Qui, un protocollo per analisi di medio-alto rendimento degli eventi di fosforilazione della proteina a livello cellulare è presentato. Phospho flusso cytometry è un approccio potente per caratterizzare la segnalazione aberrazioni, identificare e validare biomarcatori e valutare farmacodinamica.
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Articolo metodologico
Citometria a flusso di phospho con codici a barre fluorescenti cella per cella singola segnalazione analisi e scoperta del biomarcatore
In questo articolo
Sommario
Abstract
Segnalazione delle cellule aberranti svolge un ruolo centrale nello sviluppo del cancro e nella progressione. Più nuove terapie mirate sono infatti diretti alle proteine e le funzioni della proteina, e aberrazioni segnalazione cellulare possono quindi servire come biomarcatori per indicare le opzioni di trattamento personalizzato. Al contrario di analisi del DNA e RNA, cambiamenti nell'attività della proteina in modo più efficiente possono valutare i meccanismi di resistenza e sensibilità ai farmaci. Citometria a flusso di phospho è una tecnica potente che misura gli eventi di fosforilazione della proteina a livello cellulare, una caratteristica importante che distingue questo metodo da altri approcci basati su anticorpi. Il metodo consente l'analisi simultanea di più proteine di segnalazione. In combinazione con codici a barre delle cellule fluorescenti, grandi insiemi di dati medio-alto rendimento possono essere acquisite da citometro standard hardware in breve tempo. Phospho flusso cytometry ha applicazioni sia negli studi di biologia di base e ricerca clinica, tra cui analisi, scoperta del biomarcatore e valutazione della farmacodinamica di segnalazione. Qui, un dettagliato protocollo sperimentale è previsto per fosfo analisi del flusso delle cellule mononucleari del sangue periferico purificata, utilizzando cellule di leucemia linfatica cronica come esempio.
Introduzione
Citometria a flusso di phospho viene utilizzato per analizzare i livelli di fosforilazione della proteina a cella singola risoluzione. L'obiettivo generale del metodo è di mappare i modelli di segnalazione cellulare in determinate condizioni. Sfruttando la capacità multiparametrica di citometria a flusso, parecchie vie di segnalazione possono essere analizzate simultaneamente in diversi sottogruppi di una popolazione cellulare eterogenea come sangue periferico. Queste caratteristiche offrono vantaggi rispetto ad altre tecnologie basate su anticorpi quali immunoistochimica, analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA), matrice di proteine e fase inversa protein....
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Protocollo
Campioni di sangue sono stati ricevuti a seguito di consenso informato scritto da tutti i donatori. Lo studio è stato approvato dal Comitato regionale per il medico e salute ricerca etica della Norvegia sud-est e la ricerca su sangue umano è stata condotta in conformità con la dichiarazione di Helsinki8.
Nota: Passaggi 1-3 devono essere eseguiti in condizioni di sterilità in un cappuccio di coltura del tessuto.
1. isolamento di cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs) da campioni di sangue del paziente di CLL
Attenzione: Il sangue umano ....
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Risultati
Le fasi principali del protocollo fosfo flusso cytometry sono illustrate nella Figura 1A. Nell'esempio presentato, cellule di CLL sono state macchiate con il reagente di codici a barre Pacific Blue a quattro diluizioni. Codici a barre tridimensionale può essere eseguita combinando tre coloranti di codici a barre, come illustrato in Figura 1B. I singoli campioni sono poi riconducibili di gating successive su ogni barcoding reagent.......
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Discussione
Citometria a flusso di phospho è una tecnica potente per misurare i livelli di fosforilazione della proteina in cellule singole. Poiché il metodo si basa su macchiando con gli anticorpi, citometria a flusso di phospho è limitata dalla disponibilità di anticorpo. Inoltre, al fine di ottenere risultati affidabili, tutti gli anticorpi dovrebbero essere titolati e verificati prima dell'uso. Un protocollo dettagliato per la titolazione di anticorpi fosfo-specifici è stato descritto altrove12. Durante l.......
