Il protocollo descrive intubating zebrafish adulto con un biologico; quindi di dissezione e preparando l'intestino per citometria, microscopia confocale e qPCR. Questo metodo consente la somministrazione di composti bioattivi per monitorare l'assorbimento intestinale e lo stimolo immune locale evocato. È rilevante per il test la dinamica intestinale di profilassi orale.
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Articolo metodologico
Intubazione orale di Zebrafish adulto: un modello per valutare l'assorbimento intestinale di sostanze bioattive
In questo articolo
Sommario
Abstract
Maggior parte dei patogeni invadono gli organismi attraverso loro mucosa. Questo è particolarmente vero nei pesci come sono continuamente esposti a un ambiente microbico-ricco di acqua. Lo sviluppo di metodi efficaci per la consegna orale di immunostimolanti o vaccini, che attivano il sistema immunitario contro le malattie infettive, è altamente auspicabile. Nell'elaborazione di strumenti profilattici, buoni modelli sperimentali sono necessari per testare le loro prestazioni. Qui, vi mostriamo un metodo per intubazione orale di zebrafish adulto e una serie di procedure per sezionare e preparare l'intestino cytometry, microscopia confocale e l'analisi quantitativa della polimerasi reazione a catena (qPCR). Con questo protocollo, precisamente possiamo erogare volumi fino a 50 µ l a pescare circa 1 g di peso semplicemente e rapidamente, senza danneggiare gli animali. Questo metodo ci permette di esplorare l'assorbimento diretto in vivo di composti fluorescente etichettati da mucosa intestinale e la capacità immunomodulatoria di tali farmaci biologici nel sito locale dopo intubazione. Combinando metodi a valle come flusso cytometry, istologia, qPCR e microscopia confocale del tessuto intestinale, possiamo capire come immunostimolanti o vaccini sono in grado di attraversare le barriere della mucosa intestinale, passano attraverso la lamina propria, e raggiungere il muscolo, esercitando un effetto sul sistema immunitario della mucosa intestinale. Il modello potrebbe essere utilizzato per testare i sistemi di consegna e profilassi orale candidato o l'effetto locale di qualsiasi composto bioactive oralmente amministrato.
Introduzione
L'obiettivo di questo articolo è di descrivere in profondità un metodo semplice per intubazione orale di zebrafish, insieme a utili procedure associate a valle. Intubazione orale utilizzando zebrafish è diventato un modello pratico nello studio delle dinamiche di malattia infettiva, orale vaccino/immunostimolante, droga/nanoparticella assorbimento e l'efficacia e l'immunità mucosa intestinale. Ad esempio, intubazione orale zebrafish è stato utilizzato nello studio di infezione da Mycobacterium marinum e Mycobacterium peregrinum 1. Lovmo et al. anche usato con successo questo modello per fornire le nanoparticelle e
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Protocollo
Tutti i procedimenti sperimentali zebrafish (Danio rerio) sono stati autorizzati dal comitato etico della Universitat Autònoma de Barcelona (numero di chetta 1582) in accordo con gli International Guiding Principles for Research Involving Animals ( EU 2010/63). Tutti gli esperimenti con il danio zebrato dal vivo sono stati eseguiti 26 – 28 ° c.
1. preparare l'attrezzatura per intubazione orale
- Posto circa 1 cm di tubo in silicone bene sui ferri 31 G Luer lock per coprire la punta dell'ago.
- Taglio una pipetta di filtro sterile 10 µ l punta (circa 2 cm), prendere l'estremità più sottile e posto sopra il tubo di si....
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Risultati
Zebrafish (peso medio: 1,03 ± 0,16 g) di sesso misto con successo sono stati intubati con nanoparticelle di differenti della proteina ricombinante (corpi di inclusione batterici) utilizzando il nostro dispositivo di intubazione orale fatto in casa (Figura 1). Abbiamo correttamente eseguita l'intubazione orale e raggiunto un tasso di mortalità basso percentuale media (6,8%) (Tabella 1). Zebrafish erano sia intubati con 30 µ l o 50 µ l di sospe.......
