Il Peptide di40 MUB per uso nella rilevazione eventi infiammatori mediato dai neutrofili

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per rilevare la presenza di neutrofili in sezioni di istologia fisso/permeabilizzate e valutare lo stato di attivazione dei neutrofili purificati dal vivo. In particolare, il peptide di₄₀ MUB associa la lattoferrina presente nei granuli specifici del neutrofilo e terziari. L'esposizione del contenuto granello tramite permeabilizzazione o l'attivazione del neutrofilo permette per la marcatura dei neutrofili.

Abstract

Qui, forniamo un protocollo che prevedono l'uso di MUB₄₀, un peptide sintetizzato con la capacità di legare la lattoferrina glicosilata memorizzata ad alte concentrazioni nei granuli specifici e terziari dei neutrofili. Dettagli di questo protocollo come MUB₄₀ coniugato direttamente a un fluoroforo possono essere utilizzato a macchiare i neutrofili in fissa/permeabilizzate tessuti pure come questo possa essere utilizzato in cellule vive di imaging analizzare per-granulazione e attivazione dei neutrofili. Metodi di rilevazione dei neutrofili sono limitati a specie-specifici anticorpi monoclonali, che non sono sempre adatti per determinate applicazioni. MUB₄₀ non penetrare la membrana cellulare e quindi è escluso dalla lattoferrina memorizzata nei neutrofili non-attivato/non-permeabilized. MUB₄₀ ha il beneficio aggiunto di riconoscere lattoferrina da una gamma vasta host, che lo rende particolarmente utile per confrontare i risultati di studi condotti su diversi modelli di ricerca, riducendo il numero di duplicati reagenti e semplificando i protocolli attraverso passo singolo di colorazione.

Introduzione

I neutrofili sono una delle armi primarie del sistema immunitario innato e ordinariamente sono reclutati ai siti di infiammazione intorno al corpo. Lo studio dei neutrofili è stato in gran parte alterato dalla loro durata di vita breve in vitro (meno di 8 h) e dagli strumenti di rilevazione limitata in condizioni basali o dopo l'attivazione. Qui, presentiamo un protocollo ben collaudato per la rilevazione di ampio e specifico dei mammiferi neutrofili nei campioni fissati/permeabilizzate. Forniamo anche un protocollo dettagliato per la macchiatura diretta neutrofili con MUB₄₀. Utilizzando il protocollo di colorazione del neutrofilo dal vivo, la temp....

Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati esaminati e approvati dalle organizzazioni francese Zinebsbai (Comité de Recherche Clinique), CPP (Comité de Protection des Personnes) e CNIL (Commission Nationale Informatique et Liberté).

1. colorazione fluorescente neutrofili nel tessuto di istopatologia con etichettati MUB₄₀

1. Per ottenere il tessuto per l'istopatologia, Difficoltà sezioni di biopsia del tessuto in un volume adeguato di paraformaldeide al 4% (PFA) per 30 min fino a 4 ore a seconda dello spessore del campione. Posizionare i campioni in frigorifero a 4 ° C durante la fissazione.
   Nota: Fissazione alternativi met....

Risultati

Risultati di MUB₄₀-tessuti macchiati da diapositive di istopatologia tipicamente rivelano cellule singole sparse in tutto il tessuto. MUB₄₀ macchie lattoferrina, che è presente in granuli neutrofili e compartimenti stagni. Così, in genere visto punctate macchiatura o diverse grandi aree separate del segnale proviene da singoli neutrofili (Figura 1). È utile aggiungere un secondo indicatore di cella come DAPI per aiutare co-localizzano il.......

Discussione

Qui, due analisi sono descritti in cui il peptide di₄₀ MUB è usato per studiare l'attivazione e l'infiammazione del neutrofilo. Vi mostriamo come MUB₄₀ può rivelare neutrofili presentano nelle sezioni di istopatologia o mostrano il loro stato di attivazione utilizzando neutrofili purificati dal vivo. I passaggi critici per l'utilizzo di MUB₄₀ come reagente di colorazione sono lo stesso come con qualsiasi altro metodo di rilevazione fluorescente. Cura deve essere presa per assicurare la co.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
MUB40-Cy5	Benoit Marteyn	benoit.marteyn@pasteur.fr	peptide fluorescente MUB40 (disponibile con altri fluorofori coniugati)
RI-MUB40-Cy5	Benoit Marteyn	benoit.marteyn@pasteur.fr	peptide fluorescente retro-inverso MUB40. Sintetizzato con D-amminoacidi e resistente alle proteasi (disponibile con altri fluorofori coniugati)
Parformaldeide	Sigma-Aldrich	16005	Fissativo per istologia
Saccarosio	Sigma-Aldrich	S7903	Soluzione utilizzata per rimuovere l'eccesso di PFA
Composto per la temperatura di taglio ottimale (OCT)	Sakura Finetek USA	4583	Utilizzato per congelare i tessuti prima del sezionamento del
2-metilbutano	Sigma-Aldrich	M32631	Utilizzato per congelare i tessuti prima del sezionamento del criostato
Etanolo	Sigma-Aldrich	1.00974	Utilizzato per il bagno di ghiaccio secco per congelare i tessuti
Leica Cryostat	Leica Biosystems	CM1520	Utilizzato per sezionare i tessuti Vetrini
microscopia su vetro	Fisher Scientific	12-518-101
Vetrini coprioggetti	Thor Labs	CG15CH	vetrino coprioggetti di alta precisione
	Sigma-Aldrich	Z377821	Utilizzato per prevenire la perdita di liquidi durante la colorazione dei tessuti
Saponina	Sigma-Aldrich	47036	Utilizzato per permeabilizzare le cellule per la colorazione IF
DAPI	Sigma-Aldrich	10236276001	Colora il DNA
Alexa fluor 488 Falloidina	Fisher Scientific	A12379	Lega l'actina
Prolunga l'oro antifade Mountant	Fisher Scientific	P36930	Prolunga il segnale IF e la resistenza al fotosbiancamento
Microscopio fluorescente	Vari	Vari	Utilizzati per l'imaging di vetrini IF
Armadio anossico	Vari		Vari Utilizzati per la purificazione di neutrofili vivi inattivati Cloruro di
sodio NaCL	Sigma-Aldrich	S7653
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	Componente tampone di lavaggio
MACS BSA tampone	Miltenyi Biotec	130-091-376	Componente tampone di lavaggio
Percoll	Sigma-Aldrich	P4937	Gradiente per la purificazione dei neutrofili
CD235a microsfere magnetiche di glicoforina	Miltenyi Biotec	130-050-501	Utilizzato per rimuovere i globuli rossi contaminanti
Colonne LS	Miltenyi Biotec	130-042-401	Utilizzato nella rimozione di globuli rossi dai neutrofili
RPMI-1640 senza rosso fenolo	Sigma-Aldrich	R8755	Utilizzato per saggi di neutrofili

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