Questo protocollo descrive la purificazione di F1-ATPase dal palco dell'insetto colta di Trypanosoma brucei. La procedura produce un complesso altamente puro, omogeneo e attivo adatto per studi strutturali ed enzimatici.
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Articolo metodologico
Isolamento di F1-ATPasi dal Protista parassita Trypanosoma brucei
In questo articolo
Sommario
Abstract
F1-atpasi è una membrana-estrinseca ossidrilasico catalitica del F-tipo ATP sintasi, un enzima che utilizza la forza motrice protonica attraverso le membrane biologiche per la produzione di adenosina trifosfato (ATP). L'isolamento del intatta F1-ATPasi dalla sorgente nativo è un prerequisito essenziale per caratterizzare la composizione proteica, parametri cinetici e sensibilità agli inibitori dell'enzima. Un altamente puro e omogeneo F1-ATPasi possono essere utilizzato per studi strutturali, che forniscono la comprensione nei meccanismi molecolari di sintesi di ATP e idrolisi. In questo articolo viene descritta una procedura per la purificazione del F1-ATPase dal Trypanosoma brucei, l'agente causativo di trypanosomiases africano. F1-atpasi è isolato dalle vescicole mitocondriale, che sono ottenute da Lisi ipotonica da in vitro coltivate trypanosomes. Le vescicole sono frammentate meccanicamente di sonicazione e la F1-ATPasi viene rilasciato dalla membrana mitocondriale interna mediante l'estrazione di cloroformio. Il complesso enzimatico viene ulteriormente purificato di scambio anionico consecutivi e la cromatografia di esclusione dimensionale. Tecniche di spettrometria di massa sensibile ha mostrato che il complesso purificato è privo di contaminanti virtualmente qualsiasi proteina e, pertanto, rappresenta il materiale adatto per la determinazione della struttura di cristallografia a raggi x o cryo-microscopia elettronica. L'isolato F1-ATPasi esibisce attività idrolitica di ATP, che può essere inibito completamente da sodio azide, un potente inibitore delle F-tipo ATP sintasi. Il complesso purificato rimane stabile e attiva per almeno tre giorni a temperatura ambiente. Precipitazione con solfato di ammonio è usato per immagazzinaggio a lungo termine. Procedure simili sono state usate per la purificazione di F1- atpasi da tessuti di mammiferi e vegetali, lieviti o batteri. Così, il protocollo presentato può servire come guida per la F1-isolamento dell'atpasi da altri organismi.
Introduzione
I tipo F ATP sintasi sono membrana-limitano rotanti complessi multiproteici tale traslocazione del protone di coppia attraverso le membrane trasduzione di energia dei batteri, i mitocondri e cloroplasti con la formazione di ATP. Dettagli molecolari del meccanismo di rotazione di sintesi di ATP sono noti principalmente a causa di studi strutturali di purificato batterica e mitocondriale ATP sintasi e loro subcomplexes1. F-tipo trifosfato di adenosina synthase è organizzato in membrana-intrinseche ed estrinseche-membrana moiety. Parte della membrana-estrinseco, nota come F1-atpasi, contiene tre siti catalitici, dove si verifica la fosf....
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Protocollo
1. tamponi e soluzioni
- Preparare le soluzioni elencate di seguito. Degassare tutti i buffer per cromatografia liquida. Aggiungere gli inibitori di proteasi, benzamidine e ADP appena prima dell'uso.
- Preparare il tampone di buffer a: 50 mM Tris con acido cloridrico (Tris-HCl) pH 8.0, saccarosio 0,25 M, 5 mM benzamidine, 5mm aminocaproico acido (ACA) e proteasi inibitori (10 amastatin µM, 50 µM Bestatina, 50 µM pepstatina, 50 µM leupeptina e 50 µM diprotin A).
- Preparare di tampone b: 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.25 M saccarosio, acido etilendiamminotetracetico 4mm (ed), 5 mM benzamidine, 5mm ACA, 1mm ADP e inibitori della proteasi (10 amastatin µ....
