Articolo metodologico

Protocollo clinico di produrre tessuto adiposo-derivato Stromal frazione vascolare per potenziale rigenerazione della cartilagine

DOI:

10.3791/58363

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29 settembre 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Mipro Medical Clinic, 2National Leading Research Laboratory, Department of Biological Sciences, Myongji University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Qui, presentiamo un protocollo per la produzione di una frazione di vascolare stromal derivate da tessuto adiposo e la sua applicazione per migliorare le funzioni del ginocchio eseguendo la rigenerazione della cartilagine-come il tessuto in pazienti umani con l'osteoartrite.

Abstract

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L'osteoartrite (OA) è uno dei più comuni disturbi debilitanti. Recentemente, numerosi tentativi apportati per migliorare le funzioni delle ginocchia utilizzando diverse forme di cellule staminali mesenchimali (MSCs). In Corea, concentrati di midollo osseo e cavo di cellule staminali derivate dal sangue sono state approvate dalla Korean Food and Drug Administration (KFDA) per la rigenerazione della cartilagine. Inoltre, una tessuto adiposo-derivato stromal vascolare frazione (SVF) è stato permesso del KFDA per iniezioni congiunte in pazienti umani. SVF derivate da tessuto adiposo autologo contiene la matrice extracellulare (ECM) oltre alle cellule staminali mesenchimali. ECM secerne varie citochine che, insieme con acido ialuronico (HA) e plasma ricco di piastrine (PRP) attivato dal cloruro di calcio, possono aiutare MSCs per rigenerare la cartilagine e migliorare le funzioni del ginocchio. In questo articolo, abbiamo presentato un protocollo per migliorare le funzioni del ginocchio eseguendo la rigenerazione della cartilagine-come il tessuto in pazienti umani con OA. Il risultato del protocollo in primo luogo è stato segnalato nel 2011, seguita da alcuni ulteriori pubblicazioni. Il protocollo coinvolge liposuzione per ottenere lipoaspirates autologhi che si mescolano con collagenasi. Questa miscela di lipoaspirates-collagenasi è poi tagliare e omogeneizzata per rimuovere grande tessuto fibroso che può intasare l'ago durante l'iniezione. In seguito, la miscela viene incubata per ottenere tessuto adiposo-derivato SVF. La SVF risultante tessuto adiposo-derivato, contenente sia il tessuto adiposo-derivato MSCs e resti di ECM, viene iniettato nel ginocchio dei pazienti, combinati con l'HA e cloruro di calcio attivato PRP. Sono inclusi tre casi di pazienti che sono stati trattati con il nostro protocollo conseguente miglioramento del dolore al ginocchio, il gonfiamento e la gamma di movimento insieme a prova di MRI di cartilagine ialina-come il tessuto.

Introduzione

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Cellule staminali mesenchimali (MSCs) sono noti per avere la capacità di rigenerare la cartilagine1,2,3,4,5,6. Possono essere facilmente ottenuti da varie fonti: midollo osseo, sangue del cordone ombelicale e tessuto adiposo tra molti altri. Tra queste fonti, il tessuto adiposo è l'unica fonte dove un numero sufficiente di cellule staminali mesenchimali possa essere ottenuto senza alcuna espansione di cultura per rigenerare la cartilagine nelle regolazioni cliniche7,8. Autologous del midollo osseo stromale vascolare frazione (SVF) può essere facilmente ottenuto pure. Tuttavia, il numero delle cellule staminali contenute nel midollo espanso non-cultura è molto basso7,8. Sangue del cordone può contenere un numero sufficiente di cellule staminali mesenchimali. Tuttavia, sangue del cordone ombelicale non è una fonte prontamente disponibile di SVF autologo.