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Discussione
Questo protocollo è un miglioramento della tecnica precedentemente descritta per intubazione orale di Collymore et al. 4 il nostro protocollo viene descritto in dettaglio il metodo di intubazione orale e prevede la preparazione dell'intestino per analisi successive. Il nostro metodo migliora la velocità di manipolazione di pesce permettendo una persona di svolgere l'intero protocollo rapidamente, senza molta variazione tra gli operatori. Una differenza principale del nostro protocollo con.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano che non interessi concorrenti presenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Ministero spagnolo della scienza, AGAUR fondi al NR (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER e 2014SGR-345 AGAUR) e Commissione europea. RT ha conseguito una borsa di studio pre-dottorato AGAUR (Spagna), JJ è stata sostenuta da una borsa di dottorato del Consiglio di borsa di studio della Cina (Cina) e NR è supportato dal programma Ramón y Cajal (RYC-2010-06210, 2010, MINECO). Ringraziamo il dottor Torrealba per consulenza di esperti nella produzione di proteine, N. Barba dal "Servei de Microscopia" e Dr. M. Costa da "Servei de Citometria" della Universitat Autònoma de Barcelona per assistenza tecnica disponibile.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tubo in silicone | Dow Corning | 508-001 | 0,30 mm di diametro interno e 0,64 mm di diametro esterno |
| Ago Luer lock | Hamilton | 7750-22 | 31 G, Kel-F Hub |
| Luer lock siringa | Hamilton | 81020/01 | 100 μ L, Kel-F Hub |
| Puntale per pipetta filtrato | Nerbe Plus | 07-613-8300 | 10 μ L |
| MS-222 | Sigma Aldrich | E10521 | polvere |
| 10x PBS | Sigma Aldrich | P5493 | |
| Carta da filtro | Filter-Lab | RM14034252 | |
| Collagenasi | Gibco | 17104019 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Aquila di Dulbecco modificata media |
| Penicillina e streptomicina | Gibco | 15240 | |
| Filtro cellulare | Falcon | 352360 | |
| Filtri CellTrics | Sysmex Partec | 04-004-2326 (Wolflabs) | 30 µ m filtri a maglie con serbatoio da 2 mL |
| Composto Tissue-Tek O.C.T. | SAKURA | 4583 | |
| Stampi in plastica per criosezioni | SAKURA | 4557 | Stampi monouso in vinile. 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| Vetrino | Thermo Scientific | 10149870 | Vetrino SuperFrost Plus |
| Coprivetri | Labbox | COVN-024-200 | 24&acuto; 24 mm |
| Paraformaldeide (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Atto-488 NHS estere | Sigma-Aldrich | 41698 | |
| Bicarbonato di sodio | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | Promega | AS1340 | |
| 1-Tiogliceriolo/Omogeneizzazione soluzione | Promega | all'interno del kit di tessuto Maxwell RSC simplyRNA con l'aggiunta di | 20 μ l Soluzione di omogeneizzazione da 1-tioglicerolo a 1 mL (2%) |
| rotatore verticale da laboratorio | Suministros Grupo Esper | 10000-01062 | |
| Cryostat | Leica | ||
| Omogeneizzatore | CM3050S KINEMATICA | Polytron PT1600E | |
| Citometro a flusso | Becton Dickinson | FACS Canto | |
| 5 mL tubo a fondo tondo | Falcon | 352058 | |
| Microscopio confocale | Leica | SP5 | |
| Cappa aspirante | Kottermann | 2-447 BST | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | Spettrofotometro | ND-1000 |
| Sistema di bioanalizzatore Agilent 2100 | Agilent | G2939A | Bioanalizzatore di RNA |
| Maxwell Instrument | Promega | AS4500 | |
| Kit di sintesi iScript cDNA | Bio-rad | 1708891 | |
| CFX384 PCR in tempo reale Sistema di rilevamento | Bio-Rad | 1855485 | |
| iTaq universale SYBR Green Supermix kit | Bio-rad | 172-5120 | |
| Acqua | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Fiala criogenica | Thermo Fisher Scientific | 375418 | Fiala CryoTube |
| Terreno di montaggio | Sigma-Aldrich | F6057 | Fluoroshield con DAPI |
Riferimenti
- Harriff, M. J., Bermudez, L. E., Kent, M. L. Experimental exposure of zebrafish, Danio rerio (Hamilton), to Mycobacterium marinum and Mycobacterium peregrinum reveals the gastrointestinal tract as the primary route of infection: A potential model for environmental mycobacterial infection. Journal of ....
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Ristampe e permessi