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Risultati
Una purificazione tipica (Figura 1) inizia con vescicole mitocondriale (mitoplasts) isolate sul gradiente di Percoll dal lisato hypotonically 1 x 1011 a 2 x 1011 prociclico di cellule di T. brucei 25 coltivate nello standard glucosio-ricco SDM-79 media27. I mitoplasts sono frammentati di sonicazione, filata, e il supernatante contenente matrice viene scartato. Le membrane mitocondr.......
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Discussione
Il protocollo per F1-purificazione dell'atpasi da T. brucei è stato sviluppato precedentemente pubblicati basata su metodi per l'isolamento di F1-complessi di atpasi da altre specie13,14. Il metodo non richiede alcuna modificazione genetica (ad es., tagging) e produce un complesso completamente attivo con tutte le subunità presenti. Il punto cruciale è il rilascio di cloroformio-facilitato di F1-ATPasi dalla part.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dal Ministero di educazione ERC CZ concedere LL1205, la concessione di Grant Agency di Repubblica Ceca 18-17529S e dal FESR/FSE progetto centro per la ricerca di patogenicità e virulenza dei parassiti (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sostanze chimiche | |||
| Adenosina difosfato sale disodico (ADP) | Applichem | A0948 | |
| Amastatina cloridrato | Glantham Life Sciences | GA1330 | |
| Acido aminocaproico | Applichem | A2266 | |
| Kit per il dosaggio delle proteine BCA | ThermoFischer Scientific/Pierce | 23225 | |
| Benzamidina cloridrato | Calbiochem | 199001 | |
| Bestatina cloridrato | Sigma Aldrich/Merck | B8385 | |
| Cloroformio | Qualsiasi fornitore | ||
| cOmplete Compresse, Mini senza EDTA | Roche | 4693159001 | Proteasi inibitore della proteasi compresse |
| Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) | Qualsiasi fornitore | ||
| Acido cloridrico | Qualsiasi fornitore | Per la regolazione del pH | |
| Ile-Pro-Ile | Sigma Aldrich/Merck | I9759 | Alias Diprotin A |
| Leupeptin | Sigma Aldrich/Merck | L2884 | |
| Solfato di magnesio eptaidrato | Qualsiasi fornitore | ||
| Pepstatin A | Sigma Aldrich/Merck | P5318 | |
| Proteina Sistema di elettroforesi | Qualsiasi fornitore | ||
| Cloruro di sodio | Qualsiasi fornitore | ||
| Saccarosio | Qualsiasi fornitore | ||
| Tris | Qualsiasi fornitore | ||
| Name | Company | Numero di catalogo | Comments |
| Consumabili | |||
| Provette da centrifuga per SW60Ti, poliallomero | Beckman Coulture | 328874 | |
| DounceTissues Omogeneizzatore 2 mL | Qualsiasi fornitore | ||
| Dispositivo di filtrazione sottovuoto in vetro | Sartorius | 516-7017 | Soluzioni di degasaggio per cromatografia liquida |
| HiTrap Q HP, 5 mL | GE Healthcare Life Sciences | 17115401 | Colonna per cromatografia a scambio anionico |
| Regenaretad Filtri a membrana in cellulosa, dimensione dei pori 0,45 & mu; m, diametro 47 mm | Sartorius | 18406--47------N | Soluzioni di degasaggio per cromatografia liquida |
| Superdex 200 Aumento 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 29091596 | Colonna per cromatografia ad esclusione dimensionale |
| Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES | Sartorius | VS0641 | |
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Equipment | |||
| AKTA Pure 25 | GE Healthcare Life Sciences | 29018224 | O sistema FPLC simile |
| Spettrofotometro Shimadzu UV-1601 | Shimadzu | O spettrofotometro simile con modalità di analisi cinetica | |
| Ultracentrifuga Beckman Optima con SW60Ti | Beckman Coulture | O ultracentrifuga e rotore simili | |
| con sonda sottile, modello 3000 | BioLogics | 0-127-0001 | O omogeneizzatore ad ultrasuoni simile |
Riferimenti
- Walker, J. E. Structure, mechanism and regulation of ATP synthases. Mechanisms of Primary Energy Transduction in Biology. Wikström, M. , The Royal Society of Chemistry. Croydon, UK. 338-373 (2017).
- Pullman, M. E., Penefsky, H. S., Datta, A., Racker, E.
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Ristampe e permessi
