O9-1 è una linea di cellule neurali della cresta multipotenti del mouse. Qui descriviamo protocolli dettagliati passo-passo per la coltura delle cellule O9-1, O9-1 cellule differenziate in tipi cellulari specifici e manipolando geneticamente O9-1 cellule utilizzando siRNA-mediata atterramento o CRISPR-Cas9 editing genomico.
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Articolo metodologico
La coltura e la manipolazione di cellule della cresta neurale O9-1
In questo articolo
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Sommario
Abstract
Cellule della cresta neurale (NCCs) esegue la migrazione di cellule staminali multipotenti che possono differenziarsi in diversi tipi cellulari e dar luogo a più organi e tessuti. La linea cellulare O9-1 è derivata dall'endogeno del mouse NCCs embrionali e mantiene la sua multipotenza. Tuttavia, in condizioni di impostazioni cultura specifiche, O9-1 cellule possono differenziarsi in diversi tipi cellulari ed essere utilizzate in una vasta gamma di applicazioni di ricerca. Recentemente, con la combinazione di studi del topo e gli studi di O9-1 delle cellule, abbiamo dimostrato che l'ippopotamo effettori della via di segnalazione Yap e Taz svolgono i ruoli importanti nello sviluppo craniofacial di derivazione dalla cresta neurale. Anche se il processo coltivante per cellule O9-1 è più complicato rispetto a quella utilizzata per altre linee cellulari, la linea cellulare O9-1 è un potente modello per indagare NCCs in vitro. Qui, presentiamo un protocollo per la coltura la linea cellulare O9-1 per mantenere la sua staminalità, così come protocolli per la differenziazione di cellule O9-1 in tipi differenti delle cellule, quali cellule muscolari lisce e osteoblasti. Inoltre, vengono descritti protocolli per l'esecuzione di studi di perdita di funzione del gene in cellule O9-1 utilizzando CRISPR-Cas9 eliminazione e piccola interferenza RNA-mediata atterramento.
Introduzione
Cellule della cresta neurale (NCCs) sono cellule simil-staminali multipotenti con una notevole capacità migratorie ed esistenza transitoria durante lo sviluppo embrionale. NCCs provengono tra l'ectoderma superficiale e il tubo neurale e migra in altre parti dell'embrione durante lo sviluppo embrionale1. Basato sui loro domini funzionali, CNC possono essere classificati in vari tipi, tra cui cranica, tronco, vagale, sacra e NCCs cardiaco. Inoltre, NCCs possono differenziarsi in stirpi multipli delle cellule, quali cellule muscolari lisce, cellule ossee e neuroni e dar luogo a vari tessuti2,3
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Protocollo
1. preparazione prima di coltura cellulare O9-1
Nota: Basale media utilizzati per la coltura cellulare O9-1 deve sono stati condizionati da Sandos inbred topi tioguanina/uabaina-resistente (STO) del fibroblasto cellule di topo; di conseguenza, STO celle devono essere ottenuti e preparato come descritto di seguito prima di iniziare la coltura cellulare O9-1.
-
Cultura di cella attiva STO
- Preparare i supporti per coltura cellule attive STO facendo completa di Dulbecco modificato media dell'Aquila (DMEM) con 7% siero bovino fetale (FBS) (grado di cultura di cellule staminali embrionali), 100 U/mL penicillina....
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Risultati
L'obiettivo dei nostri esperimenti di atterramento e knockout era di studiare gli effetti di Yap e Taz perdita di funzione in cellule O9-1. Prima degli esperimenti di atterramento e knockoui, dobbiamo verificare che preparano per media basale e le cellule di cultura O9-1 come descritto sopra (ad esempio, alle esigenze di matrice della membrana dello scantinato per coprire tutta la piastra come mostrato nella Figura 1e O9-1 cellule recuperate.......
