonna: 20 mM Tris-HCl a pH 8.0, 4 mM EDTA, 10mm MgSO4, 5mm benzamidine, 5mm ACA e 1 mM ADP.
    4. Preparare il tampone di eluizione di Q-colonna: buffer di Q-colonna con NaCl di 1m.
    5. Preparare il tampone di SEC: 20 mM Tris-HCl a pH 8.0, 10mm MgSO4, 100 mM NaCl, 1 mM ADP.
    6. Preparare il cloroformio saturata con 2 M Tris-HCl pH 8,5. Mescolare il cloroformio con 2 M Tris-HCl pH 8,5 in rapporto di circa 1:1 in una bottiglia con tappo a vite, agitare, let fasi organiche ed acquose separate e misurare il pH nello strato acquoso superiore con una striscia di carta indicatore di pH. Conservare a temperatura ambiente. Appena prima dell'uso, agitare nuovamente e lasciare che le fasi separate. Utilizzare lo strato inferiore di cloroformio.
      Attenzione: Il cloroformio è volatile ed irritante per gli occhi e la pelle. Lavorare in una cappa aspirante. Usare occhiali di sicurezza quando l'agitazione.

2. preparazione di particelle sub-mitocondriali

  1. Risospendere le vescicole mitocondriale (mitoplasts) isolate da Lisi ipotonica25 da 1 x 1011 a 2 x 1011 celle di prociclico T. brucei in 5 mL di tampone ghiacciata r. Keep il campione refrigerato fino al punto 3.2.
  2. Determinare la concentrazione di proteina nella sospensione di bicinconinico acido (BCA) proteine dosaggio26 secondo le istruzioni del produttore.
    1. Utilizzare una serie di diluizioni di albumina di siero bovino (BSA) in acqua ultrapura per costruire la curva standard. Diluire una piccola quantità di campione 20 - 100 volte con acqua ultrapura per adattarsi gli standard di gamma di BSA.
    2. Calcolare la quantità di proteine totali nel campione e portare la concentrazione nella proteina a 16 mg/mL diluendo con buffer aggiuntivo A.
  3. Frammento di mitoplasts in vescicole invertite e pezzi di membrana di sonicazione della sospensione 7 x per 15 s con un'energia totale di 70 a 100 J per impulso con un microtip con un diametro di 3,9 mm. Se l'omogeneizzatore ad ultrasuoni non Visualizza l'output di energia, avviare l'ottimizzazione al 50% della potenza massima. Incubare il campione in ghiaccio per 30 s tra gli impulsi. Dopo la sonicazione, la sospensione diventa leggermente più scura.
  4. Frammenti di sedimento la membrana dall'ultracentrifugazione a 54.000 x g per 16 h o a 98.000 x g per 5 ore a 4 ° C. Decantare il supernatante e procedere con l'estrazione di cloroformio, o flash-congelare il sedimento in azoto liquido e conservare a-80 ° C.

3. rilascio di F1-ATPasi dalla membrana di cloroformio

  1. Risospendere il pellet delle membrane mitocondriali nel buffer B con l'ausilio di un omogeneizzatore lisata piccolo. Calcolare il volume di tampone B basato sull'importo totale del buffer di un usato nella formula di punti 2.1 e 2.2, utilizzando il seguente: volume (tampone B) = volume (tampone A) x 12/21. Trasferire la sospensione in una provetta conica da 15 o 50 mL.
  2. Rimuovere il campione dal ghiaccio e, da questo momento in poi, tenere il campione e tutte le soluzioni per essere utilizzato a temperatura ambiente.
  3. Aggiungere cloroformio saturata con 2 M Tris-HCl pH 8,5; il volume di cloroformio da aggiungere è uguale a metà del volume della sospensione. Chiudere il tappo. Agitare vigorosamente per esattamente 20 s. e centrifugare immediatamente a 8.400 x g per 5 min a temperatura ambiente.
  4. Trasferire la fase acquosa nuvolosa superiore a 1,6 mL microprovette. Aggiungere gli inibitori di proteasi (10 amastatin µM, 50 µM Bestatina, 50 µM pepstatina, 50 µM leupeptina e 50 µM diprotin A) per sostituire gli inibitori rimossi mediante il trattamento di cloroformio. Centrifugare i campioni a 13.000 x g per 30 min a temperatura ambiente. Trasferire il surnatante per microprovette fresco e ripetere la centrifugazione per rimuovere qualsiasi materiale insolubile.

4. cromatografia di scambio anionico

  1. Equilibrare la colonna di scambio (Q) 5 mL anione collegata ad un sistema di cromatografia liquida fast-proteina con il buffer di Q-colonna ad un flusso di 5 mL/min fino a quando l'assorbanza a 280 nm e la conducibilità stabilizzare (circa 50 mL di tampone).
  2. Caricare il surnatante da passo 3.3 sulla colonna equilibrata ad un flusso di 1 mL/min aspettare fino a quando l'assorbanza a 280 nm si stabilizza a background. Applicare una sfumatura lineare di 25 mL di tampone di eluizione di Q-colonna da 0% a 100% a una portata di raccogliere frazioni di 1 mL 0,5 mL/min.
  3. Analisi di singole frazioni corrispondente al picco di eluizione principali per attività idrolitica di ATP dai Pullman ATPasi dosaggio2 pH 8.0. Utilizzare 10 µ l di ciascuna frazione per 1 mL di miscela di reazione. Piscina le frazioni che presentano l'attività dell'atpasi. Facoltativamente, separare 10 µ l di ciascuna frazione su elettroforesi di sodio dodecil fosfato del gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) e macchia il gel da Blue di Coomassie visualizzare singoli F1-subunità atpasi e proteine contaminanti.
  4. Concentrato il campione mediante ultrafiltrazione di membrana con una colonna di spin con un filtro di MWCO PES 100.000 a 200-500 µ l. procedere al SEC o store il campione durante la notte a temperatura ambiente.