Numerosi metodi di lavorazione il tessuto adiposo per ottenere SVF sono disponibili per applicazioni cliniche. Tra questi, il metodo di ottenimento MSCs dal tessuto adiposo mediante collagenasi, sviluppato e confermata da Zuk et al. 5 , 6, è molto ben accettato. Questo metodo di utilizzo della collagenosi è stato modificato per applicazioni cliniche in ortopedia. Per poter essere applicati a contesti clinici, il sistema deve essere un sistema chiuso per garantire la sterilità, mantenendo la comodità. Una modifica particolare presentata in questo articolo comporta l'omogeneizzazione della lipoaspirates. Piccole dimensioni lipoaspirates sono digeriti relativamente più velocemente di quelle di grandi dimensioni che risultano nella ripartizione irregolare del tessuto adiposo. Inoltre, questi lipoaspirates di dimensioni più grandi possono produrre tessuti fibrosi che possono intasare le siringhe e gli aghi durante l'esecuzione di iniezioni congiunta9,10. Per evitare questi problemi, il lipoaspirates può essere omogeneizzato da tagliare e sminuzzare la lipoaspirates prima l'incubazione con collagenasi. La SVF tessuto adiposo-derivato risultante potrebbe contenere più uniforme matrice extracellulare (ECM) rispetto a lipoaspirates che non sono omogeneizzati11. L'ECM scassata contenuta nella SVF funzionino come un' impalcatura12.

Nel 2009, SVF derivate da tessuto adiposo autologo è stato permesso dalla Korean Food and Drug Administration (KFDA) durante l'elaborazione all'interno di una struttura medica con trattamento minimo da un medico13. In seguito, SVF derivate da tessuto adiposo autologo è stata utilizzata come agente potenziale per migliorare le funzioni del ginocchio nei pazienti di osteoartrite (OA) potenzialmente rigenerando cartilagine-come il tessuto10,14,15 , 16 , 17 , 18 .

Nel 2011, Pak ha mostrato per la prima volta che tessuto adiposo cellule staminali derivate (ASCs) contenute nella SVF tessuto adiposo-derivato può migliorare le funzioni del ginocchio potenzialmente rigenerazione della cartilagine-come il tessuto nei pazienti affetti da OA quando iniettato con piastrina-ricco plasma (PRP) 14. Inoltre, Pak et al sono riportati dati di sicurezza nel 2013 su 91 pazienti. Il tasso di efficacia media segnalato in questi dati di sicurezza era 67%15. Successivamente, ulteriori studi di Pak et al hanno dimostrato ginocchio migliorata funzioni potenzialmente grazie alla rigenerazione del tessuto della cartilagine-come in pazienti con un menisco lacrima e Condromalacia della rotula10,16,17 ,18. Basato sugli articoli segnalati, è noto che il numero delle cellule staminali contenute in 100 g di tessuto adiposo elaborato dal protocollo presentato in questo articolo può variare da 1.000.000-40.000.000 a seconda delle caratteristiche dei pazienti8, 19 , 20 , 21 , 22 , 23.

Qui, presentiamo un protocollo clinico di osteoartrosi del ginocchio umano utilizzando SVF derivate da tessuto adiposo autologo con HA e PRP attivato con cloruro di calcio. La prima versione di questo protocollo clinico, che coinvolge un sistema chiuso, manuale per mantenere la sterilità, è stata segnalata nel 201114. Il protocollo identico è stato ottimizzato, mantenere la sterilità ed è stato segnalato nel 2013 e 201610,15. Qui, è presentato il protocollo ottimizzato. La presentazione schematica del protocollo è presentato nella Figura 1.

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Figura 1: Panoramica schematica del protocollo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Protocollo

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L'approvazione e il consenso per segnalare i seguenti rapporti di caso sono stati rinunziati a dal Comitato Myongji University Institutional Review Board (MJUIRB). Inoltre, questo protocollo clinico era compatibile con le istruzioni di dichiarazione di Helsinki e regolamento del KFDA. Per le procedure, sono stati ottenuti consensi dai pazienti.

1. liposuzione

Nota: Eseguire con tecnica sterile.

