Articolo metodologico

Induzione di differenziazione endoteliale in cellule progenitrici cardiache in condizioni di basso del siero

DOI:

10.3791/58370

⸱

7 gennaio 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedicine, University Hospital and University of Basel, 2Division of Cardiology, University Hospital Basel

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive una tecnica di differenziazione endoteliale di cellule progenitrici cardiache. Si concentra in particolare su come la concentrazione nel siero e la densità di semina delle cellule influenzano il potenziale di differenziazione endoteliale.

Abstract

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Cellule progenitrici cardiache (CPCs) possono avere potenziale terapeutico per la rigenerazione cardiaca dopo la ferita. Nel cuore dei mammiferi adulto, intrinseca CPC sono estremamente scarse, ma espanso CPCs potrebbe essere utile per la terapia cellulare. Un prerequisito per il loro uso è la loro capacità di differenziarsi in modo controllato nei vari lignaggi cardiaci utilizzando protocolli definiti ed efficienti. Inoltre, all'espansione in vitro , CPCs isolati da pazienti o malattia preclinica modelli possono offrire strumenti di ricerca fruttuosa per l'indagine sui meccanismi della malattia.

Gli studi correnti utilizzano differenti marcatori per identificare CPCs. Tuttavia, non tutti sono espressi in esseri umani, che limita l'impatto traslazionale di alcuni studi preclinici. Protocolli di differenziazione che siano applicabili indipendentemente dall'espressione tecnica e marcatore di isolamento consentirà l'espansione standardizzati e adescamento di CPC per scopo di terapia cellulare. Qui descriviamo che facilita l'innesco di CPC sotto una concentrazione bassa nel siero bovino fetale (FBS) e condizioni di densità bassa delle cellule la differenziazione endoteliale del CPCs. utilizzando due differenti sottopopolazioni di topo e di ratto CPCs, indichiamo che laminin è un più substrato adatto di fibronectina per questo scopo sotto il seguente protocollo: dopo la coltura per 2-3 giorni in mezzo compresi gli integratori che mantenere multipotenza e con 3,5% FBS, CPC sono seminati su laminina a < 60% confluenza e coltivate in medium senza supplemento con basse concentrazioni di FBS (0,1%) per 20-24 ore prima differenziazione in mezzo di differenziazione endoteliale. Perché CPC sono una popolazione eterogenea, le concentrazioni nel siero e tempi di incubazione potrebbero essere necessario essere regolata a seconda delle proprietà della sottopopolazione rispettiva CPC. Considerando questo, la tecnica può essere applicata ad altri tipi di CPC anche e fornisce un metodo utile per studiare i meccanismi di differenziazione e come essi sono influenzati dalla malattia quando si utilizza il CPCs isolato dai modelli rispettivi malattia e potenziale.

Introduzione

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Gli studi recenti sostengono l'esistenza di cellule progenitrici cardiache residenti (CPCs) nel cuore di un mammifero adulto1,2,3, e CPC potrebbe essere una fonte utile per la terapia cellulare dopo lesione cardiaca4, 5. Inoltre, espanso CPCs può fornire un modello fecondo per lo screening di stupefacenti e lo studio dei meccanismi di malattia quando isolati da pazienti con rare malattie del miocardio o da malattia rispettiva modelli6,7.

CPC isolate da cuore adulto possiedono cellule staminali/progenitrici delle cellule caratteristiche1,2,3,8 come sono multipotenti, clonogeniche, e hanno la capacità di auto-rinnovamento. Tuttavia, ci sono molti differenti (sotto) popolazioni di CPC che presentino profili marcatore di superficie differenti, tra cui, ad esempio, c-kit, Sca-1 e altri, o estratto mediante tecniche di isolamento diverso (tabella 1). Diversi protocolli di differenziazione e cultura sono stati stabiliti1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. Questi protocolli variano soprattutto per quanto riguarda il fattore di crescita e il contenuto di siero, che vengono regolati in base allo scopo della coltura e che possono causare differenze nei risultati e risultati, compresa l'efficienza differenziazione.

