Articolo metodologico

Una galleria del vento per odore mediata saggi comportamentali dell'insetto

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DOI:

10.3791/58385

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30 novembre 2018

 ,  ,  , 
1Division of Biotechnology and Plant Health, Norwegian Institute of Bioeconomy Research (Nibio), 2Integrated Plant Protection Unit, Department of Plant Protection Biology, Swedish University of Agricultural Science, 3Department of Pest Control, Norwegian Institute of Public Health

In questo articolo

Sommario

Qui, descriviamo la costruzione e l'uso di una galleria del vento per odore mediata saggi comportamentali con gli insetti. Il design di Galleria del vento facilita il rilascio di fonti di odore di diversi metodi, con e senza stimoli visivi. Esperimenti in galleria del vento sono importanti metodi per identificare le sostanze chimiche volatili comportamentale attive.

Abstract

L'olfatto è il più importante meccanismo sensoriale da cui molti insetti interagiscano con l'ambiente e una galleria del vento è un ottimo strumento per lo studio di ecologia chimica degli insetti. Gli insetti possono individuare le fonti di punto in un ambiente tridimensionale attraverso l'interazione sensoriale e sofisticato comportamento. La quantificazione di questo comportamento è un elemento chiave nello sviluppo di nuovi strumenti per il supporto di decisione e di controllo dei parassiti. Una galleria del vento con una sezione di volo adatto con flusso d'aria laminare, visual cues per feedback in volo e una varietà di opzioni per l'applicazione di odori può essere utilizzata per misurare il comportamento complesso che successivamente può consentire l'identificazione di attraente o gli odori repellenti, caratteristiche di volo dell'insetto, visual-odore interazioni e interazioni tra attrattivi e odori persistenti come gli odori di fondo nell'ambiente. Una galleria del vento ha il vantaggio di studiare l'odore mediata repertorio comportamentale di un insetto in una regolazione del laboratorio. Misure comportamentali in un ambiente controllato forniscono il collegamento tra la fisiologia dell'insetto e applicazione sul campo. Una galleria del vento deve essere uno strumento flessibile e dovrebbe supportare facilmente le modifiche per l'installazione e l'hardware per soddisfare domande di ricerca diversi. Il principale svantaggio per il setup di Galleria del vento descritto qui, è lo sfondo pulito odore che richiede particolare attenzione quando si sviluppa una miscela sintetica volatile per applicazione sul campo.

Introduzione

Galleria del vento è uno strumento importante negli studi di ecologia chimica degli insetti che consentono prove di laboratorio delle risposte di volo dell'insetto di semiochimici. Rilasciando odori in un flusso di vento controllata, risposta comportamentale degli insetti a questi stimoli possa essere controllato direttamente da studiare il loro volo controvento verso la sorgente. L'olfatto è il più importante meccanismo sensoriale mediante il quale molti insetti interagiscono con loro ambiente biotico1. Insetti utilizzano odore indicazioni per trovare partner adeguati per l'accoppiamento. Allo stesso modo, usano mazzi di odore da risorse host per trovare cibo per se stessi, o la prole. Piante rilasciano odori floreali in combinazione con le ricompense di nettare e polline per garantire efficienza di impollinazione degli insetti. Tutti questi spunti volatili diffondono passivamente l'ambiente e gli insetti è necessario da identificare e interpretare la loro rilevanza individuale. Rilascio di sostanze volatili nell'ambiente, le molecole di viaggiano con il vento come filamenti, mantenendo la concentrazione iniziale per lunghe distanze sottovento, prima alla fine essere rotto e diluito di turbolenza e diffusione2. Insetti in grado di rilevare piccoli cambiamenti in volatile del segnale e dirigono il loro movimento controvento, verso la sorgente. Gli insetti visualizzano un comportamento di volo con picchi di bolina veloce quando in contatto con un odore attraente e casting lateralmente della perdita di delocalizzare l'odore del pennacchio3,4. La disposizione co-localizzata dei neuroni olfattivi in sensilli delle antenne degli insetti può facilitare le risposte comportamentali per l'inizio e la perdita di contatto Pennacchio con notevole alta risoluzione5 e attivare gli insetti distinguere tra simili molecole di odore proveniente da diverse fonti6. Feedback visivo mentre in volo, chiamato optomotor anemotaxis, è fondamentale per identificare la direzione del vento, oggetti e spostamento relativo2,7. Mediante l'uso di interazione sensoriale e comportamento sofisticato, insetti possono individuare fonti puntuali in un ambiente tridimensionale.

