Un metodo automatizzato per determinare le prestazioni della drosofila in risposta a variazioni di temperatura nello spazio e nel tempo

Temperatura è un fattore ambientale costante che colpisce come organismi funzionano e comportano¹. Le differenze in latitudine e altitudine portano a differenze nel tipo di climi organismo sono esposti, che si traduce in selezione evolutiva per le loro risposte a temperatura^2,3. Gli organismi rispondono a diverse temperature attraverso adattamenti morfologici, fisiologici e comportamentali che massimizzano le prestazioni sotto loro particolari ambienti⁴. Per esempio, nel moscerino della frutta Drosophila melanogaster, popolazioni provenienti da diverse regioni hanno preferenze diverse temperatura, dimensioni del corpo, volte inerente allo sviluppo, longevità, fecondità e prestazioni a piedi a diverse temperature^{2 ,5,6,7}. La diversità osservata tra mosche di diverse provenienze si spiega in parte con variazione genetica ed espressione genica plastica^8,9. Allo stesso modo, specie di Drosophila provenienti da diverse aree distribuire in modo diverso tra i gradienti di temperatura e mostrare le differenze nella resistenza a calore estremo e freddo test^10,11,12.

Drosophila anche recentemente è diventato il modello di scelta per comprendere le basi genetiche e neurali della temperatura percezione^{13,14,15,16,17}. In generale, mosche adulte percepiscono temperatura mediante sensori di temperatura periferica caldi e freddi nelle antenne e sensori di temperatura nel cervello^{13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20}. i recettori di periferia per alte temperature express Gr28b.d¹⁶ o piressia²¹, mentre la periferia freddi recettori sono caratterizzati da Brivido¹⁴. Nel cervello, la temperatura viene elaborato dai neuroni che esprimono TrpA1¹⁵. Studi comportamentali su mutanti di queste vie sono migliorare la nostra comprensione di come la temperatura viene elaborato e dare spunti nei meccanismi che variano fra le popolazioni di Drosophila da diverse regioni.

Qui descriviamo una arena temperatura controllata che produce i cambiamenti di temperatura veloce e preciso. Gli investigatori possono pre-programmare questi cambiamenti, che consente per le manipolazioni di temperatura standardizzata e ripetibile senza intervento umano. Mosche sono registrati e monitorati con software specializzato per determinarne la posizione e la velocità nelle diverse fasi di un esperimento. La misura principale presentata in questo protocollo è la velocità di camminata a diverse temperature, perché è un indice ecologicamente rilevante di prestazione fisiologica che possa identificare adattabilità individuale termico⁵. Insieme a mutanti del recettore di temperatura, questa tecnica può aiutare a rivelare i meccanismi di adattamento termico a livello cellulare e biochimico.

1. preparazione di alimento Medium

1. Versare 1 L di acqua di rubinetto in un bicchiere di vetro 2L e aggiungere un ancoretta magnetica. Mettere il bicchiere su un piatto caldo magnetico a 300 ° C fino a quando non viene raggiunta la temperatura di ebollizione.
2. Mescolare a 500 giri/min e aggiungere il seguente: 10 g di agar, 30 g di glucosio, 15 g di saccarosio, 15 g di farina di mais, 10 g di germe di grano, 10 g di farina di soia, 30 g di melassa e 35 g di attivo lievito secco.
3. Quando il mix schiume vigorosamente, abbassare la temperatura della piastra calda a 120 ° C continuando a mescolare.
4. Girare la piastra calda temperatura ulteriormente fino a 30 ° C dopo 10 min e continuare a mescolare fino a quando la miscela si raffredda a 48 ° C. Misurare la temperatura inserendo un termometro direttamente il cibo senza toccare le pareti del bicchiere.
5. Sciogliere 2 g di estere metilico dell'acido p-idrossi-benzoico in 10 mL di etanolo al 96% e aggiungerlo al mix, insieme a 5 mL di acido propionico 1m. Continuare a mescolare per 3 min.
6. Spegnere la piastra calda e versare 45 mL di cibo nel allevamento bottiglie e 6,5 mL di cibo nei flaconi di raccolta.