Tecniche di isolamento basati su marker:

CPC può essere isolato basato su un indicatore della superficie specifica espressione1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. Gli studi precedenti suggeriscono che il c-kit e Sca-1 può essere i migliori marcatori per isolare residente CPCs1,11,14,19,20. Perché nessuno di questi indicatori è veramente specifica per CPCs, solitamente vengono applicate le combinazioni di marcatori diversi. Ad esempio, mentre CPCs esprimono bassi livelli di c-kit21, c-kit è espressa anche da altri tipi di cellule, tra cui mastociti22, cellule endoteliali23e di cellule staminali/progenitrici ematopoietiche24. Un ulteriore problema è il fatto che non tutti gli indicatori sono espressi in tutte le specie. Questo è il caso per Sca-1, che si esprime nel topo ma non nell'umano25. Pertanto, utilizzando protocolli che sono indipendenti di marcatori di isolamento può essere vantaggioso in considerazione studi clinici e studi utilizzando campioni umani.

Tecniche di isolamento di marcatore indipendente:

Ci sono diverse tecniche principali di isolamento CPC, che sono principalmente indipendenti dell'espressione dei marker di superficie, ma che può essere affinata dalla selezione consecutiva di specifici marcatori positivi subfractions come necessario (vedere anche tabella 1). (1) la tecnica di popolazione (SP) lato originalmente è stata caratterizzata in una primitiva popolazione di cellule staminali ematopoietiche basato sulla capacità di deflusso il colorante DNA Hoechst 3334226 di ATP-binding cassette (ABC) trasportatori27. Cellule cardiache SP sono state isolate da diversi gruppi e segnalate per esprimere una varietà di indicatori con alcune lievi differenze tra rapporti2,8,13,14. (2) le cellule del fibroblasto unità formazione di colonie (CFU-Fs) originalmente sono state definite basato su una cellula stromal mesenchymal (MSC)-come il fenotipo. MSCs isolato sono coltivate su piatti per indurre la formazione della Colonia. Tale formazione di colonie MSC-come CFU-Fs possono essere isolate da cuore adulto e sono in grado di differenziarsi in lignaggi cardiaco15. (3) cellule cardiosfere (CDC) sono singole cellule derivate da aggregati di cellule coltivate da biopsie dei tessuti o espianti28,29,30,31. Recentemente è stato dimostrato che per lo più il CD105+/CD90 frazione di cellule /c-kit– –esibisce cardiomiogenici e potenziale rigenerativo32.

Qui, utilizzando SP-CPCs isolate da topi, forniamo un protocollo per l'induzione efficiente di stirpe endothelial basato su uno studio precedente in ratto CPCs e mouse SP-CPCs33. Il protocollo contiene specifici adattamenti alla cultura e tecnica di espansione per quanto riguarda la densità delle cellule, il contenuto di siero del mezzo e il substrato. Esso può essere applicato non solo al mouse SP-CPC ma di diversi tipi di CPC per lo scopo di indurre un interruttore di destino da un'amplificazione di un CPC endoteliale commesso, sia esso in considerazione il trapianto di queste cellule o dal loro impiego per gli studi meccanicistici in vitro .

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Protocollo

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L'uso di topi per scopo di isolamento cellulare era in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio e con la legge di protezione animale Svizzera ed è stato approvato dalle autorità cantonali svizzere.

Nota: L'isolamento di Sca-1+/CD31– SP-CPCs dal cuore del mouse essenzialmente è stato fatto come descritto in precedenza34 con alcune modifiche. Per i materiali e i reagenti utilizzati, Vedi Tabella materiali. Per tutti gli esperimenti, SP-CPCs cardiaci isolati da topi erano amplificati, attraversate e utilizzate in modo linea-come delle cellule. Per questo studio sono stati utilizzati passaggi 7-20.

1. tessuto preparazione

Nota: Tutti gli esperimenti utilizzando topi devono essere eseguiti secondo le linee guida e regolamenti. Questo protocollo utilizza quattro topi. Piastre di coltura che sono 100 mm di diametro sono descritti come P100 e piastre di coltura che sono di 60 mm di diametro sono descritti come P60 per le seguenti parti del protocollo.