L'identificazione dell'insetto attrattivi e repellenti può avere alcuni importanti aspetti applicati. I feromoni sessuali (segnali intraspecifici) di molti parassiti insetti possono essere sintetizzati e rilasciati nell'aria di perturbare il comportamento accoppiamento8. Feromoni sia cairomoni (segnali interspecifici) possono essere utilizzato per il mass trapping, ottenere e uccidono nel monitoraggio trappole per dare informazioni dirette dello status dei parassiti. Repellenti per insetti, ad esempio per le zanzare9, inoltre possono essere studiate in galleria del vento analisi biologiche. Questi metodi gioca una parte importante della lotta integrata gestione sistemi e supporto decisionale per gli agricoltori.

Analisi biologiche di Galleria del vento, dove il repertorio di comportamento mediata odore di una specie può essere controllato, è un metodo potente per identificare potenziali nuovi strumenti per il controllo dei parassiti sostituire o ridurre l'impatto dell'uso di pesticidi.

Il ragionamento teorico dietro il design di Galleria del vento è accuratamente descritto di10. Qui, descriviamo la costruzione della galleria del vento, applicazione di odore e comportamento di volo che è stato utilizzato in diversi esperimenti per determinare il protocollo di analisi biologica di Galleria del vento. La Galleria del vento (Figura 1) Nibio (Ås, Norvegia) è realizzata in policarbonato trasparente antigraffio. L'arena di volo è alta 67 cm, larghezza 88 cm e 200 cm di lunghezza. Davanti all'arena di volo, c'è una sezione aggiuntiva in policarbonato, lungo 30 cm. Questa parte della galleria del vento serve come una sezione di utilità per l'applicazione di odori. Se le sostanze volatili entrare in contatto con il policarbonato alloggiamento nell'arena di volo, può essere più tardi ripubblicati e contaminare tra le sessioni. Su ciascuna estremità della sezione Utilità, quindi c'è una griglia di metallo perforata. Entrambe le griglie limitano il flusso d'aria e creare una leggera sovrappressione sul lato sopravento. Conseguente aumento del flusso laminare sul lato sottovento. La griglia di bolina è fatto da una lamiera forata con fori 8 mm uniformemente dispersi in tutta la sezione trasversale del traforo per fornire 54% di area aperta. La griglia sottovento ha fori di 3 mm e un 51% di area aperta. Questo riduce la turbolenza e garantisce che l'odore viaggi centralmente tutta la lunghezza del campo di volo del pennacchio. Il pennacchio odore avrà la forma di un cono stretto e possa essere visualizzato mediante l'uso di fumo. Il piano del volo arena, plastica o carta cerchi di diverse dimensioni (da 5 a 15 cm di diametro) sono disposti a fornire un feedback visivo di insetti durante il volo. C'è una porta di accesso di 25 di 50 cm sul lato sopravento dell'arena volo e nella sezione utilità. Tra la fine sottovento dell'arena volo e la sezione di filtro di scarico, c'è una area aperta di 60 cm per la movimentazione dell'insetto. Questa zona di accesso è coperta sui lati con un tessuto di 0,8 mm a maglie per evitare gli insetti fuga nella stanza.