2. preparazione di mosche

1. Posto 20 maschi e 20 femmine vola nelle bottiglie allevamento contenente 45 mL di mezzo di volare. Trasferire le mosche a nuove bottiglie dopo 3 o 4 giorni toccando loro giù e poi li nelle bottiglie fresche. Scartare le mosche dopo tre modifiche.
   1. Posizionare le bottiglie all'interno dell'incubatrice sotto 12-h luce/12-h cicli scuri con una temperatura costante di 25 ° C.
      Nota: Una nuova generazione di mosche sarà eclose dopo dieci giorni.
2. Anestetizzare appena obtecta mosche sui rilievi di anidride carbonica per un massimo di 4 min e raccoglierli in fiale di allevamento volare 2.5 x 9.5 cm con 6,5 mL di terreno di volare utilizzando un pennello.
   1. Raccogliere solo Vergine mosche e separarli dal sesso in gruppi di 20 mosche al flaconcino di allevamento.
   2. Posizionare le fiale all'interno di incubatori per 5-7 giorni, cambiando le mosche a new Fiale ogni 2-3 giorni e nei giorni che precedono gli esperimenti.

3. cornice di luci

1. Fare un telaio in legno di 10 cm di lunghezza, 4 cm di larghezza, altezza 4 cm e 0,5 cm di spessore.
2. Su ciascuno dei lati corti, creare un bordo di 4 cm di lunghezza, 4 cm di altezza e larghezza di 1,5 cm verso l'interno area del telaio in legno. Lasciare la faccia interna del bordo aperto.
3. Praticare due fori di diametro di 0,5 cm all'intersezione di uno dei bordi lunghi del telaio in legno e in ciascuna delle frontiere presso i bordi corti.
4. Posto 10 cm di una striscia di LED bianca calda all'interno di ognuna delle frontiere sui bordi corti. Sbucciare il retro della striscia LED per incollarla immediatamente.
   Nota: Per gli esperimenti in cui illuminazione dovrà essere eliminato, può essere sostituito con la striscia di LED bianca calda LED infrarossi strisce.
5. Collegare un'estremità della striscia LED in uno dei bordi per l'alimentazione elettrica di commutazione e sua altra estremità verso la striscia di LED sul bordo opposto.
6. Accendere l'alimentazione elettrica di commutazione per verificare che entrambe le strisce LED si accende.
7. Coprire il lato aperto di ciascun bordo con un pezzo di carta bianca.
8. Incollare un altro pezzo di carta per ciascuna delle fasi interne dei bordi lunghi.

4. temperatura controllata Arena

1. Accendere l'arena a temperatura controllata (Figura 1A e 1C). Assicurarsi che la ventola inizia a funzionare e l'anello di alluminio si scalda.
2. Utilizzare un cavo USB per collegare l'arena temperatura controllata al computer di controllo che esegue lo script di TemperaturePhases con le sequenze di temperatura.
3. Aprire lo script di TemperaturePhases nel computer di controllo e verificare che la sequenza di temperatura sia impostata correttamente (Video 1).
   1. Verificare che la durata di ogni fase sperimentale è impostata su 60 s verificando che "par. StimulusDur"è uguale a 60 s.
   2. Controllare che il numero 1) uguale al numero di fasi, 2) iterativi ON/OFF set-up della luce rossa indicativa diodi (LED), aumento di temperatura 3) 2 ° C per fase, desiderato e 4) 16 ° C come temperatura di partenza sono tutte corrette sotto "Start sperimentale sezione di blocco".
      Nota: Lasciare le mosche di acclimatare all'Arena Vola per 7 min a 16 ° C per evitare un aumento artificiale delle velocità durante le prime fasi sperimentali (Figura 2).
   3. Eseguire lo script TemperaturePhases . Il software verrà inizializzato per 5 secondi come determinato nella "arena. Attendere"e poi si fermano.
   4. Premere la barra spaziatrice della tastiera per iniziare l'esecuzione delle fasi sperimentali, una volta che una Mosca è stata soffiata nell'Arena volare (punto 5.3).
      Nota: Il TemperaturePhases è lo script corrente controllando la casella; Tuttavia, è possibile creare altri script personalizzati per utilizzare questo dispositivo per regolare i requisiti di diversi esperimenti.
4. Collegare la fotocamera in cima l'arena per il computer di registrazione utilizzando il cavo USB della fotocamera.
5. Aprire il programma di registrazione video (Vedi Tabella materiali) del computer di registrazione selezionando "File | Nuova registrazione filmato". Si aprirà una schermata che mostra l'immagine dalla fotocamera.
   1. Assicurarsi che l'immagine della telecamera cattura tutti i bordi dell'arena e i LED rossi indicativi.
   2. Avviare la registrazione premendo il pulsante rosso al centro del bordo inferiore dello schermo che mostra l'immagine della telecamera dopo aver impostato il telaio delle luci intorno all'arena (punto 5.4).
      Nota: piccoli cambiamenti nell'illuminazione può influenzare la precisione del tracking. Si consiglia di mantenere costante l'illuminazione dell'arena temperatura controllata fissando la posizione dell'apparato.