  1. Iniettare ogni mouse con 200 mg/kg di pentobarbital intraperitonealmente (i.p.) e attendere fino a quando esso è completamente anestetizzato controllando la sua risposta per pizzicare le dita.
  2. Pulire il petto con etanolo al 70%. Tagliare la pelle e la parete toracica con le forbici per esporre la cavità toracica.
  3. Sollevare il cuore con il forcipe e tagliarlo alla base con le forbici. Mettere il cuore in un P100 con 25 mL (5 mL per P60) di freddo tampone fosfato salino (PBS) (tre-cinque cuori per P100) o uno o due cuori al P60.
  4. Pompare il cuore con il forcipe per espellere il sangue fuori le cavità (Figura 1A).
  5. Mettere il cuore in un P100 con 25 mL (5 mL per P60) di PBS freddo per il lavaggio. Rimuovere gli atrii utilizzando piccole forbici. Tagliare il cuore in due pezzi longitudinali e lavarli nuovamente in PBS ghiacciata (25 mL/P100, 5 mL/P60).
  6. Trasferire i pezzi a un nuovo P100 con 25 mL (5 mL per P60) di PBS freddo. Tagliare i pezzi in pezzi più piccoli utilizzando piccole forbici (Figura 1B). Aggiungere una goccia di collagenasi di 1mg/mL B diluito in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) e tritare i piccoli pezzi accuratamente con una lama di rasoio sterile (Figura 1).

2. la digestione

  1. Aggiungere 10 mL (2,5 mL per P60) di soluzione 1 mg/mL collagenosi B al piatto dal punto 1.6.
  2. Mettere la soluzione di collagenasi B contenente i pezzi di cuore macinate in un inclinato (circa 30°) P100 (o P60) in un incubatore a 37 ° C (Figura 1).
  3. Incubare i pezzi di cuore macinate per un massimo di 30 min; omogeneizzare ripetutamente passandoli attraverso una pipetta di Pasteur ogni 10 minuti durante l'incubazione (Figura 1E).
    Nota: È importante non superare i 30 minuti di incubazione in totale al punto 1.3.

3. filtrazione

  1. Aggiungere 10 mL (5 mL per P60) di freddo HBSS completata con 2% FBS per i pezzi di cuore macinate e omogeneizzato.
    Nota: HBSS completati con 2% FBS Placa collagenosi attività B.
  2. Filtrare i pezzi di cuore attraverso 100 μm, per rimuovere tessuto non digerito e centrifugare a 470 x g per 5 min a temperatura ambiente (TA) (Figura 1F, filtri gialli).
  3. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 5 mL (3 mL per P60) di tampone di lisi delle cellule di anima rosse e incubare il pellet per 5 minuti con agitazione occasionale sul ghiaccio.
  4. Aggiungere 10 mL (5 mL per P60) di PBS (per fermare la reazione di lisi) e filtrare il campione attraverso un filtro di 40 µm per escludere le celle più grandi, tra cui residuali cardiomiociti (Figura 1F, filtri blu).
  5. Centrifugare la provetta a 470 x g per 5 min a RT (senza freno). Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 1 mL di DMEM compreso 10% FBS.
  6. Contare le celle in una parte aliquota con un emocitometro. Risospendere le cellule con DMEM compreso 10% FBS, mirando ad una concentrazione di cella finale di 1 x 106 cellule/mL.
    Nota: Circa 5 x 106 cellule del cardiomyocyte - e dell'eritrocito-esaurito possono essere stimate per topo.
  7. Distribuire le cellule in due tubi (Figura 2): nel tubo A, aggiungere 1,5 mL per la Hoechst 33342 macchiatura con verapamil; in tubo B, aggiungere mL 18,5 per la macchiatura di Hoechst 33342 e procedere alla macchia e ordinare le cellule cardiache di SP (punti 4.1 e 4.2) tramite flusso cytometry.

