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Articolo metodologico

Sistema di coltura cellulare 3D per studiare l'invasione e la valutazione terapeutica nel cancro della vescica

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DOI:

10.3791/58345

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13 settembre 2018

 ,  ,  , 
1Departments of Internal Medicine, Hematology/Oncology Division, Rogel Cancer Center, University of Michigan Medical Center, 2Department of Urology, Division of GU Oncology, Rogel Cancer Center, University of Michigan Medical Center, 3Departments of Surgery and Pathology, Perlmutter Cancer Center, NYU Langone Health

In questo articolo

Sommario

I processi che governano l'invasione della vescica cancro rappresentano opportunità di biomarcatore e sviluppo terapeutico. Qui vi presentiamo un modello di invasione del cancro della vescica che incorpora 3-d cultura di sferoidi di tumore, time-lapse imaging e microscopia confocale. Questa tecnica è utile per definire le caratteristiche del processo invasivo e per lo screening di agenti terapeutici.

Abstract

Cancro alla vescica è un problema significativo per la salute. Si stima che più di 16.000 persone moriranno quest'anno negli Stati Uniti dal cancro alla vescica. Mentre il 75% dei cancri alla vescica sono non-invasivo e rischiano di riprodurrsi per metastasi, circa il 25% progredire ad un modello di crescita dilagante. Fino a metà dei pazienti con i tumori invasivi si svilupperà letale ricaduta metastatica. Così, la comprensione del meccanismo della progressione invasiva nel cancro alla vescica è fondamentale prevedere gli esiti dei pazienti e prevenire le metastasi letale. In questo articolo, presentiamo un modello di invasione del tridimensionale che permette l'incorporazione delle cellule del tumore e componenti stromal di imitare in vivo le condizioni che si verificano nel microambiente del tumore della vescica. Questo modello offre l'opportunità di osservare il processo invasivo in tempo reale usando la formazione immagine di time-lapse, interrogare le vie molecolari coinvolte utilizzando composti immunofluorescenti confocal di formazione immagine e schermo con il potenziale di invasione di blocco. Mentre questo protocollo si concentra sul cancro della vescica, è probabile che simili metodi potrebbero essere utilizzati per esaminare l'invasione e la motilità in altri tipi di tumore.

Introduzione

L'invasione è un passaggio fondamentale nella progressione del cancro, che è richiesto per la metastasi ed è associata con la bassa sopravvivenza e prognosi in pazienti. Nel cancro alla vescica umano, la neoplasia più comune dell'apparato urinario che provoca circa 165.000 morti all'anno in tutto il mondo, la fase di cancro, il trattamento e la prognosi sono direttamente correlati alla presenza o all'assenza di invasione1. Circa il 75% dei casi di cancro alla vescica sono non muscolo-invasivo e sono gestiti con resezione locale. Al contrario, i tumori della vescica muscolo-invasivo (circa il 25% dei casi) sono tumori aggressivi con gli alti tassi metastatici e sono trattati con terapia aggressiva di multimodality2,3. Di conseguenza, capire le vie molecolari che attivano l'invasione è essenziale per caratterizzare meglio il rischio di progressione invasiva e sviluppare interventi terapeutici che possono impedire la progressione invasiva.

Progressione invasiva del tumore si verifica in un ambiente complesso tridimensionale (3D) e comporta l'interazione delle cellule del tumore con altre cellule del tumore, stroma, membrana basale e altri tipi di cellule compreso le cellule immuni, fibroblasti, cellule muscolari e vascolari cellule endoteliali. Supporto permeabile (ad es., Transwell) sistemi di dosaggio sono comunemente impiegati per quantificare il cancro delle cellule invasione4, ma questi sistemi sono limitati perché non consentono al microscopio di monitoraggio del processo di invasione in tempo reale e la recupero dei campioni per ulteriori macchiatura e l'analisi molecolare è impegnativo. Sviluppo di un sistema di sferoide di tumore della vescica 3D per studiare invasione è auspicabile perché permette l'incorporazione di componenti microambientali definiti con la convenienza di sistemi in vitro .

In questo protocollo, descriviamo un sistema per interrogare i processi invasivi delle cellule di cancro alla vescica umano usando un'analisi di invasione di sferoide 3D che incorporano le matrici gel a base di collagene e microscopia confocale per consentire ai ricercatori di monitorare la motilità cellulare e invasione in tempo reale (Figura 1A). Questo sistema è versatile e può essere modificato per interrogare le varie impostazioni/tumore stromal. E ' possibile incorporare la maggior parte delle linee cellulari di cancro della vescica o tumori della vescica primario e altre cellule stromal come cancro associato fibroblasti e cellule del sistema immunitario5,6,7. Questo protocollo descrive una matrice composta da collagene di tipo 1, ma può essere modificato per incorporare altre molecole quali fibronectina, laminina o altre proteine di collagene. Processi invasivi possono essere seguiti per 72 h o più a seconda della capacità del sistema utilizzato e microscopio. Fissazione e colorazione di immunofluorescenza del tumore incorporato nella matrice 3D, prima, durante e dopo l'invasione permette l'interrogatorio di sovraregolati proteine in cellule invasive, fornendo così informazioni cruciali che solitamente assenti o difficili da raccogliere utilizzo di altri modelli 3-d cultura. Questo sistema può essere utilizzato anche per composti di schermo che bloccano l'invasione e delineare vie di segnalazione colpite da tali composti.