5. temperatura esperimenti comportamentali

1. Preparare l'Arena Vola (Figura 1).
   1. Mettere un filo di nastro conduttivo bianco nella parte superiore le tegole di rame, garantendo che tutti i bordi sono coperti.
   2. Posizionare l'anello di alluminio riscaldata intorno le tegole di rame. Il bordo dell'anello si adatta perfettamente intorno le tegole di rame così si trova sempre nella stessa posizione.
   3. Pulire il vetro con un panno pulito e posizionarlo sulla parte superiore l'anello di alluminio, lasciando un buco attraverso il quale una Mosca può essere saltata in.
      Nota: Prima degli esperimenti, ricoprire il coperchio di vetro con l'agente di siliconatura per creare una superficie scivolosa. Applicare l'agente siliconatura per 24 h e sciacquarlo con acqua prima dell'uso.
2. Eseguire lo script TemperaturePhases (punto 4.3.3) e aprire il programma di registrazione video (punto 4.5).
3. Colpo al volo da un flaconcino di allevamento (punto 2.2.2) nell'Arena Vola (ad es., 1 maschio volare nella Figura 3).
   1. Prendere un flacone di mosche dall'incubatrice, toccare due volte per costringerli ad andare fino in fondo, intercettare una Mosca con un aspiratore di bocca e chiudere la fiala e rimetterlo in incubatrice.
   2. Posto al volo nell'arena attraverso il divario che è stato lasciato tra la copertura in vetro e alluminio anello (punto 5.1.3).
   3. Colmare il divario tra la copertura in vetro e alluminio anello spingendo il coperchio di vetro fino a quando non viene raggiunto il bordo dell'anello in alluminio, non appena la Mosca è stato introdotto nell'Arena di volare.
4. Posizionare il telaio delle luci intorno all'arena per garantire illuminazione simmetrica.
   1. Contrassegnare la posizione (ad es., usando un pennarello indelebile) del telaio di luci intorno all'Arena di volare (Figura 1) per garantire che il telaio è sempre posizionato nella stessa posizione.
5. Avviare la registrazione con il programma di registrazione video (punto 4.5.2) e premere la barra spaziatrice sulla tastiera del computer di controllo per iniziare l'esecuzione delle fasi sperimentali (passo 4.3.4).
6. Fasi sperimentali dopo tutto finiti, salvare il video in formato. MP4 o AVI e rimuovete il fly dall'Arena Vola con l'aspiratore di bocca.
   Nota: La fine delle fasi sperimentali può essere determinata da entrambi i LED rossi indicativi vengono disattivati o l'arresto di script di TemperaturePhases .
   1. Interrompere la registrazione premendo il pulsante di stop al centro del bordo inferiore dello schermo nel programma di registrazione video. Premere "File | Salva con nome"per salvare il video.