4. l'ordinamento delle cellule cardiache SP tramite flusso Cytometry

Nota: Verapamil inibisce l'efflusso di Hoechst bloccando la resistenza del multidrug attività di trasportatore di ABC (MDR). Hoechst 33342 è una tintura di legame al DNA che può essere utilizzata in cellule viventi per rilevare il ciclo cellulare, come correla con il contenuto di DNA. Estrusione di Hoechst 33342 cellule appaiono nella parte bassa di Hoechst dei due canali di emissione (450 nm, Hoechst blu; 650 nm, Hoechst rosso), vale a dire mettere da parte la Hoechst-conservando "principale della popolazione", dando loro il loro nome "lato della popolazione". SP cellule sono arricchite in cellule con proprietà progenitore e mostrano un'alta espressione dei trasportatori di ABC multidrug-resistente (come MDR1 e ABCG2). Hoechst 33342 viene scritto come Hoechst per le seguenti parti del protocollo. È importante proteggere i materiali sensibili alla luce per risultati ottimali.

  1. Colorazione con Hoechst in presenza ed assenza di verapamil
    1. Aggiungere alla soluzione di cella verapamil (con una concentrazione finale di 83,3 µM) e Hoechst (con una concentrazione finale di 5 µ g/106 cellule). Per tubo A, utilizzare Verapamil e Hoechst; solo per tubo B, uso la Hoechst. Incubare a bagnomaria (a 37 ° C) per 90 min e ripristinare i tubi ogni 20 min (Figura 1).
    2. Centrifugare le provette a 470 x g per 5 min a RT. scartare il supernatante e risospendere ogni in HBSS (1 x 106 cellule/mL).
    3. Prendere un 1,5 mL aliquota per singolo stainings e controllo negativo dal tubo B (Figura 2): (i) isotiocianato di fluorescina (FITC)-coniugato anti-Sca-1; (ii) allophycocyanin (APC)-coniugato anti-CD31; (iii) nonstained cellule (controllo negativo).
      Nota: Controlli di isotipo vengono utilizzati qui per impostare il protocollo di isolamento.
    4. Centrifugare i tubi A e B e le aliquote di controllo singolo-macchiatura e negativo a 470 x g per 5 min a RT per il lavaggio, la Hoechst e verapamil.
    5. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet di tubo A e (iii) il controllo negativo in 250 µ l di HBSS e tenerli sul ghiaccio al buio fino a quando l'ordinamento.
    6. Risospendere il pellet del tubo B in 200 µ l di HBSS e il pellet (i, ii) le aliquote di singolo-macchiatura in 100 µ l di HBSS. Aggiungere FITC Coniugato anti-Sca-1 (0,6 µ g/107 cellule) e APC-coniugato anti-CD31 (0,25 µ g/107 cellule). Incubare i pellet per 30 min in ghiaccio e agitare loro di volta in volta nel buio.
    7. Aggiungere 2 mL di HBSS ai tubi. Centrifugare le provette a 470 x g per 5 minuti a TA.
    8. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet tutti con 1 mL di HBSS e centrifuga come sopra. Eliminare i sovranatante. Risospendere il pellet delle aliquote singolo-macchiatura in 200 µ l di HBSS. Risospendere il pellet del tubo B in HBSS (20 x 106 cellule/mL).
    9. Mantenere i campioni sul ghiaccio e al riparo dalla luce fino a quando l'ordinamento.
  2. Ordinamento con citometria a flusso
    1. Preparare sterili da 1,5 mL ordinamento tubi con 500 µ l di HBSS cui 2% FBS.
    2. Macchia le celle con 7-aminoactinomycin D (7-AAD) (0,15 µ g/106 cellule) in ghiaccio per 10 min per escludere le cellule morte.
    3. Ordinare la SP cardiaca utilizzando le seguenti impostazioni: eccitare Hoechst con 350 nm (UV) eccitazione, raccogliere l'emissione di fluorescenza con un filtro passa-banda di 450/50 nm (Hoechst blu) e un filtro passa-banda di 670/30 nm (Hoechst rosso) e utilizzare un ugello di 100 µm e pressione di 15 psi.
    4. Per l'analisi, registrare 5x105 eventi per gli esempi di ordinamento e 1 x 105 eventi per il controllo negativo, controllo di verapamil e singolo-macchiatura campioni.
      Nota: Il cardiaco SP è circa 0,5% - 2% (Figura 1 H), ma può variare tra i laboratori e gli isolati. La Sca-1+/CD31– frazione è di circa 1% - 11% del totale SP cardiaca (Figura 1I) ma possono variare tra i laboratori e gli isolati. SCA-1+/CD31– SP-CPC vengono scritti come SP-CPC per le seguenti parti del protocollo.