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Dichiarazioni
L'autore non ha nulla di divulgare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato condotto nel laboratorio del Professor Kjetil Taskén ed è stato sostenuto dal norvegese Cancer Society e Stiftelsen Kristian Gerhard Jebsen. Johannes Landskron e Marianne Enger sono riconosciuti per la lettura critica del manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | Terreno di coltura cellulare |
| Siero fetale bovino | ThermoFisher Scientific | 10270169 | Additivo al terreno di coltura cellulare |
| Piruvato di sodio | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | Additivo al terreno di coltura cellulare |
| MEM aminoacidi non essenziali | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | Additivo al terreno di coltura cellulare |
| Lymphoprep | Alere Technologies AS | 1114547 | Mezzo di gradiente di densità |
| Anti-IgM | Southern Biotech | 2022-01 | Per la stimolazione del recettore delle cellule B |
| BD Phosflow Fix Buffer I | BD BD | 557870 | Tampone di fissazione |
| BD Phosflow Perm Buffer III | BD | 558050 | Tampone di permeabilizzazione |
| Alexa Fluor 488 5-TFP | ThermoFisher Scientific | A30005 | Reagente per codici a barre |
| Blue Succinimidyl Ester | ThermoFisher Scientific | P10163 | Reagente per codici a barre |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, sale di trietilammonio | ThermoFisher Scientific | P30253 | Reagente per codici a barre |
| Perline di compensazione | Definito dall'utente | Specie corretta reattività | |
| Provette Falcon< | em>Definito dall'utente | ||
| Provette Eppendorf | Definito dall'utente | ||
| 96 piastre con fondo a V | Definito dall'utente | Compatibile con il citometro a flusso | |
| Centrifughe | Definito dall'utente | Per provette Eppendorf, provette Falcon e piastre | |
| Bagnomaria | Definito dall'utente | flusso a temperatura regolata | |
| Definito dall'utente | Con campionatore ad alta produttività (HTS) | ||
| Name | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| < strong>Antigene | |||
| AKT (pS473) | Cell Signaling Technologies | 4075 | Clone: D9E Reference: Myhrvold et al., 2018, Profilazione cellulare singola dei livelli di fosfo-proteina in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Gli inibitori della tirosin-chinasi della milza riducono…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skå nland et al., 2014, Co-stimolazione delle cellule T attraverso il CD2 e il CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulazione della segnalazione prossimale in normali e trasformati…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| ATF-2 (pT71) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8398 | Clone: F-1 Riferimento: Sciå nland et al., 2014, Co-stimolazione delle cellule T attraverso il CD2 e il CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, L'interleuchina-33 guida un endotelico proinfiammatorio…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| BLNK (pY84) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558443 | Clone: J117-1278 Riferimento: Myhrvold et al., 2018, Profilazione cellulare singola dei livelli di fosfo-proteina in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Kalland et al., 2012, Modulazione della segnalazione prossimale in normali e trasformati…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Modelli distinti di segnalazione del recettore delle cellule B in…, Sangue, 129(6): 759-770 |
| Btk (pY223)/Itk (pY180) | Beckton Dickinson Pharmingen | 564846 | Clone: N35-86 Reference: Myklebust et al., 2017, Modelli distinti di segnalazione del recettore delle cellule B in…, Sangue, 129(6): 759-770 |
| Btk (pY551) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558129 | Clone: 24a/BTK (Y551) Reference: Kalland et al., 2012, Modulazione della segnalazione prossimale in normali e trasformati…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| Btk (pY551)/Itk (pY511) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558134 | Clone: 24a/BTK (Y551) Riferimento: Myhrvold et al., 2018, Profilazione a cellula singola dei livelli di fosfo-proteina in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Gli inibitori della tirosin-chinasi della milza riducono…, Haematologica, 101(2):e59-62 |
| CD3ζ (pY142) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558489 | Clone: K25-407.69 Riferimento: Skå nland et al., 2014, Co-stimolazione delle cellule T attraverso il CD2 e il CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| Histone H3 (pS10) | Cell Signaling Technologies | 9716 | Clone: D2C8 Reference: Myhrvold et al., 2018, Profilazione cellulare singola dei livelli di fosfo-proteina in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| Iκ B&alfa; | Cell Signaling Technologies | 5743 | Clone: L35A5 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| LAT (pY171) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558518 | Clone: I58-1169 Reference: Sciå nland et al., 2014, Co-stimolazione delle cellule T attraverso il CD2 e il CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| Lck (pY505) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558577 | Clone: 4/LCK-Y505 Riferimento: Myhrvold et al., 2018, Profilazione su singola cellula dei livelli di fosfo-proteina in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| MEK1 (pS298) | Beckton Dickinson Pharmingen | 560043 | Clone: J114-64 Reference: Myhrvold et al., 2018, Profilazione su singola cellula dei livelli di fosfo-proteina in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skå nland et al., 2014, Co-stimolazione delle cellule T attraverso il CD2 e il CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| NF-κ B p65 (pS529) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558422 | Clone: K10-895.12.50 Reference: Myhrvold et al., 2018, Profilazione cellulare singola dei livelli di fosfo-proteina in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skå nland et al., 2014, Co-stimolazione delle cellule T attraverso il CD2 e il CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulazione della segnalazione prossimale in normali e trasformati…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, L'interleuchina-33 guida un endotelico proinfiammatorio…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| NF-κ B p65 (pS536) | Cell Signaling Technologies | 4887 | Clone: 