  1. Utilizzare i seguenti criteri di inclusione: (1) prova di MRI della fase 3 OA; (2) sia maschio o femmina; (3) oltre 18 anni di età; (4) tessuto adiposo di (100-110 g) sufficiente per la liposuzione; (5) mancanza di volontà di procedere con l'intervento chirurgico; (6) fallimento dell'amministrazione conservatrice; e dolore invalidante in corso (7).
  2. Utilizzare i seguenti criteri di esclusione: (1) malattia infiammatoria o tessuto connettivo attiva pensato all'impatto condizione di dolore (cioè, lupus, artrite reumatoide, fibromialgia); (2) attivo disordine endocrino che potrebbe condizionare la condizione di dolore (cioè, ipotiroidismo, diabete); (3) attivo disturbo neurologico che potrebbe condizionare la condizione di dolore (cioè, neuropatia periferica, sclerosi multipla); (4) attiva della malattia polmonare che richiedono l'uso di farmaci; e (5) senza la storia delle iniezioni steroidi congiunte ultimi 3 mesi.
  3. Portare il paziente in una sala operatoria con un cappuccio di biohazard classe A e posto lui (o lei) in posizione supina.
  4. Pulire la zona addominale del paziente con 5% betadine (povidone-iodio) e coprire il paziente utilizzando la tecnica sterile, esponendo l'area pulita dell'addome per la liposuzione.
  5. Circa 5cm infero-lateralmente dal umbilicus, anestetizzare due siti (quello a sinistra e l'altro sul lato destro dell'ombelico) dell'incisione to-be-prodotto con 2 mL di lidocaina 2% senza epinefrina con un ago (25 gauge, 1½ pollici) in una siringa da 5 mL iniettando ogni sito a livello epidermico.
  6. Anestetizzare il sito di incisione to-be-fatta con 5 mL della soluzione tumescente (500 mL di normale soluzione salina, 40 mL di lidocaina 2%, 20 mL di bupivacaina 0,5%, 0,5 mL di epinefrina 1: 1000) in una siringa da 10 mL con un ago (25 gauge, 1½ pollici).
  7. Praticare 2 incisioni di 0,5 cm circa 5 cm sotto l'ombelico lateralmente da pizzicare la pelle per aumentare la profondità del livello sottocutaneo.
  8. Con lama n. 11, colpire la pelle sollevata di penetrare attraverso il livello sottocutaneo, ma non di penetrare attraverso la parete addominale.
  9. Mediante cannula di calibro 16 di 20cm, anestetizzare il livello sottocutaneo della zona addome intero inferiore, che è to-be-liposuctioned, con 700-800 mL della soluzione tumescente.
  10. Dopo finitura infiltrazione del tutto basso addome con la soluzione tumescente, preparare un apparato di liposuzione collegando una cannula di 3,0 mm collegata a un 60 mL (o un 30ml) siringa per liposuzione manuale o una cannula appositamente progettato 3,0 mm collegato ad un kit di centrifuga, una siringa di sistema chiuso allo scopo di mantenere la sterilità, collegato ad una macchina sottovuoto per la liposuzione a vuoto.
  11. Eseguire la liposuzione per ottenere 100-110 g di tessuto adiposo escluse soluzione tumescente. Quando liposuzione, tessuto adiposo saranno ottenuto con la soluzione tumescente, che dovrebbe essere separata e rimosso.
  12. Per separare la soluzione tumescente, prima per gravità, trasferire il tessuto adiposo nel kit centrifuga su una siringa da 60 mL e posizionare la siringa verso il basso (cioè, che la parte della siringa è nella parte inferiore). In attesa di 5-6 min, il tessuto adiposo e il fluido tumescente saranno separati. Rimuovere il liquido nella parte inferiore della siringa premendo sulla parte superiore dello stantuffo della siringa.
  13. Eseguire i passaggi precedenti 1.9-1.11 fino a un totale di 100-110 g di tessuto adiposo (lipoaspirates) al ginocchio è stato accumulato.