5. primaria cultura di isolato SP-CPC

Nota: Tre diversi tipi di media sono stati utilizzati in questo protocollo. Si riferiscono a come Medium 1 (secondo Noseda et al.) 8, 2 medio e medio 3 e sono descritte nella Tabella materiali per quanto riguarda la loro composizione.

  1. Warm up medio 1 a 37 ° C prima dell'uso e raffreddare la centrifuga a 4 ° C. Centrifugare le provette ordinamento a 4 ° C e 470 x g per 6 min e risospendere le cellule in media 1.
  2. Mettere le cellule su un piatto di P60 gas-permeabili con 4 mL di Medium 1. Modificare il mezzo ogni 3 d fino a quando le cellule hanno raggiunto la confluenza di 70-80%.
    Nota: Passaggio 5.2 potrebbe richiedere circa 2-3 settimane.

6. espansione e differenziazione di SP-CPC

  1. Coltura cellulare
    1. 3 x 105 SP-CPC in 8 mL di Medium 1 in una boccetta di T75 della coltura.
    2. Incubare SP-CPCs a 37 ° C con 5% CO2 fino al 70% - 80% confluenza, cambiando il mezzo ogni 2-3 d.
      Nota: Il numero di cellulare deve essere modificato secondo il tipo di CPC utilizzato, il tempo di raddoppiamento e le dimensioni della cella.
  2. SP-CPC crescita e redditività sotto le concentrazioni nel siero differenti
    1. Cultura SP-CPC per 2-3 d in T75 boccette con 8 mL di Medium 1. Attentamente aspirare il mezzo e risciacquare delicatamente con 5 mL di caldo (37 ° C) HBSS.
    2. Trattare le cellule con 5 mL di tripsina-EDTA per 5 min in incubatrice cella, aggiungere 5 mL di Medium 1 per interrompere l'attività della tripsina e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL.
    3. Centrifugare le cellule a 470 x g per 5 minuti a TA.
    4. Risospendere le cellule in Medium 1 o 2 Medium (lignaggio induzione Media) e piastra 2.5 x 105 SP-CPC il P60 piatti con 3 mL di terreno contenenti concentrazioni differenti.
    5. Raccogliere il mezzo dal piatto di passaggio 6.2.4 per la raccolta di cellule morte in una provetta da 15 mL dopo 2 d di coltura in media 1 o 2 Medium.
    6. Tripsinizzano cellule aderenti come descritto al punto 6.2.2 e raccogliere la sospensione cellulare nel tubo da 15 mL del punto 6.2.5. Centrifugare le cellule a 840 x g per 5 minuti a TA.
    7. Aspirare il supernatante e aggiungere 1 mL di Medium 1 o 2 Medium per il conteggio delle cellule. Macchia SP-CPC con trypan blu (0,4%) e conteggio trypan blu-positivo (morti) e trypan blu-negativo cellule (vitali).
      Nota: L'attuabilità delle cellule (passo 6.2.7) è dato come il numero di trypan blu-negativo delle cellule in relazione al numero totale delle cellule.
  3. Induzione di differenziazione endoteliale
    1. Precoat una piastra di coltura (6-bene) con 10 µ g/mL di laminina (LN) o fibronectina (FN).
      1. Fare una soluzione di substrato contenente 10 µ g/mL di LN o FN con F12 medio (o PBS). Aggiungere 2 mL di soluzione di substrato in ciascun pozzetto. Mantenere la piastra per 30 min a 37 ° C.
      2. Aspirare la soluzione dalla piastra e aggiungere 2 mL di PBS in ciascun pozzetto fino a usarlo.
    2. Aspirare il mezzo dalle cellule dal punto 6.1.2, sciacquare delicatamente con 5 mL di caldo (37 ° C) HBSS, li trattano con 5 mL di tripsina-EDTA per 5 min in incubatrice cella, aggiungere 5 mL di Medium 1 per interrompere l'attività della tripsina e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL.