6. video di rilevamento e analisi dei dati

1. Utilizzare il FlySteps (Video 2) software di monitoraggio per monitorare i video.
   1. Aprire il "configuration_file.ini" all'interno della cartella "FlyTracker".
   2. Impostare il percorso dei video in "video_folder" e i nomi dei video in "video_files".
   3. Specificare i bordi dell'Arena volare in "arena_settings" basato su (x, y) le coordinate in pixel di più punti ai margini dell'arena.
   4. Specificare la posizione dei LED rossi indicativo in "led_settings" basato su (x, y) le coordinate in pixel della posizione del centro dei LED.
   5. Controllare la posizione dei bordi dell'Arena volare impostando "debug" su "true" in "arena_settings", cliccando su "Salva" e in esecuzione lo script nel terminale. Una cattura dello schermo del video verrà visualizzata con un quadrato blu formato dalle coordinate immessi in "arena_settings".
      Nota: Questa piazza non circonda l'area da rilevare.
   6. Modificare "debug" in "arena_settings" a "false", fare clic su "Salva" ed eseguire ancora una volta sullo schermo nel terminale.
      Nota: Questo avvierà il processo di rilevamento.
      Nota: Mosche possono camminare fuori della zona di rilevamento sull'anello di alluminio riscaldata. Questo accade durante i primi secondi di un esperimento, dopo di che mosche smettere di toccare l'anello riscaldata e rimangono all'interno dell'area di rilevamento.
      Nota: Il video può essere rintracciato con altri software di monitoraggio in base alle preferenze dello sperimentatore.
2. Uso (x, y) posizione di ogni fly fornito dal software di monitoraggio per calcolare la misura di interesse per le prestazioni di temperatura. Script personalizzati (ad es., FlyStepsAnalysis in integrativa) può essere utilizzato.
3. Confrontare le curve di prestazione di temperatura dei vari gruppi a volare utilizzando misurazioni ripetute (RM) analisi della varianza (ANOVA) e post-hoc confronti multipli utilizzando il software statistico (Vedi Tabella materiali).

L'arena a temperatura controllata (Figura 1A) è costituito da tre tegole di rame cui la temperatura può essere autonomamente attraverso un circuito programmabile. Ogni piastrella rame possiede un sensore di temperatura che fornisce un feedback al circuito programmabile. Il circuito si attiva un alimentatore per aumentare la temperatura di ogni piastrella. Elementi passivi termoelettrici fungono da elementi di riscaldamento costante per mantenere la temperatura desiderata, mentre un dissipatore di calore raffreddato da una ventola garantisce il raffreddamento costante. L'entità della variazione di temperatura determina la velocità del processo in modo non lineare. Un aumento di 2 ° C richiede solo 0,1 s e un aumento di 18 ° C richiede 4 s. Uno schermo collegato al circuito programmabile (Figura 1) informa l'utente della temperatura misurata dai sensori di temperatura in ciascuna delle piastrelle. Le tegole di rame sono circondate da un anello di alluminio costantemente riscaldato a 50 ° C (Figura 1B e 1C) di semiconduttori intorno alla periferia. Questo anello forma i bordi dell'Arena volare (Figura 1), l'area in cui mosche devono essere inseriti. L'Arena di volare è coperto da un coperchio di vetro siliconato (Figura 1A e 1C), che fornisce uno spazio alto 3 mm, che assicura che le mosche possono camminare ma non volare. Nei pressi dell'Arena di volare sono due LED rossi (Figura 1) che può essere programmato per contrassegnare diverse fasi sperimentali. Ad esempio, per i risultati mostrati in Figura 2A, ogni LED è associato con una temperatura diversa, mentre in Figura 2B, ogni LED indica 60 s. Il software FlySteps può registrare quando ciascuno dei LED indicativo è acceso, e il ricercatore può quindi utilizzare queste informazioni per determinare automaticamente le fasi sperimentali, basate sulla temperatura o del tempo.

L'arena di temperatura controllata può essere utilizzato per confrontare la risposta comportamentale di mosche dal diverso background genetico alle variazioni di temperatura dinamico. Ad esempio, mosche da specie diverse possono essere esposti ad aumentare gradualmente le temperature (Figura 3) per confrontare le differenze di prestazioni termiche. La velocità di tutte le specie aumenta come aumenta la temperatura fino a raggiungere un punto di massime prestazioni, dopo di che esso decadde e perirono. Tuttavia, ogni specie ha una curva di risposta particolare con velocità di risposta massima specifica e tolleranze termiche. Rapporti precedenti hanno indicato che Drosophila appartenenti a specie diverse differiscono tra temporizzazione inerente allo sviluppo, longevità, fecondità, dimensioni del corpo, comunicazione sessuale e temperatura tolleranza3,6,7 ,8,22. Così, la nostra descrizione di locomozione specie-specifici in un gradiente di temperatura aggiunge a questo corpo di lavoro.