93H1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Profilazione cellulare singola dei livelli di fosfo-proteine in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skå nland et al., 2014, Co-stimolazione delle cellule T attraverso il CD2 e il CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulazione della segnalazione prossimale in normali e trasformati…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| p38 MAPK (pT180/Y182) | Cell Signaling Technologies | 4552 | Clone: 28B10 Riferimento: Myhrvold et al., 2018, Profilazione a cellula singola dei livelli di fosfo-proteine in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skå nland et al., 2014, Co-stimolazione delle cellule T attraverso il CD2 e il CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, L'interleuchina-33 guida un endotelico proinfiammatorio…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| p44/42 MAPK (pT202/Y204) | Cell Signaling Technologies | 4375 | Clone: E10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Profilazione su singola cellula dei livelli di fosfo-proteine in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Gli inibitori della tirosin-chinasi della milza riducono…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skå nland et al., 2014, Co-stimolazione delle cellule T attraverso il CD2 e il CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulazione della segnalazione prossimale in normali e trasformati…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, L'interleuchina-33 guida un endotelico proinfiammatorio…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| p53 (pS15) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: 16G8 Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplicazione e sovraespressione di Bcl-2…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS20) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplicazione e sovraespressione di Bcl-2…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS37) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Duplicazione di Flt3 Y591 e sovraespressione di Bcl-2…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS46) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplicazione e sovraespressione di Bcl-2…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS392) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplicazione e sovraespressione di Bcl-2…, Blood, 109(6):2589-96 |
| PLCγ 2 (pY759) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558498 | Clone: K86-689.37 Reference: Myhrvold et al., 2018, Profilazione a cellula singola dei livelli di fosfo-proteina in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Modelli distinti di segnalazione del recettore delle cellule B in…, Sangue, 129(6): 759-770 |
| Rb (pS807/pS811) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558590 | Clone: J112-906 Reference: Myhrvold et al., 2018, Profilazione a singola cellula dei livelli di fosfo-proteina in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, L'interleuchina-33 guida un endotelico proinfiammatorio…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| S6-Ribos. Prot. (pS235/236) | Cell Signaling Technologies | 4851 | Clone: D57.2.2E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of pho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| SAPK/JNK (pT183/Y185) | Cell Signaling Technologies | 9257 | Clone: G9 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of pho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| SLP76 (pY128) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558438 | clone: J141-668.36.58 Riferimento: Skå nland et al., 2014, Co-stimolazione delle cellule T attraverso il CD2 e il CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| STAT1 (pY701) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612597 | Clone: 4a Riferimento: Myhrvold et al., 2018, Profilazione a cellula singola dei livelli di fosfo-proteina in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Modelli distinti di segnalazione del recettore delle cellule B in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| STAT3 (pY705) | Beckton Dickinson Pharmingen | 557815 | Clone: 4/P-STAT3 Reference: Myhrvold et al., 2018, Profilazione cellulare singola dei livelli di fosfo-proteine in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| STAT4 (pY693) | Zymed/ThermoFisher Scientific | 71-7900 | Clone: Polyclonal Reference: Uzel et al., 2001, Rilevamento di STAT-4 fosforilato intracellulare mediante citometria a flusso, Clin Immunol, 100(3): 270-6 |
| STAT5 (pY694) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612599 | Clone: 47/Stat5(pY694) Reference: Myhrvold et al., 2018, Profilazione a cellula singola dei livelli di fosfo-proteine in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skå nland et al., 2014, Co-stimolazione delle cellule T attraverso il CD2 e il CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Myklebust et al., 2017, Modelli distinti di segnalazione del recettore delle cellule B in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| STAT6 (pY641) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612601 | Clone: 18/P-Stat6 Reference: Myhrvold et al., 2018, Profilazione cellulare singola dei livelli di fosfo-proteina in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| SYK (pY525/Y526) | Cell Signaling Technologies | 12081 | Clone: C87C1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Profilazione cellulare singola dei livelli di fosfo-proteina in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Gli inibitori della tirosin-chinasi della milza riducono…, Haematologica, 101(2):e59-62 |
| ZAP70/SYK (pY319/Y352) | Beckton Dickinson Pharmingen | 557817 | Clone: 17A/P-ZAP70 Riferimento: Skå nland et al., 2014, Co-stimolazione delle cellule T attraverso CD2 e CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulazione della segnalazione prossimale in normali e trasformati…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Modelli distinti di segnalazione del recettore delle cellule B in…, Sangue, 129(6): 759-770 |
Riferimenti
- Lu, Y., et al. Using reverse-phase protein arrays as pharmacodynamic assays for functional proteomics, biomarker discovery, and drug development in cancer. Seminars in Oncology. 43 (4), 476-483 (2016).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P.
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Ristampe e permessi