    3. Centrifugare le cellule a 470 x g per 5 min a RT. aspirare il supernatante e aggiungere 2 Medium per il conteggio delle cellule.
    4. Cellule di4 seme 8 x 10 per bene sulla piastra rivestita con 3 mL di Medium 2 e tenerlo a 37 ° C per 20-24 h. cambiamento medio a 3 mL di Medium 3.
      Nota: Si consiglia di utilizzare mezzo contenente una concentrazione bassa nel siero — e senza supplementi — per i primi 20-24 h. Si consiglia di utilizzare < confluenza di 60% delle cellule (cioè, il numero di cellulare del passo 6.3.4 deve essere regolata a seconda del tasso di dimensione e la crescita delle cellule).
    5. Coltura delle cellule per 21D e sostituire il terreno ogni 3 d.
    6. Verificare la natura endothelial delle cellule differenziate dalla macchiatura li con un indicatore endothelial come von Willebrand Factor (vWF) e performanti microscopia di fluorescenza.
      1. Lavare le cellule con 1 mL di PBS e fissare le cellule in formaldeide del 3,7% per 2 minuti a TA.
      2. Permeabilize le cellule con 0.1% Triton X in ddH2O (o PBS) per 30 min e bloccarlo con 10% siero di capra per 1 h a TA.
      3. Incubare le cellule con anticorpo di anti-von Willebrand fattore (1: 100) per 48 h a 4 ° C
      4. Lavare le cellule 3 x con 1 mL di PBS, per 10 minuti ogni volta. Incubare a loro con anticorpo secondario anti-coniglio di capra a Alexa Fluor 546 (1: 500) per 1 h a temperatura ambiente al buio.
      5. Lavare nuovamente 3x, per 10 minuti ciascuno, con 1 mL di PBS. Macchia i nuclei cellulari con 4'6-diamidino-2-phenylindole, dicloridrato (DAPI; 1: 500) per 5 min a RT nel buio.
      6. Lavare le cellule 3 x, per 5 minuti ciascuno, con 1 mL di PBS. Montare le cellule e conservarli a 4 ° C
        Nota: Le condizioni di coltura (substrato, media, reagenti supplementari e concentrazione di FBS) di passaggi 6.1 e 6.3 sono descritti nella Figura 3.
  4. Analisi di formazione del tubo
    1. Preparare una matrice della membrana basale (ad es., Matrigel, qui di seguito definita matrice) piastra.
      1. Scongelare la matrice a 4 ° C durante la notte.
      2. Cappotto in una piastra a 96 pozzetti con 100 µ l della matrice sul ghiaccio.
        Nota: È importante evitare eventuali bolle nella matrice. Le piastre devono essere rivestiti sul ghiaccio per evitare la gelazione della matrice.
      3. Mantenere la piastra a 37 ° C per 30 min.
    2. Aspirare il mezzo dalle cellule (dopo il completamento del passaggio 6.3.5), delicatamente lavare le cellule con 5 mL di caldo (37 ° C) HBSS e trattarli con tripsina-EDTA per 5 min in incubatrice delle cellule. Aggiungere 3 Medium per arrestare l'attività della tripsina e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL.
    3. Centrifugare le cellule a 470 x g per 5 min a RT. aspirare il supernatante, aggiungere 1 mL di Medium 3 e dispensare lentamente.
    4. Le celle filtranti con un colino di cella 35 µm, se le cellule vengono aggregate.
    5. Contare le celle e seme 2 x 103 a 4 x 103 celle in 100 µ l di taglia media 3 in ciascuna matrice rivestite bene. Tenere la piastra a 37 ° C nell'incubatore delle cellule per 16 h.
    6. Scattare una foto con un microscopio a campo chiaro a 2 ingrandimenti.
      Nota: Nel caso di un'incompleta trypsinization, prolungare il tempo di esposizione di tripsina-EDTA ad un massimo di 7-8 min.