L'arena di temperatura controllata è utilizzabile anche per esplorare la risposta condizionata esperimenti basati sulla temperatura. La forma più semplice di questo approccio è un paradigma di condizionamento in cui mosche sono addestrati a preferire un lato dell'arena sopra l'altro, dal riscaldamento fino al lato che sarà evitato23,24,25. Siamo esposti singoli mosche a 40 ° C nel mezzo e una delle piastrelle del lato, lasciando l'altra tessera di lato a un confortevole 22 ° C (Figura 4). Selvaggio-tipo mosche rapidamente ha smesso di muoversi lungo l'arena e rimasero in posizione confortevole. Al contrario, il mutante di memoria classico Dunce tenuto ad esplorare l'arena e speso meno tempo che i controlli in posizione confortevole. Le differenze tra prestazioni delle mosche wild type e mutanti somaro è diventato più grande, quando tutte le tessere sono state impostate a 22 ° C e i confronti sono stati fatti fra i gruppi di trattamento. Dunce mutanti inoltre ha mostrato maggiori differenze tra le fasi di prova e di addestramento in confronto le mosche di selvaggio-tipo (Figura 4). Questi risultati suggeriscono un effetto di memoria sulle restanti in posizione confortevole.

Combinazioni di temperatura e la posizione sono anche utili per comprendere la funzione dei recettori di temperatura diversa durante i cambi di temperatura dinamico. Siamo esposti singoli mutanti di d. melanogaster Gr28b.d e TrpA1GAL4 di aumento delle temperature (2 ° C aumentare ogni 60 s) fornendo al contempo una posizione confortevole a 22 ° C (Figura 5). La confortevole posizione spostata da sinistra a destra e viceversa, per ogni iterazione. I risultati mostrano che i mutanti di Gr28b.d di periferia temperatura del ricevitore si comportano come il controllo, come si spendono più tempo nella posizione confortevole mentre la temperatura aumenta. Tuttavia, cervello temperatura recettore TrpA1GAL4 mutanti non sono interessati da aumento delle temperature e non cambiare la loro posizione nell'arena. Gli aumenti e diminuzione nella curva di TrpA1GAL4 mutanti mostrano l'effetto in mosche che erano già seduti in posizione confortevole prima è diventato comodo e rimase là durante quella fase. La consistenza delle cime e valli della curva di TrpA1GAL4 suggeriscono che queste mosche sono rimasto ancora per la maggior parte dell'esperimento; quindi, sono stati contati costantemente quando la loro posizione era quello considerato confortevole. Questa conclusione è stata confermata mediante ispezione visiva dei video registrati. Questi risultati sostengono precedenti rapporti fisiologici che suggeriscono quella percezione di periferia di cambiamenti veloci e grandi non dipende Gr28b.d17 e che mosche possiedono un meccanismo centrale principale alla temperatura di senso basato su TrpA1 14,21.