2. preparazione della miscela ASC/ECM con sistema chiuso Sterile

  1. Dopo la separazione la soluzione tumescente di gravità e accumulando 50-55 g di lipoaspirates per ogni corredo centrifuga 60 mL, un sistema chiuso sterile, posizionare il kit 2 centrifuga in una centrifuga contenitore secchio e spin a 1600 x g per 5 min, condensa il lipoaspirates e separare il liquido dal tessuto adiposo. In questo processo di ulteriore condensa, il lipoaspirates può produrre olio grasso in determinati casi.
  2. Essere prudente per non scuotere, rimuovere il tappo di sicurezza e la spina nella parte inferiore del kit di centrifuga.
  3. Rimuovere il liquido di fondo premendo lentamente verso il basso sulla parte superiore il pistone del kit della centrifuga.
  4. Sulla siringa separata da 60 mL, sciogliere 10 mg di collagenasi (5 mg di collagenasi specifici per il tessuto connettivo24 ) e 5 mg di collagenasi specifici per il tessuto adiposo25con 50 mL di soluzione fisiologica normale.
  5. Mescolare circa 25-30 mL di lipoaspirato condensata con collagenasi disciolto (5 mg di collagenasi specifico per il tessuto connettivo) e 5 mg di collagenasi specifici per il tessuto adiposo con un rapporto di 1:1 (v: v) collegando la siringa da 60 mL per un kit di centrifuga utilizzando un connettore specializzato.
  6. Mescolare accuratamente il lipoaspirato condensata e la collagenosi spingendo il contenuto tra la siringa da 60 mL e i kit di centrifuga utilizzando una canna o un pusher.
  7. Trasferire la miscela del lipoaspirato e la collagenosi siringhe da 60 mL.
  8. Collegare ogni siringa da 60 mL contenente la miscela con un omogeneizzatore del tessuto che contiene lame.
  9. Collegare una siringa vuota 60ml per l'altra estremità dell'omogeneizzatore.
  10. Spingere la miscela per l'altra siringa da 60 mL attraverso l'omogeneizzatore per 4 -6 volte, con conseguente taglio e macinazione del lipoaspirato.
  11. Trasferire il lipoaspirato omogeneizzato e la miscela di collagenasi torna a kit di 60 mL Centrifuga attraverso un connettore specializzato
  12. Posizionare il kit di centrifuga in un contenitore da posizionare in un'incubatrice che è stato pre-riscaldata a 37 ° C.
  13. Incubare i kit due centrifuga con la miscela omogeneizzato a 37 ° C per 40 min durante la rotazione a 45 giri.
  14. Dopo 40 min di incubazione, rimuovere il contenitore dall'incubatrice in modo sterile. Quindi, rimuovere il kit di centrifuga e metterli in una macchina centrifuga.
  15. Centrifugare le miscele a 800 x g per 5 min separare il tessuto adiposo-derivato SVF.
  16. Dopo la centrifuga, rimuovere il surnatante (che include la collagenosi e digerito tessuto adiposo) da ogni kit di centrifuga rimuovendo il cappuccio della siringa nella parte superiore lo stantuffo e ponendo una siringa da 30 mL lo stantuffo apertura tramite siringa lock connessione.
  17. Premere lentamente verso il basso la parte del barilotto della siringa 30ml per il surnatante riempire la siringa da 30 mL.
  18. Premere verso il basso il corpo della siringa 30ml tutto il senso giù l'ultimo 3-4 mL della parte inferiore del kit di centrifuga, lasciando solo l'ultimo 3-4 mL di tessuto adiposo-derivato SVF. Il supernatante viene scartato.
  19. Rimuovere la siringa da 30 mL dalla parte superiore del pistone e riempire la siringa con destrosio 5% in soluzione di Ringer lattato (D5LR).
  20. Collegando la siringa da 30 mL riempita con D5LR nella parte superiore lo stantuffo apertura, riempire i kit di centrifuga, contenenti 3-4 mL di tessuto adiposo-derivato SVF, con D5LR fino a 55 mL.
  21. Rimuovere la siringa da 30 mL, tappo lo stantuffo e centrifugare i kit di centrifugare nuovamente a 300 x g per 4 min.
  22. Ripetere i passaggi da 2.17-2.21 per un totale di 4 lavaggi. La collagenasi usato è xenogenica. Di conseguenza, la maggior parte delle collagenasi viene rimosso mediante 4 lavaggi. Tuttavia, per l'approvazione della FDA, messa a punto del protocollo può essere necessario rimuovere completamente i residui di collagenasi nel volume finale, anche se la quantità di residui di collagenasi può essere abbastanza trascurabile per i pazienti che non hanno affatto clinica effetti collaterali.
  23. Dopo la centrifugazioneth 4, al fine di ottenere il finale SVF iniettabile, rimuovere il tappo di sicurezza e la spina all'apertura inferiore del kit di centrifuga, senza agitazione o girando il kit di centrifuga.
  24. Collegare una siringa da 20 mL alla parte inferiore del kit di centrifuga apertura utilizzando un connettore appositamente progettato.
  25. Tirare lo stantuffo della siringa più volte avanti e indietro per scuotere le cellule che hanno depositato sul fondo del kit della centrifuga.
  26. Rimuovere il volume totale desiderato di SVF contenente ASCs ed ECM insieme ad altre cellule e tessuti (solitamente circa 3-4 mL da ogni kit di centrifuga per iniezioni giunto del ginocchio).