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Risultati

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Isolamento di SP-CPC del mouse:

In questo studio, abbiamo usato del mouse CPCs isolato secondo il fenotipo di SP, considerando che risultati da ratto CPC sono modificati e aggiunto da una precedente relazione con autorizzazione (Figura 8)33.

Proliferazione delle cellule in cella ad alta e bassa densità e con le concentraz...

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Discussione

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Vantaggi di questo protocollo:

Questo protocollo fornisce una tecnica di differenziazione endoteliale di CPC. Abbiamo trovato che una concentrazione bassa nel siero e la densità delle cellule basso potrebbe migliorare l'efficienza della differenziazione endoteliale, per cui LN ha dimostrato di essere un substrato più adatto di FN in queste condizioni. Abbiamo usato due tipi distinti di CPC: ratto CPCs, che sono stati utilizzati in maniera linea-come delle cellule e mouse SP-CPC, che sono stati is...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano Vera Lorenz per il suo sostegno utile durante gli esperimenti e il personale dell'impianto di citometria a flusso dal dipartimento di biomedicina (DBM), Università e ospedale universitario di Basilea. Questo lavoro è stato supportato dal soggiorno-su pista programma presso l'Università di Basilea (per Michika Mochizuki). Gabriela M. Kuster è sostenuta da una sovvenzione della Swiss National Science Foundation (concessione numero 310030_156953).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Terreno di coltura
Terreno di Dulbecco modificato di Iscove (IMDM)ThermoFisher#12440
Terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM)/Miscela di nutrienti F12 ProsciuttoMerck#D8437
Penicillina-Streptomicina (P/S)ThermoFisher#15140122
Fetale Bovino Siero (FBS)Clone#SH300713,5% (0,1% per induzione del lignaggio)
L-Glutammina ThermoFisher#25030Concentrazione finale 2 mM
GlutationeMerck#G6013
Fattore di crescita epidermico umano ricombinante (EGF)Peprotech#AF-100-15
Fattore di crescita dei fibroblasti basici ricombinante (FGF)Peprotech#AF-100-18B
Integratore B27ThermoFisher#17504044
Cardiotrofina 1 Peprotech#250-25
ThrombinDiagontech AG, Svizzera#100-125
Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-)ThermoFisher#14170
0,05 % Tripsina-EDTAThermoFisher#25300
T75 FlaskSarstedt#83.3911
Differenziazione endoteliale   
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKitLonza#CC-3162
Ham's F-12K (Kaighn's) MediumThermoFisher#21127
Laminin Merck#L2020
Fibronectina Merck#F4759Diluire in ddH2O
6 pozzetti PlateFalcon#353046
Soluzione di formaldeideMerck#F1635Diluite 1:10 in PBS (concentrazione finale 3,7%)
Triton X-100Merck#934200,1% in ddH2O
Normal Goat Serum (10%)ThermoFisher#50062Z
Anticorpo Fattore di von WillebrandAbcam#ab69941:100 in siero di capra al 10%
IgG anti-coniglio, Alexa Fluor 546ThermoFisher#A110101:500 in siero di capra al 10%
4',6-diamidino-2-fenilidolo, dicloridrato (DAPI)ThermoFisher#622471:500 in ddH2O 
Kit antisbiadimento SlowFadeThermoFisher#S2828
Microscopio a campo largo BX63Olympus
Tube formation
96 Well PlateFalcon#353072
ml Tubo a fondo tondo con tappo del filtroFalcon#352235
Matrigel Fattore di crescita ridottoCorning#354230
IX50 microscopio a campo largoOlympus
Sca-1+/CD31- isolamento della popolazione sul lato cardiaco34 
Reagenti
Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet.farmacia ospedaliera interna#9077862Soluzione di lavoro: 200 mg/kg