5. size exclusion Chromatography

  1. Equilibrare la colonna SEC collegata ad un sistema di cromatografia liquida con almeno 48 mL (due volumi di colonna) del buffer SEC ad una portata di 0,5 mL/min.
  2. Applicare il campione sulla colonna ed eseguire cromatografia ad una portata di 0,25 mL/min raccogliere 0.25 mL frazioni.
  3. Eseguire 10 µ l delle frazioni che corrispondono alle vette della traccia di assorbanza UV280nm su SDS-PAGE e li macchia di azzurro di Coomassie. Il primo picco principale contiene la F1-atpasi. Analisi delle frazioni corrispondenti a questo picco per la sensibilità di attività e azide idrolitica di ATP mediante il saggio dell'atpasi Pullman. Determinare la concentrazione di proteina dall'analisi di BCA.
  4. Mantenere la purificato F1-ATPasi a temperatura ambiente e utilizzarlo all'interno di 3 d dopo purificazione per applicazioni a valle. In alternativa, concentrare il campione con una colonna di spin con un filtro di MWCO PES 100.000 a > 1,5 mg / mL, precipitato e mescolandolo con solfato di ammonio saturo regolata a pH 8.0 (1.2 x il volume) e conservare a 4 ° C.

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Risultati

Una purificazione tipica (Figura 1) inizia con vescicole mitocondriale (mitoplasts) isolate sul gradiente di Percoll dal lisato hypotonically 1 x 1011 a 2 x 1011 prociclico di cellule di T. brucei 25 coltivate nello standard glucosio-ricco SDM-79 media27. I mitoplasts sono frammentati di sonicazione, filata, e il supernatante contenente matrice viene scartato. Le membrane mitocondr...

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Discussione

Il protocollo per F1-purificazione dell'atpasi da T. brucei è stato sviluppato precedentemente pubblicati basata su metodi per l'isolamento di F1-complessi di atpasi da altre specie13,14. Il metodo non richiede alcuna modificazione genetica (ad es., tagging) e produce un complesso completamente attivo con tutte le subunità presenti. Il punto cruciale è il rilascio di cloroformio-facilitato di F1-ATPasi dalla part...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dal Ministero di educazione ERC CZ concedere LL1205, la concessione di Grant Agency di Repubblica Ceca 18-17529S e dal FESR/FSE progetto centro per la ricerca di patogenicità e virulenza dei parassiti (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Sostanze chimiche
Adenosina difosfato sale disodico (ADP)ApplichemA0948
Amastatina cloridratoGlantham Life SciencesGA1330
Acido aminocaproicoApplichemA2266
Kit per il dosaggio delle proteine BCAThermoFischer Scientific/Pierce23225
Benzamidina cloridratoCalbiochem199001
Bestatina cloridratoSigma Aldrich/MerckB8385
CloroformioQualsiasi fornitore
cOmplete Compresse, Mini senza EDTARoche4693159001Proteasi inibitore della proteasi compresse
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)Qualsiasi fornitore
Acido cloridricoQualsiasi fornitorePer la regolazione del pH
Ile-Pro-IleSigma Aldrich/MerckI9759Alias Diprotin A
LeupeptinSigma Aldrich/MerckL2884
Solfato di magnesio eptaidratoQualsiasi fornitore
Pepstatin ASigma Aldrich/MerckP5318
Proteina Sistema di elettroforesiQualsiasi fornitore
Cloruro di sodioQualsiasi fornitore
SaccarosioQualsiasi fornitore
TrisQualsiasi fornitore
NameCompanyNumero di catalogoComments
Consumabili
Provette da centrifuga per SW60Ti, poliallomeroBeckman Coulture328874
DounceTissues Omogeneizzatore 2 mLQualsiasi fornitore
Dispositivo di filtrazione sottovuoto in vetroSartorius516-7017Soluzioni di degasaggio per cromatografia liquida
HiTrap Q HP, 5 mLGE Healthcare Life Sciences17115401Colonna per cromatografia a scambio anionico
Regenaretad Filtri a membrana in cellulosa, dimensione dei pori 0,45 & mu; m, diametro 47 mmSartorius18406--47------NSoluzioni di degasaggio per cromatografia liquida
Superdex 200 Aumento 10/300 GLGE Healthcare Life Sciences29091596Colonna per cromatografia ad esclusione dimensionale
Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PESSartoriusVS0641
NomeAzienda Numero di catalogoComments
Equipment
AKTA Pure 25GE Healthcare Life Sciences29018224O sistema FPLC simile
Spettrofotometro Shimadzu UV-1601ShimadzuO spettrofotometro simile con modalità di analisi cinetica
Ultracentrifuga Beckman Optima con SW60Ti Beckman CoultureO ultracentrifuga e rotore simili
con sonda sottile, modello 3000BioLogics0-127-0001O omogeneizzatore ad ultrasuoni simile
cocktail Omogeneizzatore ad ultrasuoni a rotore

Riferimenti

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