L'aria è estratta nell'alloggiamento del filtro prima da un ventilatore. L'aria passa attraverso un filtro di polvere prima di essere purificato da 24 filtri a carboni attivi ad alta capacità e rilasciato nel tunnel. L'aria in uscita del tunnel viene passato attraverso un alloggiamento filtro simili prima di essere rilasciato nuovamente dentro la stanza. Potrebbe essere vantaggioso per l'aria verso l'esterno dell'edificio attraverso una cappa di scarico. I tifosi su entrambi gli alloggiamenti filtro vengono eseguiti con flusso uguale. Entrambi appassionati di possiedono un dimmer switch continuo e sono tarati a diverse velocità del vento utilizzando un misuratore di portata. La velocità dell'aria dipende dalla specie testate. cm 30 s-1 è spesso un buon punto di partenza. Per piccoli insetti, la velocità dell'aria ideale può essere ridotta e forte Flyer e la verlocità relativa può essere superiore per aumentare la distanza di volo relativo.

La camera di Galleria del vento facilita il controllo di temperatura, umidità e intensità della luce. Strisce di LED sono posizionati dietro un riquadro di poly(methyl methacrylate) opaca di 3 mm per creare una fonte di luce diffusa sopra e dietro l'arena di volo. Due fonti di luce possono essere controllate in modo indipendente.

Applicazione di odore può essere realizzato con diversi mezzi. Generalmente, gli odori vengono rilasciati il flusso d'aria al centro dell'estremità sopravento dell'arena volo. In base alle domande di ricerca a portata di mano, il punto di rilascio possa essere esposti o coperto. Un cilindro di vetro (diametro di 10 cm, 12,5 cm di lunghezza) con una rete metallica (2 × 2 mm maglia taglia) sul lato sottovento visivamente può bloccare la fonte degli odori e allo stesso tempo servire come una piattaforma di atterraggio per gli insetti. In molti esperimenti, una piattaforma di vetro orizzontale può essere utilizzata per la presentazione delle fonti di odore, o segnali visivi vicino al punto di rilascio. C'è anche la possibilità di rilasciare due odori allo stesso tempo, fianco a fianco, per facilitare le analisi scelta. I punti di rilascio sono quindi posizionati 20 cm tra loro e i pennacchi odore si sovrappongono a metà strada lungo il tunnel. La scelta può quindi essere identificata da cui pennacchio l'insetto sta seguendo controvento.

Il design di Galleria del vento facilita numerosi metodi di rilascio volatili. Ad esempio, può essere rilasciato un odore specifico davanti a un odore di sfondo come emesso da un raccolto pianta11,12. Inoltre, diversi stimoli visivi possono essere testato13,14. La messa a punto sperimentale deve essere adattato ad ogni domanda di specie e di ricerca.

Fonti di odore naturale, quali parti della pianta e odori sintetici dai dispenser possono essere introdotto direttamente nel campo di volo. Per isolare i comportamenti di odore mediata da visual, la fonte degli odori può essere coperto o sostanze volatili trasportati nell'arena volo tramite un rifornimento di aria di carbone laboratorio filtrata dall'esterno. La fonte degli odori è quindi limitata ad un barattolo di vetro e l'aria viene spinta attraverso il vaso in galleria del vento tramite tubi di Teflon e tubi di vetro. La verlocità relativa al punto di rilascio deve corrispondere la velocità del vento nell'arena.

Per rilasciare odori a rapporti di miscela specifica, può essere utilizzato uno spruzzatore. Lo spruzzatore è un ultrasonico dell'ugello con una punta conica e un microbore inserito per facilitare un flusso liquido a 10 µ l min-1. L'ugello è collegato ad un generatore di ultrasuoni a banda larga e funziona a 120 kHz. Una pompa a siringa sta spingendo il campione di odore nell'ugello spruzzatore. Tubazione di gas fluorurati etilene propilene (FEP) con diametro interno mm 0,12 è collegare la siringa da 1 mL tenuta di gas e l'ugello. Adattatori di tubi che si gonfiano in etanolo e ridursi in aria, facilitare stretto raccordo con nessun volume interno. La dimensione delle goccioline di aerosol generata dalla vibrazione dell'ugello è frequenza dipendente e dipende il solvente specifico utilizzato. Le piccole goccioline evaporano e sono portate verso il basso la Galleria del vento come sostanze volatili. Esistono anche altri disegni di spruzzatore e una versione più economica che utilizza un piezo guidato vetro capillare fornisce una soluzione simile15.