di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-)ThermoFisher#20012
Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), rosso fenolo (-)ThermoFisher#14175Preparare HBSS 500 mL + 2% FBS  per estinguere l'attività della collagenasi B 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1 g/l di D-glucosio, L-glutammina, piruvatoThermoFisher#331885Prepare DMEM + 10% FBS  + 25 mM HEPES+ P/S per Hoechst stanining
Penicillina-Streptomicina  (P/S)ThermoFisher#15140122
HEPES 1 MThermoFisher#15630080Concentrazione finale 25 mM
Siero fetale bovino (FBS)Clone#SH30071
Lisi dei globuli rossiTampone (10X)BioLegend#420301/100mLDiluire a 1X in ddH2O e filtrare attraverso un 0,2 µ m filtro
Collagenasi BMerck#11088807001Concentrazione finale 1 mg/mL in HBSS, filtrato attraverso un 0,2 µ m filtro
bisBenzimide H33342 Tricloridrato (Hoechst)Merck#B2261Preparare 1 mg/mL in ddH2O
Verapamil-cloridrato Merck#V4629Concentrazione finale 83,3 µ M 
APC Rat Anti-Mouse CD31BD Biosciences#5512620.25 µ g/107cells
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1)BD Biosciences#5574050.6 µ g/107cellule
7-aminoactinomicina D (7-ADD)ThermoFisher#A13100,15 &; g/106cells
APC ratto IgG2a k Controllo dell'isotipoBD Biosciences#5539320.25 &; g/107cells
FITC Rat IgG2a k Controllo dell'isotipoBD Biosciences#5546880.6 &; g/107cells
Material
Aghi 27GTerumo#NN-2719R
Aghi 18GTerumo#NN-1838S
Siringhe monouso 1 mL sterileCODAN#62.1640
Pipetta di trasferimento 3,5 mLSarstedt#86.1171.001
Cell Filtro 40 & micro; m bluBD Biosciences #352340
Filtro cellulare 100 µ m gialloBD Biosciences#352360
Lumox Dish 50Sarstedt#94.6077.305
Piatti di coltura P100Corning#353003
Piatti di coltura P60Corning#353004
Mouse
LineAgeBreeding
C57BL/6NRj / maschio12 settimanein house
Nome del prodottoCompanyCatalogue No.
Reagents
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)ThermoFisher#12440
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Miscela di nutrienti F12 ProsciuttoMerck#D8437
Penicillina-Streptomicina  (P/S)ThermoFisher#15140122
Siero Fetale Bovino (FBS)Clone#SH30071
L-Glutammina ThermoFisher#25030
Integratore di glutationeMerck#G6013
B27ThermoFisher#17504044
Fattore di crescita epidermico umano ricombinante (EGF)Peprotech#AF-100-15
Fattore di crescita dei fibroblasti basici ricombinanti (FGF)Peprotech#AF-100-18B
Cardiotrofina 1 Peprotech#250-25
ThrombinDiagontech AG, Svizzera #100-125
Terreno di crescita delle cellule endoteliali (EGM)-2 BulletKitLonza#CC-3162
Panoramica delle composizioni dei terreni. Alcune di queste informazioni sono identiche a quelle fornite sopra, ma ordinate in base alla composizione dei Media 1-3.
Nome del ProdottoMedium 18<strong>Medium 2Medium 3
ReagentsCultureLineage inductionEndoteliale diff.
Terreno di Dulbecco modificato di Iscove (IMDM)35%35%
Mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM)/Miscela di nutrienti F12 Prosciutto65%65%
Penicillina-Streptomicina  (P/S)1%1%
Siero fetale bovino (FBS)3,5%≤ 0,1%
di L-glutammina 2 mM2 mM
Glutatione0,2 nM0,2 nM
Integratore di B271,3%
Fattore di crescita epidermico umano ricombinante (EGF)6,5 ng/mL
Fattore di crescita dei fibroblasti basici ricombinanti (FGF)13 ng/mL
Cardiotrofina 1 0,65 ng/mL
Trombina0,0005 U/mLTutti i componenti necessari inclusi nel kit
Terreno di crescita delle cellule endoteliali (EGM)-2 BulletKitTutti i componenti necessari inclusi nel kit
5

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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