3. PRP preparazione con tecnica Sterile

  1. Mentre si prepara l'ASCs ed ECM, disegnare 30 mL di sangue autologo con 2,5 mL di soluzione di Destrosio citrato anticoagulante.
  2. Trasferire il sangue prelevato ai kit centrifuga 60 mL.
  3. Centrifugare il sangue prelevato a 730 x g per 5 min e rimuovere il surnatante in un nuovo kit di centrifuga 60 mL. Centrifugare il supernatante a 1300 x g per 4 min, 3-4 mL di PRP con conseguente.
  4. Proprio prima dell'iniezione, aggiungere 3% (p/v) di cloruro di calcio in un rapporto di 10:2 (PRP: cloruro di calcio, v: v) per la PRP per attivarlo.
  5. Aggiungere 0,5% (p/v) HA, come un'impalcatura, il PRP attivato con cloruro di calcio. Questi ASCs con ECM, insieme con PRP, attivato da cloruro di calcio, e HA stand per la miscela ASC/ECM.

4. trattamento a base di miscela ASC/ECM

  1. Pulire il ginocchio del paziente con 5% betadine e drappo in maniera sterile.
  2. Palpare l'anteriore del ginocchio per lo spazio comune tra le ossa tibiali e femorali.
  3. Anestetizzare il sito di iniezione superficialmente con lidocaina diluita (1 mL di lidocaina 1% diluita con 4 mL di soluzione fisiologica normale) dalla pelle appena di fuori della capsula articolare.
  4. Anestetizzare l'interno della capsula articolare con ropivacaina diluita (ropivacaina 0,75% 1 mL diluita con 3 mL di soluzione salina normale).
  5. Mescolare 2 mL di HA per il 6-8 mL di SVF contenuta in una siringa da 20 mL attraverso il connettore a siringa.
  6. Utilizzando un connettore a siringa, aggiungere 0,4 mL di cloruro di calcio per 3-4 mL di autologo PRP che è già stato preparato e di essere pronto in una siringa da 5 mL.
  7. Combinare 3,5-4,5 mL di cloruro di PRP/calcio in una siringa da 5 mL con 8-10 mL di miscela di HA/SVF in un 20ml siringa tramite siringa al connettore.
  8. Immediatamente di iniettare lentamente la miscela (circa 12-15 mL) nell'articolazione tibio-femorale anteriore delle ginocchia con ago calibro 18 38 mm con o senza la guida ecografica.
  9. Dopo l'iniezione, benda il sito di iniezione con pressione pieghevole garza di 4x4 cotone 4 volte e posizionando i nastri sopra la garza piegata di 4x4.
  10. Chiedere al paziente di rimanere ancora per 60 min consentire collegamento delle cellule.
  11. Istruire il paziente a limitare le attività per minimo 1 settimana dopo la dimissione dalla clinica.
  12. Ritorno alla clinica per tre ulteriori iniezioni di PRP attivato da cloruro di calcio per 3 settimane.