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Protocollo

1. crescente cancro sferoidi

  1. Crescita da linee cellulari
    1. Cellule di cancro alla vescica umane cultura sotto aderente convenzionale delle condizioni di coltura di cellule e mantengono in incubatore a 37 ° C, fornito con 5% CO2. Mantenere le cellule a < confluency di 90%.
      Nota: mezzi di coltura utilizzati è di Dulbecco modificato supporto essenziale minimo (DMEM) contenente 4,5 g/L D-glucosio, L-Glutammina, piruvato di sodio di 110 mg/L e fornito con 10% siero bovino fetale (FBS) in tutto questo protocollo.
    2. Un giorno prima dell'inizio dell'esperimento, tripsinizzano (utilizzando 0,25% tripsina-EDTA) quantificare la concentrazione cellulare di cellule e distribuire 1 x 106 cellule in 3 mL di coltura in ciascun pozzetto di una piastra di attacco 6 pozzetti ultra-basso.
    3. Incubare le cellule in condizioni di attacco basso a 37 ° C per ≥ 16 h. Questo dovrebbe consentire tempo sufficiente per celle da aggregare in sferoidi per la maggior parte delle linee cellulari di cancro della vescica.
      Nota: La formazione di sferoidi possa essere osservata al microscopio invertito campo luminoso. La dimensione ottimale e il numero di sferoidi può dipendere da diversi esperimenti, ma troviamo che sferoidi con diametri da 50 µm a 150 µm sono generalmente adatti per time-lapse imaging utilizzando un obiettivo X 20.
    4. Per incorporare i tipi di cellule supplementari, come fibroblasti o cellule immuni in sferoidi, mescolare le cellule desiderate con le cellule tumorali al rapporto desiderato (1:1, 01:10, ecc.) in un allegato di ultra-basso piastra e incubare a 37 ° C per ≥ 16 h permettere la formazione di sferoidi di tipo misto delle cellule.
  2. Crescita da tumori primari
    Nota: Tumore sferoidi possono anche essere derivati dal tumore primario della vescica fonti quali i tumori sviluppati da indotto da agente della vescica tumore modelli8. Ad esempio, i tumori della vescica generati dai topi nutriti con N-butilico - N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamina (BBN), possono essere raccolte e tritato in piccoli pezzi (circa 0,5 mm3) utilizzando strumenti chirurgici sterili. Digerito campioni primari della vescica umana cancri possono essere studiati anche in questo sistema.
    1. Raccogliere e lavare i 0,5 mm3 pezzi di tumore in tampone fosfato salino di 5 mL ghiacciata (PBS). Centrifugazione a 200 x g per 5 min a 4 ° C. Ripetere questo passaggio di lavaggio una volta.
    2. Raccogliere i pezzi del tumore mediante centrifugazione a 200 x g per 10 min a 4 ° C. Rimuovere il supernatante e aggiungere 5 mL di DMEM contenente 10% FBS. Trasferite il composto di tumore sferoide e media ad una piastra di attacco 6 pozzetti ultra-basso. Incubare a 37 ° C per ≥ 16 h prima di incorporare nella matrice del collagene (Vedi punto 2.3).