Miscele sintetiche o collezioni di spazio di testa possono essere utilizzati con lo spruzzatore. I campioni vengono diluiti con etanolo puro alla concentrazione desiderata. Con collezioni di volatili, il campione può essere diluito per riflettere il tempo di raccolta. Ciò significa che una collezione di volatile campionata oltre 3 h deve essere diluita a 1800 µ l, che in un comunicato dallo spruzzatore a 10 µ l min-1 è pari a 3 h.

L'identificazione del comportamento di volo può essere fatto direttamente da osservazione manuale o da analisi post-hoc dei video. Il volo orientato dovrebbe essere distinto dal volo casuale. Odore mediata comportamento possa essere riconosciuto dalle seguenti caratteristiche: volo a zig-zag attraverso l'odore del pennacchio, volo dritto controvento quando all'interno il pennacchio, e looping indietro se il contatto con il pennacchio viene perso. Al momento della perdita di un pennacchio di attraente, gli insetti possono anche iniziare a zig-zag con l'aumento di archi di riconnettersi al pennacchio perso3,4. Questo comportamento è fondamentale in un ambiente di campo dove gli insetti seguendo un odore attraente bisogno di affrontare la turbolenza e spostando le direzioni del vento. Il modello di volo non è uniforme e varia a seconda degli ordini dell'insetto. Ad esempio, volantini forte come mosche carnarie hanno un orientamento controvento più velocemente con più ampio modello di colata di falene, e per facilitare un percorso relativo volo più lungo è necessario aumentare la velocità del vento.

Il volo di un insetto può anche essere filmato. Con una singola telecamera, caratteristiche di volo semplice possono essere descritto da tracciare le coordinate y di x16. Utilizzando due telecamere con acquisizione sincronizzata, il volo 3D può essere ricostruito utilizzando un software esterno17. La pista di volo possa poi essere analizzata per dare informazioni sulla distanza, gli angoli di volo rispetto alla direzione del vento, la velocità di volo e i dettagli circa le caratteristiche di volo in relazione il pennacchio di odore. Ci sono software disponibile che consentono il tracciamento automatico di fotogramma per fotogramma e attrezzature personalizzate e commerciali. I telai di calibrazione dovrebbero essere utilizzati per fare riferimento spazio del mondo reale, e lenti grandangolari rettilineo devono essere utilizzati per ridurre al minimo la distorsione della lente. Cura dovrebbe essere presa per ridurre il rumore di sottofondo visual, ad esempio bordi e gli angoli nell'arena di Galleria del vento e massimizzare insetto alla discriminazione di sfondo. Utilizzando una sorgente di luce a infrarossi, la riflessione (ad es., dalle zanzare nocturnal) può essere filmato con monocromatica CCD telecamere17.

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Protocollo

1. preparazione dei tubi di vetro

  1. Preparare i tubi di vetro (ad es., 2,8 cm di diametro, lungo 13 cm) e chiudere un'estremità con un tappo a scatto in plastica.
  2. Separare i tubi di vetro con un massimo di 10 insetti e coprire l'estremità rimanente con garza utilizzando un nastro di gomma. Consentire gli insetti acclimatare alla temperatura, condizioni di luce e umidità della stanza Galleria del vento per almeno 2 h.
    Nota: Il numero di insetti all'interno di ogni tubo dipende la domanda di specie e di ricerca.