5. post-trattamento di Follow-Up

  1. Valutare il paziente a settimana di 2, 4 e 16 (18 o 22) per dolore miglioramento in termini di scala analogica visiva (VAS) e la funzione di miglioramento in termini di parametri di terapia fisica. Determinare l'indice di valutazione funzionale (ven), VAS e gamma di movimento (ROM) come descritto in precedenza26,27.
  2. Seguire il paziente di post-trattamento MRI 3 mesi dopo il trattamento.

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Risultati

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Tre pazienti (una donna di 87 anni con tappa 3 OA, un uomo di 68 anni con stadio 3 OA, e una donna di 60 anni con stadio 3 OA) senza qualsiasi significativo passato storia medica ha presentato alla clinica con dolore persistente del ginocchio e desiderato per il potenziale trattamento di SVF derivate da tessuto adiposo autologo. Tutti e tre i pazienti avevano loro ginocchio esaminato da un chirurgo ortopedico e sono stati offerti per avere la sostituzione totale del ginocchio (TKA) ed era...

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Discussione

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Nel 2001, Zuk et al. cellule staminali isolate dal tessuto adiposo, abbattendo la matrice del collagene con collagenasi6. In seguito, il gruppo ha mostrato che queste cellule staminali isolate da tessuto adiposo potrebbe trasformare in cartilagine e altri tessuti del mesoderma in origine, dimostrando che non c'erano queste cellule staminali mesenchimali in origine.

Allo stesso modo, la procedura presentata in questo articolo è un protocollo modificato per appli...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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L'autore riconosce il sostegno da parte del personale della clinica medica Mipro e il disegno di figura di Jaepil/David Lee. Questo lavoro è stato sostenuto da borse di ricerca dal Bio & programma di sviluppo tecnologia medicale della NRF finanziata da MSIT (numero NRF-2017M3A9E4078014); e nazionali Research Foundation di Corea (NRF) finanziato dal Ministero della scienza e ICT (numeri NRF-2017R1A2B4002315 e NRF-2016R1C1B2010308).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Materiale
5% Betadine (iodio-povidone) Firson Co., Ltd.
2% di lidocainaDaehan Pharmaceutical Co.
Soluzione tumescente Myungmoon Pharm. Co. Ltd.N01BB01La soluzione era composta da 500 ml di soluzione fisiologica normale, 40 ml di lidocaina al 2%, 20 ml di marcaina allo 0,5% e 0,5 ml di adrenalina 1:1000.
Libera il grado di ricerca TL e TM Roche Applied Science5401020001
D5LRDahan Pharm. Co., Ltd.645101072Destrosio 5% in soluzione di Ringer lattato 
Soluzione anticoagulante di citrato destrosio Fenwal, Inc.NDC:0942-0641La soluzione era composta da acido citrico allo 0,8%,
allo 0,22% di citrato di sodio e allo 0,223% di destrosio.
3% (p/v) Cloruro di calcio Fornitore verificato - Choongwae Pharmaceutical Co.
0,5% (p/v) HA (acido ialuronico)Dongkwang pharm. Co., Ltd.
0,25% RopivacaineHuons Co., Ltd.670600150
Equipment
3.0 mm Cannula WOOJU Medical Instruments Co.
siringa Luer-Lock da 60 mlBD (Becton Dickinson) 
Kit 309653 Canna Centrifuga CPL Co., Ltd.30-0827044
Omogeneizzatore tissutale che contiene lameCPL Co., Ltd.30-0827045
Miscelatore per incubatrice rotanteMedikan Co., LtdMS02060092
CentrifugaHanil Scientific Inc.CE1133
Risonanza magnetica PhilipsMedical Systems Inc.18068
Sistema di imaging ad ultrasuoniSamsung Medison co., LtdCT-LK-V10-ICM-09.05.2007
657400260670603480Fornitore verificato - 644902101645902030ML30200

Riferimenti

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