2. preparazione della camera 3D cultura

  1. Diluire il collagene di tipo 1 (derivato dalla coda di topo) in DMEM contenente 10% FBS per fare una miscela di 2 mg/mL secondo le istruzioni del produttore.
    1. Insomma, mix collagene con adeguate quantità di soluzione di NaOH N 1 e DMEM pipettando delicato basate su istruzioni del produttore per raggiungere il pH fisiologico.
    2. Dopo la miscelazione del collagene e DMEM, rapidamente ricoprire i pozzi della diapositiva da camera (per la maggior parte delle applicazioni, diapositive di camera con un vetro di copertura numero 1.5 è ottimale) con la miscela di collagene-DMEM prima di solidificazione (200 µ l/pozzetto). Lasciar camera rivestita all'essere fermo a temperatura ambiente per 15 min.
      Nota: La composizione della matrice a base di collagene può essere modificata con l'aggiunta di altri ingredienti di matrice extracellulare, come fibronectina o laminina, secondo le finalità dell'esperimento.
  2. Delicatamente Dispensare 500 µ l di media che contengono sferoidi (o pezzi di tumore, se si utilizza un campione di tumore primario) dalla piastra di attacco 6 pozzetti ultra-basso in una microcentrifuga da 1,5 mL vuoto. Attendere 2 minuti per lasciare gli sferoidi depositano alla parte inferiore del tubo.
  3. Rimuovere con cautela il surnatante dal tubo. Preparare un altro tubo di collagene di tipo 1 (2 mg/mL) mescolato con DMEM contenente 10% FBS e rapidamente aggiungere 500 µ l di questa miscela di sferoidi. Mescolare delicatamente le sferoidi e collagene pipettando lento.
  4. Aggiungere 250 µ l di miscela di sferoidi/collagene in un pozzetto di diapositiva di collagene pre-rivestite da camera. Consentire la matrice di collagene che contengono sferoidi a solidificare completamente (circa 30 min a 37 ° C).
  5. Dopo che la matrice del collagene è solidificata, aggiungere 1 mL di DMEM contenente 10% FBS in ciascun pozzetto (Figura 1B). Incubare il vetrino di alloggiamento in un incubatore a 37 ° C fino al momento per l'imaging in dotazione con 5% CO2 .

3. live Cell Imaging time-lapse

  1. Accendere il microscopio confocale seguendo le istruzioni del produttore e assicurarsi che la camera climatica raggiunge i 37 ° C e viene fornita con 5% CO2.
    Nota: Il nostro microscopio e camera richiedono solitamente 1h per raggiungere l'equilibrio del sistema.
  2. Trasferire con cautela la diapositiva di alloggiamento per l'adattatore di diapositiva collegato al microscopio.
  3. Individuare le sferoidi di interesse utilizzando un obiettivo di bassa potenza (ad es., 5x) e avviare imaging con l'obiettivo di potenza più elevato (in protocollo attuale, un obiettivo X 20 è usato per la maggior parte dell'imaging cellule vive per la sua qualità di immagine migliore).
    Nota: Per i campioni di tumore primario della vescica, 5 X e 10 X gli obiettivi possono essere necessaria al fine di coprire la più grande area di imaging. Per il nostro Time-lapse imaging, l'intervallo di formazione immagine è impostato come 30 min e una pila di Z viene utilizzata per l'intero della sferoide di immagine. In genere la distanza tra le fette di Z è impostata a 4 µm per il 20X obiettivo e la distanza totale dell'asse Z è circa 200 µm. le immagini possono essere ottenute utilizzando DIC e con fluorescenza se cellule/tessuti harbor marcatori delle proteine fluorescenti.
  4. Eseguire imaging time-lapse per 24-72 h.
    Nota: La durata è determinata dal tipo di cella e le esigenze dell'esperimento.

4. preparazione del campione blocco contenente sferoidi di cancro per il taglio di tessuto congelato

  1. Sollevare con cautela il blocco di gel di collagene e sferoidi dalle diapositive camera usando il piccolo forcipe. Posizionare il blocco di gel di collagene in uno stampo di plastica istologia.
  2. Risciacquare il gel di collagene con 1x PBS brevemente e poi fissarlo con paraformaldeide al 4% (PFA) in PBS per 30 min a temperatura ambiente.
    Attenzione: PFA è potenziale cancerogeno e deve essere maneggiato con cura.
  3. Lavare il gel di collagene con 1,5 mL di PBS 1X su un agitatore per 15 min. Sostituisci il PBS e ripetere il passaggio precedente lavaggio 3 x.
  4. Applicare uno strato sottile (circa 3 mm) di temperatura di taglio ottimale (OCT) composto per coprire il fondo di uno stampo di plastica istologia nuovo. Posto fisso e gel di collagene in cima il OCT. lavato composto, quindi accuratamente incorporare il gel tutto riempiendo lo stampo con OCT composto, evitando la formazione di bolle d'aria nello strumento di personalizzazione.
  5. Lasciare lo stampo a 4 ° C per 1 h.
  6. Posizionare lo stampo contenente il campione e l'OCT composto su una piastra Petri 100 mm flottante su azoto liquido. Lasciare il campione flash-congelare completamente.
  7. Memorizzare il blocco campione congelato a-80 ° C per un uso futuro.