2. preparazione delle fonti di odore

  1. Protocollo di spruzzatore.
    1. Riempire la siringa da 1 mL tenuta di gas con una collezione di headspace diluito o un mix di odore sintetico.
      Nota: Il contenuto del headspace diluito o mix di odore sintetico dipende dalla domanda di ricerca e specie dell'insetto. In generale, le concentrazioni utilizzate dovrebbero corrispondere ai tassi di rilascio naturale della fonte autentica degli odori.
    2. Collegare la punta della siringa per la tubazione di FEP utilizzando tubi adattatori e inserire la siringa nella pompa a siringa.
    3. Avviare la pompa a siringa.
    4. Avviare il generatore di ultrasuoni a banda larga.
      Nota: Il rilascio dell'aerosol dallo spruzzatore può essere confermato puntando una torcia luce da sotto il punto di rilascio.
    5. Tra i trattamenti per pulire l'interno dei tubi e ugelli, eseguire lo spruzzatore con etanolo al 96% per un minimo di 10 min. Utilizzare una siringa diversa, dedicata a etanolo puro, per tutte le pulizie.
    6. Dopo l'uso, pulire le siringhe e la punta dell'ugello con etanolo al 96%.
  2. Protocollo di origine di autentico odore.
    1. Inserire le fonti di odore autentico in galleria del vento o in un vaso di raccolta headspace 2 L.
    2. Collegare il vaso di raccolta spazio di testa al flusso d'aria di laboratorio e rilasciare in galleria del vento.
      Nota: Pianta raccogliere materiale come chiudere all'inizio degli esperimenti possibili e prevenire l'avvizzimento inserendo l'estremità tagliata in un piccolo flacone con acqua. La quantità e tipo di materiale vegetale o altra fonte di odore autentico, dipende dalla domanda di ricerca e specie dell'insetto.
  3. Posizionare il tubo di vetro con il insect(s) su un supporto 180cm sottovento dalla fonte di odore/visual e 30 cm da terra. L'estremità livellata deve puntare controvento.

3. il protocollo a partire

  1. Utilizzare due telecamere per catturare due diversi punti di vista. Montare le telecamere sopra l'arena di volo e angolata per catturare due diversi punti di vista.
  2. Aprire il tappo.
  3. Avviare il timer.
    Nota: Diverse specie richiedono tempi diversi per rispondere, ad es., la falena di frutta di apple (Argyresthia conjugella) risponderà entro 4 o 5 min11, ma la falena grapewine (Lobesia botrana) richiedono fino a 20 min a rispondere 18.
  4. Osservare il modello di volo e prestare particolare attenzione alle caratteristiche di volo e orientamento controvento. Punteggio ottenuto le prestazioni di volo in base alle categorie comportamentali predefinite, ad es., decollo, volo volo orientato sopra una distanza corta (minimo 20 cm), orientato su distanza maggiore (< 5 cm dalla sorgente) e l'atterraggio.
    Nota: Le riprese e tracking 3D utilizzando due telecamere utilizzabile per dare informazioni più dettagliate sulle caratteristiche di volo. In generale, le telecamere sono montate sopra l'arena di volo e angolate per catturare due diversi punti di vista.
  5. Raccogliere gli insetti atterraggio sulle pareti della galleria del vento, fuori il pennacchio di odore e sostituire indietro sul supporto.
    Nota: Gli insetti possono essere dato una possibilità di rispondere agli odori con volo di bolina e non sostituito.
  6. Cambiare per pulire vetro hardware tra i trattamenti.
    Nota: Controllo frequenti trattamenti devono essere eseguiti per identificare fonti di possibile contaminazione.
  7. Gli insetti con CO2 o di congelamento dopo gli esperimenti di eutanasia.
    Nota: A seconda della domanda di ricerca, le femmine possono essere segnate per lo sviluppo dell'uovo o ispezionate visivamente per verificare la condizione di ali o antenne.

4. pulizia

  1. Lavare tutti i componenti hardware in metallo e vetro con etanolo e acqua e lasciare fino a secco.
  2. Riscaldare tutto l'hardware in metallo e vetro a 300 ° C per 6 h rimuovere i contaminanti.

