Questo protocollo descrive una tecnica di differenziazione endoteliale di cellule progenitrici cardiache. Si concentra in particolare su come la concentrazione nel siero e la densità di semina delle cellule influenzano il potenziale di differenziazione endoteliale.
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Articolo metodologico
Induzione di differenziazione endoteliale in cellule progenitrici cardiache in condizioni di basso del siero
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Cellule progenitrici cardiache (CPCs) possono avere potenziale terapeutico per la rigenerazione cardiaca dopo la ferita. Nel cuore dei mammiferi adulto, intrinseca CPC sono estremamente scarse, ma espanso CPCs potrebbe essere utile per la terapia cellulare. Un prerequisito per il loro uso è la loro capacità di differenziarsi in modo controllato nei vari lignaggi cardiaci utilizzando protocolli definiti ed efficienti. Inoltre, all'espansione in vitro , CPCs isolati da pazienti o malattia preclinica modelli possono offrire strumenti di ricerca fruttuosa per l'indagine sui meccanismi della malattia.
Gli studi correnti utilizzano differenti marcatori per identificare CPCs. Tuttavia, non tutti sono espressi in esseri umani, che limita l'impatto traslazionale di alcuni studi preclinici. Protocolli di differenziazione che siano applicabili indipendentemente dall'espressione tecnica e marcatore di isolamento consentirà l'espansione standardizzati e adescamento di CPC per scopo di terapia cellulare. Qui descriviamo che facilita l'innesco di CPC sotto una concentrazione bassa nel siero bovino fetale (FBS) e condizioni di densità bassa delle cellule la differenziazione endoteliale del CPCs. utilizzando due differenti sottopopolazioni di topo e di ratto CPCs, indichiamo che laminin è un più substrato adatto di fibronectina per questo scopo sotto il seguente protocollo: dopo la coltura per 2-3 giorni in mezzo compresi gli integratori che mantenere multipotenza e con 3,5% FBS, CPC sono seminati su laminina a < 60% confluenza e coltivate in medium senza supplemento con basse concentrazioni di FBS (0,1%) per 20-24 ore prima differenziazione in mezzo di differenziazione endoteliale. Perché CPC sono una popolazione eterogenea, le concentrazioni nel siero e tempi di incubazione potrebbero essere necessario essere regolata a seconda delle proprietà della sottopopolazione rispettiva CPC. Considerando questo, la tecnica può essere applicata ad altri tipi di CPC anche e fornisce un metodo utile per studiare i meccanismi di differenziazione e come essi sono influenzati dalla malattia quando si utilizza il CPCs isolato dai modelli rispettivi malattia e potenziale.
Introduzione
Gli studi recenti sostengono l'esistenza di cellule progenitrici cardiache residenti (CPCs) nel cuore di un mammifero adulto1,2,3, e CPC potrebbe essere una fonte utile per la terapia cellulare dopo lesione cardiaca4, 5. Inoltre, espanso CPCs può fornire un modello fecondo per lo screening di stupefacenti e lo studio dei meccanismi di malattia quando isolati da pazienti con rare malattie del miocardio o da malattia rispettiva modelli6,7.
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Protocollo
L'uso di topi per scopo di isolamento cellulare era in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio e con la legge di protezione animale Svizzera ed è stato approvato dalle autorità cantonali svizzere.
Nota: L'isolamento di Sca-1+/CD31– SP-CPCs dal cuore del mouse essenzialmente è stato fatto come descritto in precedenza34 con alcune modifiche. Per i materiali e i reagenti utilizzati, Vedi Tabella materiali. Per tutti gli esperimenti, SP-CPCs cardiaci isolati da topi erano amplificati, attraversate e utilizzate in modo linea-come delle cellule. Per quest....
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Risultati
Isolamento di SP-CPC del mouse:
In questo studio, abbiamo usato del mouse CPCs isolato secondo il fenotipo di SP, considerando che risultati da ratto CPC sono modificati e aggiunto da una precedente relazione con autorizzazione (Figura 8)33.
Proliferazione delle cellule in cella ad alta e bassa densità e con le concentraz.......