Figura 1: diagramma di temperatura controllata-arena. (A) vista laterale dell'arena temperatura controllata. Un circuito programmabile si connette un sensori di temperatura e di fornitura di energia ai corpi scaldanti sotto tegole di rame per controllare la loro temperatura. Piastrelle sono costantemente raffreddati tramite un dissipatore di calore collegato ad un ventilatore. Un anello di alluminio riscaldata su cui poggia una copertura in vetro circonda le piastrelle. (B) thermal imaging mostrando le piastrelle impostato a 24 ° C (in alto) e piastrelle laterali a 24 ° C con una piastrella centrale a 30 ° C (in basso). (C) una vista superiore dell'arena. Una telecamera registra le tegole di rame, anello di alluminio e LED rossi, quindi determina automaticamente le fasi sperimentali. Uno schermo nell'angolo della finestra, non registrate dalla fotocamera, Visualizza la temperatura attuale di piastrelle. (D) anello di luce: due strisce di LED bianchi caldi all'interno di una scatola di legno coperta nel white paper provvedono ad un'illuminazione simmetrica e costante dell'intera arena. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: mosche devono acclimatare all'arena prima di iniziare il protocollo temperatura. (A) singoli mosche maschii sono stati introdotti nell'Arena e permesso di esplorare a una costante 16 ° C per 1 min, dopo di che la temperatura ha cominciato aumentare. (B) singolo mosche esposti a 16 ° C, 20 ° C e 24 ° C (nessuna differenza del gruppo; F di ANOVA a due vie (2.570) = 4.156, p = 0,162) hanno una locomozione superiore all'inizio dell'esperimento che dopo 5 min (a due vie RM ANOVA F (9.570) = 7.803, p < 0,0001). Dati sono la media e l'errore standard della media (± SEM) dei 20 mosche femminile Vergine 5 a 7 giorni vecchi testati di più giorni. Asterisco indica una differenza significativa tra i gruppi (* * * p < 0,0001; Tukey di più test di confronto, p = 0,05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Locomozione delle 5 specie di Drosophila esposti a temperature progressivamente crescenti. Individuo maschio Vola da tropicale (blu), temperato (rosso), e specie cosmopolita di Drosophila (marrone) sono stati esposti a un gradiente di temperatura crescente (2 ° C ogni 60 s) tra 16 e 46 ° C. Il primo min 7 erano costantemente a 22 ° C per consentire mosche esplorare l'arena. Specie erano significativamente differenti (F(4,70) di ANOVA a due vie RM = 28,46, p < 0,001). (a) d. melanogaster (marrone; riempito cerchi) era più veloce quando introdotto nell'Arena. (b) d. yakuba (rosso; svuotare piazze) era più veloce come aumentata della temperatura. (c) d. suzukii (marrone quadrato riempito) è stato più lento rispetto le altre mosche cosmopolite nel suo punto di massimo rendimento. (d) d. simulans (marrone; svuotare cerchi) era in decadimento nel punto massimo della D. melanogaster. Ogni punto rappresenta la media (± SEM) di 15 mosche maschi 5 a 7 giorni vecchio testato per diversi giorni. Significato indicato dai simboli (♦ = differenza da tutti, p < 0,0001; † = differenza da tutti tranne d. melanogaster, p < 0,0001; • = differenza da d. melanogaster, p < 0.01; ¢ = differenza da d. melanogaster, p < 0,001; = differenza tra gruppi denominati, p < 0,0001; Tukey di più test di confronto, p = 0,05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: l'arena di temperatura controllata può essere utilizzato per il condizionamento operante. Ceppo di Cantone-S di d. melanogaster (wild-type; nero bordo) e dnc1 (Dunce; bordo rosso) mutanti venivano addestrati a preferire una piastrella laterale a 22 ° C, dopo il riscaldamento centrale e fronte piastrelle laterali a 40 ° C per 4 min (formazione, no modello). Memoria delle aree riscaldate viene quindi testato impostando tutte le tessere a 22 ° C (prova; modello di griglia). Mosche sono stati condizionati a preferire piastrelle a sinistra nella metà degli esperimenti, quindi piastrelle sulla destra in altra metà. La percentuale di tempo totale dentro la piastrella a 22 ° C durante l'allenamento e test è stata misurata per confrontare le prestazioni. I gruppi erano significativamente differenti (One-way ANOVA F(3,76) = 23,23, p < 0,0001), con Dunce esecuzione peggio di selvaggio-tipo nel complesso. I dati sono medi (± SEM) di 20 mosche femminile Vergine 5 a 7 giorni vecchio testato per diversi giorni. Gli asterischi indicano la differenza di significato tra i gruppi (* * * p > 0,0001; * * * p > 0,001; * * p > 0.01; Tukey di più test di confronto, p = 0,05) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: risposta di mutanti temperatura all'aumentare della temperatura quando viene fornita una posizione confortevole. Mutanti temperatura Gr28b.d (verde, piazze) rispondono come controlli (w1118, nero; cerchi) aumentando la percentuale di tempo in zona confortevole mentre la temperatura aumenta (bidirezionale RM ANOVA F (1,38) = 0.5107, p = 0,479). TrpA1GAL4 mutanti (giallo; triangoli) sono diversi dai controlli (w1118, nero), come non aumentare il tempo in zona confortevole mentre la temperatura aumenta (bidirezionale RM ANOVA F (1,38) = 1.670, p = 0,019). I dati sono medi (± SEM) di 20 mosche maschi 5 a 7 giorni vecchio testato per diversi giorni. TrpA1GAL4 è significativamente diverso da Gr28b.d e il controllo (p < 0,05; Tukey di più test di confronto, p = 0,05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.