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Risultati

Mosche carnarie risponde fortemente agli odori da animali morti che rappresenta un substrato di crescita larvale effimera19,20. Utilizzando topi morti come una fonte di odore naturale, abbiamo studiato i dettagli del comportamento di volo di 15 giorno vecchio, accoppiata femminile c. vicina, con o senza, un stimoli visivi accanto l'odore release punto13. Per eliminare il segnale visivo naturale, ab...

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Discussione

Galleria del vento è uno strumento utile per identificare gli odori sia attraenti e repellenti per molti insetti4,9. Con buona conoscenza della ecologia, biologia e comportamento dell'insetto ha studiato, le sue caratteristiche di volo possono essere facilmente identificati e le condizioni ambientali, velocità del vento, stimoli visivi e applicazione di odore può essere adattati. È consigliabile quando si inizia con una nuova specie, di mettere a punto i parametr...

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Ringraziamenti

Tasin M. è stata sostenuta dal Consiglio di ricerca svedese per lo sviluppo sostenibile (Formas, Grant 2013-934).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Arena di voloqualsiasiNACostruire per adattarsi all'alloggiamento del filtro Alloggiamento del
filtro x 2Camfill FarrContiene i filtri per polvere e carbone
Ventola x 2FischbachModello D640/E35Ventola silenziosa con interruttore dimmer continuo
Griglie perforatequalsiasiNASono necessarie due diverse aree aperte, ad esempio 54 e 51%
FlussometroSwema airSwema air 300Identificazione della velocità del vento
Spruzzatore ad ultrasuoniSonoTekUgello spruzzatore con punta conica e microforo inserito
Generatore di ultrasuoni a banda largaSonoTekGeneratore di funzioni
Pompa a siringaCMA microdialisiCMA 102di erogazione del liquido
Microdialisi0,12 mm interno diametro
Adattatori per tubiMicrodialisiConnettori per volume interno zero
Siringa a tenuta di gasqualsiasiNA1000 e micro; Siringa L per raccolte nello spazio di testa e miscele sintetiche
Siringa a tenuta di gasqualsiasi NA1000 & micro; L siringa per la pulizia dello spruzzatore
TorciaqualsiasiNAPiccola fonte di luce per il controllo del rilascio dello spruzzatore
TimerqualsiasiNATimer con funzione di allarme 
Supporto per il rilascio degli insettiqualsiasiNACostruzione metallica
IlluminazionequalsiasiNA LED è preferibile a causa della bassa produzione di calore
Crema idratantequalsiasiNALa dimensione dipende dal volume della galleria del vento della stanza Controllo della
temperaturaqualsiasiNAL'intervallo di temperatura dipende dalla specie
Tubi di vetroqualsiasiNATubi (2,8 cm di diametro, 13 cm di lunghezza) per  insetti
Tappo a scattoqualsiasiNATappo a scatto che si adatta al tubo di vetro
GarzaqualsiasiNATessuto per chiudere il tubo di vetro
ElasticoqualsiasiNAPer tenere la garza in posizione
Cilindro di vetroqualsiasiNACilindro per il contenimento degli odori e la piattaforma di atterraggio (10 cm di diametro, 12,5 cm di lunghezza)
Barattoli di vetroqualsiasiNABarattoli di vetro per la raccolta dinamica dello spazio di testa
Connettori e tubiqualsiasiNATubi e connettori a seconda del tipo di barattoli di vetro
Alimentazione dell'ariaqualsiasiNADall'aria di laboratorio o dalle bottiglie
Filtri al carbonequalsiasiNAPer la pulizia dell'aria esterna Sypply
FialaqualsiasiNAPiccola fiala con acqua per mantenere fresco il materiale vegetale
FornoqualsiasiNARiscaldare il metallo e la vetreria a 300 gradi per decontaminare
Tubo FEP CMA CMA

Riferimenti

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