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Discussione
Vantaggi di questo protocollo:
Questo protocollo fornisce una tecnica di differenziazione endoteliale di CPC. Abbiamo trovato che una concentrazione bassa nel siero e la densità delle cellule basso potrebbe migliorare l'efficienza della differenziazione endoteliale, per cui LN ha dimostrato di essere un substrato più adatto di FN in queste condizioni. Abbiamo usato due tipi distinti di CPC: ratto CPCs, che sono stati utilizzati in maniera linea-come delle cellule e mouse SP-CPC, che sono stati is.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Vera Lorenz per il suo sostegno utile durante gli esperimenti e il personale dell'impianto di citometria a flusso dal dipartimento di biomedicina (DBM), Università e ospedale universitario di Basilea. Questo lavoro è stato supportato dal soggiorno-su pista programma presso l'Università di Basilea (per Michika Mochizuki). Gabriela M. Kuster è sostenuta da una sovvenzione della Swiss National Science Foundation (concessione numero 310030_156953).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Terreno di coltura | |||
| Terreno di Dulbecco modificato di Iscove (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM)/Miscela di nutrienti F12 Prosciutto | Merck | #D8437 | |
| Penicillina-Streptomicina (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetale Bovino Siero (FBS) | Clone | #SH30071 | 3,5% (0,1% per induzione del lignaggio) |
| L-Glutammina | ThermoFisher | #25030 | Concentrazione finale 2 mM |
| Glutatione | Merck | #G6013 | |
| Fattore di crescita epidermico umano ricombinante (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Fattore di crescita dei fibroblasti basici ricombinante (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| Integratore B27 | ThermoFisher | #17504044 | |
| Cardiotrofina 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Svizzera | #100-125 | |
| Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #14170 | |
| 0,05 % Tripsina-EDTA | ThermoFisher | #25300 | |
| T75 Flask | Sarstedt | #83.3911 | |
| Differenziazione endoteliale | |||
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Ham's F-12K (Kaighn's) Medium | ThermoFisher | #21127 | |
| Laminin | Merck | #L2020 | |
| Fibronectina | Merck | #F4759 | Diluire in ddH2O |
| 6 pozzetti Plate | Falcon | #353046 | |
| Soluzione di formaldeide | Merck | #F1635 | Diluite 1:10 in PBS (concentrazione finale 3,7%) |
| Triton X-100 | Merck | #93420 | 0,1% in ddH2O |
| Normal Goat Serum (10%) | ThermoFisher | #50062Z | |
| Anticorpo Fattore di von Willebrand | Abcam | #ab6994 | 1:100 in siero di capra al 10% |
| IgG anti-coniglio, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher | #A11010 | 1:500 in siero di capra al 10% |
| 4',6-diamidino-2-fenilidolo, dicloridrato (DAPI) | ThermoFisher | #62247 | 1:500 in ddH2O |
| Kit antisbiadimento SlowFade | ThermoFisher | #S2828 | |
| Microscopio a campo largo BX63 | Olympus | ||
| Tube formation | |||
| 96 Well Plate | Falcon | #353072 | |
| ml Tubo a fondo tondo con tappo del filtro | Falcon | #352235 | |
| Matrigel Fattore di crescita ridotto | Corning | #354230 | |
| IX50 microscopio a campo largo | Olympus | ||
| Sca-1+/CD31- isolamento della popolazione sul lato cardiaco34 | |||
| Reagenti | |||
| Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet. | farmacia ospedaliera interna | #9077862 | Soluzione di lavoro: 200 mg/kg |
| di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #20012 | |
| Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), rosso fenolo (-) | ThermoFisher | #14175 | Preparare HBSS 500 mL + 2% FBS per estinguere l'attività della collagenasi B |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1 g/l di D-glucosio, L-glutammina, piruvato | ThermoFisher | #331885 | Prepare DMEM + 10% FBS + 25 mM HEPES+ P/S per Hoechst stanining |