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Discussione
Il servizio NCC è un versatile e chiave collaboratore di diversi tessuti e organi durante la morfogenesi embrionale. La linea cellulare O9-1 mantiene la sua capacità di differenziarsi in molti tipi differenti delle cellule e imita le caratteristiche in vivo di CNC, rendendolo uno strumento utile in vitro per lo studio della funzione del gene e regolazione molecolare in CNC. La condizione differente delle cellule O9-1 può corrispondere a diversi dalla cresta neurale progenie in vivo, a seconda d.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Nicole Stancel, pH.d., ELS, di pubblicazioni scientifiche presso il Texas Heart Institute, ha fornito supporto editoriale. Ringraziamo anche le seguenti fonti di finanziamento: National Center scienziato Development Grant dell'American Heart Association (14SDG19840000 a J. Wang), il premio di ricerca di Lawrence 2014 dal Rolanette e Berdon Lawrence osso malattia programma del Texas (a Wang J. ) e il National Institutes of Health (DE026561 e DE025873 J. Wang, DE016320 e DE019650 di Maxson R.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cellule feeder STO ATTIVE | ATCC ATCC | CRL-1503 | Disponibile anche in forma di mitomicina C-inattivata, catalogo # ATCC 56-X |
| O9-1 linea cellulare della cresta neurale cranica di topo | Millipore Sigma | SCC049 | |
| DMEM, glucosio alto, senza glutammina | Gibco | 11960-044 | |
| DMEM, | iclone | SH30243.01 | |
| FBS (siero bovino fetale) | Millipore Sigma | ES-009-B | |
| Penicillina - streptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutammina 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Gelatina da pelle suina | Sigma | G1890 | |
| Tripsina-EDTA 0,25% in HBSS | Genesee Scientific | 25-510 | |
| DPBS (soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco) senza calcio o magnesio | Lonza | 17-512F | |
| MEM aminoacidi non essenziali (MEM NEAA) 100Xx | Gibco | 11140-050 | |
| Piruvato di sodio (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| 2-Mercaptoetanolo | Sigma | M-7522 | |
| ESGRO fattore inibitorio della leucemia (LIF) 106 unità/mL | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| Fattore di crescita dei fibroblasti umani ricombinante-basico (rhFGF-basic) | R& D Systems | 233-FB-025 | |
| Mitomicina C | Roche | 10107409001 | |
| matrice Matrigel | Corning | 356234 | |
| DMSO (dimetilsolfossido) | Millipore Sigma | MX1458-6 | |
| Lipofectamina RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| Opti-MEM I (1x) | Gibco | 31985-070 | |
| Terreno essenziale minimo, alfa 1x con sali di Earle, ribonucleosidi, desossiribonucleosidi, & L-glutammina | Corning | 10-022-CV | |
| ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA | Dharmacon | L-041057 | |
| ON-TARGETplus Pool non mirato | Dharmacon | D-001810 | |
| ON-TARGETplus Yap1 siRNA | Dharmacon | L-046247 | |
| FCS (siero fetale di vitello) | |||
| ITS (insulina-transferrina-selenio) | |||
| TGF-b3 | |||
| Acido ascorbico | |||
| BMP2 (proteina morfogenetica ossea 2) | |||
| Integratore | |||
| B-27 |
Riferimenti
- Achilleos, A., Trainor, P. A. Neural crest stem cells: discovery, properties and potential for therapy. Cell Research. 22 (2), 288-304 (2012).
- Le Douarin, N. M., Dupin, E. Multipotentiality of the neural crest. Current Opinion in Genetics and Development. 13 (5), 529-536 (2003).
- Santagati, F., Rijli, F. M.
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells
Posted by JoVE Editors on 11/30/2018. Citeable Link.
An erratum was issued for: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. The Protocol section was updated.
Step 2.1 was updated from:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
to:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 µM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
Step 5.1.1 was updated from:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.
to:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 µM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 µg/mL streptomycin.
Step 5.2.1 was updated from:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
to:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 µM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
Step 5.4.1 was updated from:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.
to:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.