5. immunofluorescenza Imaging per cancro sezionato congelati sferoidi

  1. Trasferimento il blocco campione congelato dal congelatore-80 ° C alla camera di-20 ° C di un criostato.
  2. Eseguire la divisione surgelati convenzionale impostando l'intervallo di sezione a 7 µm. Lasciate che campioni sezionati allegare al vetrino senza rughe o intrappolata aria.
    1. Memorizzare le diapositive a-80 ° C prima di eseguire ulteriore colorazione.
      Nota: Diversi intervalli possono essere utilizzati per adattarsi alle esigenze sperimentali.
  3. Asciugare i vetrini per 1 h a temperatura ambiente.
  4. Permeabilize i campioni con PBS contenente 0.5% Triton X-100 per 15 min.
  5. Lavare i campioni 3 volte con PBS per 10 min a lavaggio.
  6. Circondano i campioni sulla diapositiva con barriere idrofobiche utilizzando una penna di barriera idrofoba.
  7. Trattare i campioni con soluzione bloccante (1x PBS contenente 5% albumina di siero bovino (BSA)), per 1 h a temperatura ambiente.
  8. Applicare 40 µ l di soluzione contenente anticorpo primario (1x PBS contenente 5% BSA con diluizione 1: 100 di anticorpo primario) per ogni campione sulla diapositiva.
  9. Incubare i vetrini in anticorpo primario a 37 ° C per 1 h o a temperatura ambiente durante la notte (il tempo di incubazione e le condizioni variano a seconda dell'anticorpo primario).
  10. Lavare i campioni 3 volte con PBS per 15 min (a lavaggio).
  11. Applicare 40 µ l di soluzione contenenti anticorpi secondari (1x PBS contenente il 5% di BSA con diluizione di 1: 300 anticorpo secondario) per ogni campione sulla diapositiva.
  12. Lavare i campioni 3 volte con PBS per 15 min (a lavaggio).
  13. Macchia con Hoechst 33342 soluzione (1 µ g/mL, diluito in PBS) i campioni a temperatura ambiente per 10 min. Quindi lavare campioni con PBS per 5 min.
  14. Montare i campioni con mezzo di montaggio e coprirli con dimensioni appropriate vetrini coprioggetto. Lasciare le diapositive al buio a temperatura ambiente per 24 h e quindi eseguire la microscopia confocale.

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Risultati

Creazione riuscita di sferoide di tumore cancro invasivo della vescica richiede la formazione di sferoidi di dimensioni del tumore da linee cellulari o tumori primari. Figura 2 A Mostra dimensioni appropriate sferoidi sviluppati da quattro linee di cellulari del cancro alla vescica umane in (UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, 253J e UM-UC18). Figura 2 B viene illustrato uno sferoide di tumore da un tumore...

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Discussione

Qui descriviamo un modello di sferoide di tumore 3D che permette l'osservazione in tempo reale di invasione di cancro della vescica, che è critica per metastasi e progressione del cancro. Questo sistema è favorevole all'incorporazione di varie componenti stromal e cellulare per consentire ai ricercatori di riepilogo meglio il microambiente del tessuto dove si svolge l'invasione del cancro della vescica. Sferoidi di cancro della vescica possono essere generati da varie fonti quali linee cellulari (compreso linee cellulari...

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Ringraziamenti

Gli autori vorrei ringraziare il laboratorio del Dr. Howard Crawford (Università del Michigan) per supporto tecnico e fornire materiali e attrezzature per questo studio e Alan Kelleher per il supporto tecnico.

Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni dalla University of Michigan Rogel Cancer Center Core Grant CA046592-26S3, NIH K08 CA201335-01A1 (PLP), bè YIA (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Linee cellulari di cancro della vescica umana UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J
Terreno di coltura cellulare DMEMThermo Fisher Scientific11995065
Siero fetale bovino Thermo Fisher Scientific26140079
Antibiotico-Antimicotico (100x)Thermo Fisher Scientific15240062
Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenoloThermo Fisher Scientific25200056
Albumina sierica bovina (BSA)Sigma-AldrichA3803
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,4 Thermo Fisher Scientific10010023
Costar Cluster a 6 pozzetti con attacco ultrabassoCorning3471
Microscopio invertito convenzionaleCarl Zeiss491206-0001-000Uso generale per colture cellulari e controllo degli sferoidi
Collagene di tipo 1 dalla coda di ratto, ad alta concentrazioneCorning354249
Nunc Lab-Tek II Coverglass cameratoThermo Fisher Scientific155382
Microscopio confocale Carl ZeissLSM800Un miscoscopio confocale con camera climatica, imaging multi-posizione e funzione di scansione Z-stack 
Micromtome CriostatoLeica BiosystemsCM3050 S
Zen 2 Software di elaborazione delle immagini Carl Zeiss
Soluzione di paraformaldeideMicroscopia elettronica Scienze15710
ImmEdge Barriera idrofobica PAPPen Vector Laboratories Composto H4000
O.C.T.Thermo Fisher Scientific23730571
soluzione Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific62249
Anticorpo Anti-ATDC (Trim29)Sigma-AldrichHPA020053
Anticorpo Anti-Citocheratina 14Abcamab7800
Anticorpo Anti-VimentinaAbcamab24525
ProLong Diamond Supporto di montaggio

Riferimenti

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