| Penicillina-Streptomicina (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| HEPES 1 M | ThermoFisher | #15630080 | Concentrazione finale 25 mM |
| Siero fetale bovino (FBS) | Clone | #SH30071 | |
| Lisi dei globuli rossiTampone (10X) | BioLegend | #420301/100mL | Diluire a 1X in ddH2O e filtrare attraverso un 0,2 µ m filtro |
| Collagenasi B | Merck | #11088807001 | Concentrazione finale 1 mg/mL in HBSS, filtrato attraverso un 0,2 µ m filtro |
| bisBenzimide H33342 Tricloridrato (Hoechst) | Merck | #B2261 | Preparare 1 mg/mL in ddH2O |
| Verapamil-cloridrato | Merck | #V4629 | Concentrazione finale 83,3 µ M |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | #551262 | 0.25 µ g/107cells |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BD Biosciences | #557405 | 0.6 µ g/107cellule |
| 7-aminoactinomicina D (7-ADD) | ThermoFisher | #A1310 | 0,15 &; g/106cells |
| APC ratto IgG2a k Controllo dell'isotipo | BD Biosciences | #553932 | 0.25 &; g/107cells |
| FITC Rat IgG2a k Controllo dell'isotipo | BD Biosciences | #554688 | 0.6 &; g/107cells |
| Material | |||
| Aghi 27G | Terumo | #NN-2719R | |
| Aghi 18G | Terumo | #NN-1838S | |
| Siringhe monouso 1 mL sterile | CODAN | #62.1640 | |
| Pipetta di trasferimento 3,5 mL | Sarstedt | #86.1171.001 | |
| Cell Filtro 40 & micro; m blu | BD Biosciences | #352340 | |
| Filtro cellulare 100 µ m giallo | BD Biosciences | #352360 | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | #94.6077.305 | |
| Piatti di coltura P100 | Corning | #353003 | |
| Piatti di coltura P60 | Corning | #353004 | |
| Mouse | |||
| Line | Age | Breeding | |
| C57BL/6NRj / maschio | 12 settimane | in house | |
| Nome del prodotto | Company | Catalogue No. | |
| Reagents | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Miscela di nutrienti F12 Prosciutto | Merck | #D8437 | |
| Penicillina-Streptomicina (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Siero Fetale Bovino (FBS) | Clone | #SH30071 | |
| L-Glutammina | ThermoFisher | #25030 | |
| Integratore di glutatione | Merck | #G6013 | |
| B27 | ThermoFisher | #17504044 | |
| Fattore di crescita epidermico umano ricombinante (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Fattore di crescita dei fibroblasti basici ricombinanti (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| Cardiotrofina 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Svizzera | #100-125 | |
| Terreno di crescita delle cellule endoteliali (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Panoramica delle composizioni dei terreni. Alcune di queste informazioni sono identiche a quelle fornite sopra, ma ordinate in base alla composizione dei Media 1-3. | |||
| Nome del Prodotto | Medium 18< | strong>Medium 2 | Medium 3 |
| Reagents | Culture | Lineage induction | Endoteliale diff. |
| Terreno di Dulbecco modificato di Iscove (IMDM) | 35% | 35% | |
| Mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM)/Miscela di nutrienti F12 Prosciutto | 65% | 65% | |
| Penicillina-Streptomicina (P/S) | 1% | 1% | |
| Siero fetale bovino (FBS) | 3,5% | ≤ 0,1% | |
| di L-glutammina | 2 mM | 2 mM | |
| Glutatione | 0,2 nM | 0,2 nM | |
| Integratore di B27 | 1,3% | ||
| Fattore di crescita epidermico umano ricombinante (EGF) | 6,5 ng/mL | ||
| Fattore di crescita dei fibroblasti basici ricombinanti (FGF) | 13 ng/mL | ||
| Cardiotrofina 1 | 0,65 ng/mL | ||
| Trombina | 0,0005 U/mL | Tutti i componenti necessari inclusi nel kit | |
| Terreno di crescita delle cellule endoteliali (EGM)-2 BulletKit | Tutti i componenti necessari inclusi nel kit |
Riferimenti
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
- Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population.
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Ristampe e permessi
