Citometria a flusso di phospho con codici a barre fluorescenti cella per cella singola segnalazione analisi e scoperta del biomarcatore

Summary

Qui, un protocollo per analisi di medio-alto rendimento degli eventi di fosforilazione della proteina a livello cellulare è presentato. Phospho flusso cytometry è un approccio potente per caratterizzare la segnalazione aberrazioni, identificare e validare biomarcatori e valutare farmacodinamica.

Abstract

Segnalazione delle cellule aberranti svolge un ruolo centrale nello sviluppo del cancro e nella progressione. Più nuove terapie mirate sono infatti diretti alle proteine e le funzioni della proteina, e aberrazioni segnalazione cellulare possono quindi servire come biomarcatori per indicare le opzioni di trattamento personalizzato. Al contrario di analisi del DNA e RNA, cambiamenti nell'attività della proteina in modo più efficiente possono valutare i meccanismi di resistenza e sensibilità ai farmaci. Citometria a flusso di phospho è una tecnica potente che misura gli eventi di fosforilazione della proteina a livello cellulare, una caratteristica importante che distingue questo metodo da altri approcci basati su anticorpi. Il metodo consente l'analisi simultanea di più proteine di segnalazione. In combinazione con codici a barre delle cellule fluorescenti, grandi insiemi di dati medio-alto rendimento possono essere acquisite da citometro standard hardware in breve tempo. Phospho flusso cytometry ha applicazioni sia negli studi di biologia di base e ricerca clinica, tra cui analisi, scoperta del biomarcatore e valutazione della farmacodinamica di segnalazione. Qui, un dettagliato protocollo sperimentale è previsto per fosfo analisi del flusso delle cellule mononucleari del sangue periferico purificata, utilizzando cellule di leucemia linfatica cronica come esempio.

Introduction

Citometria a flusso di phospho viene utilizzato per analizzare i livelli di fosforilazione della proteina a cella singola risoluzione. L'obiettivo generale del metodo è di mappare i modelli di segnalazione cellulare in determinate condizioni. Sfruttando la capacità multiparametrica di citometria a flusso, parecchie vie di segnalazione possono essere analizzate simultaneamente in diversi sottogruppi di una popolazione cellulare eterogenea come sangue periferico. Queste caratteristiche offrono vantaggi rispetto ad altre tecnologie basate su anticorpi quali immunoistochimica, analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA), matrice di proteine e fase inversa proteina matrice (RPPA)¹. Citometria a flusso di phospho combinabile con codici a barre delle cellule fluorescenti (FCB), che significa che campioni di cellule individuali sono etichettati con firme uniche di coloranti fluorescenti in modo che possono essere mescolati tra loro, macchiati e analizzati come un singolo campione². Questo riduce il consumo di anticorpo, aumenta la robustezza dei dati attraverso la combinazione di controllo e campioni trattati e aumenta la velocità di acquisizione. La popolazione complessiva di FCB possa essere divisi in più piccoli campioni e macchiata con gli anticorpi fosfo-specifici distinti fino a 35, a seconda della quantità di materiale di partenza. Grandi esperimenti profilatura possono, quindi, essere eseguiti con citometro standard hardware. Phospho flusso cytometry è stato applicato al profilo vie nei campioni di segnalazione da parecchi cancri ematologici compresi leucemia linfocitaria cronica (CLL)^3,4,5, leucemia mieloide acuta (AML) ⁶ e non-Hodgkin linfomi⁷. Citometria a flusso di phospho è dunque un approccio potente per caratterizzare la segnalazione aberrazioni, identificare e validare biomarcatori e valutare farmacodinamica.

Qui, il protocollo ottimizzato per l'analisi di campioni di pazienti di CLL da citometria a flusso di phospho viene fornito (Figura 1A). Vengono illustrati esempi di caratterizzazione segnalazione basale, stimolazione del recettore delle cellule B/anti-IgM e perturbazione di droga. Viene fornita una descrizione dettagliata di una matrice FCB. Il protocollo può essere facilmente adattato ad altri tipi di cella di sospensione.

Protocol

Campioni di sangue sono stati ricevuti a seguito di consenso informato scritto da tutti i donatori. Lo studio è stato approvato dal Comitato regionale per il medico e salute ricerca etica della Norvegia sud-est e la ricerca su sangue umano è stata condotta in conformità con la dichiarazione di Helsinki⁸.

Nota: Passaggi 1-3 devono essere eseguiti in condizioni di sterilità in un cappuccio di coltura del tessuto.

1. isolamento di cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs) da campioni di sangue del paziente di CLL

Attenzione: Il sangue umano deve essere maneggiati secondo le normative per il livello 2 di biosicurezza.

1. Diluire il sangue 1:1 con tampone fosfato salino (PBS: 136,9 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10,1 mM Na₂HPO₄ x 2 H₂O, 1,8 mM KH₂PO₄, pH 7.4) e trasferimento in provette da 50 mL (30 mL/tubo).
2. Strato con attenzione 10 mL di un mezzo gradiente di densità (ad esempio, Lymphoprep) alla parte inferiore del tubo usando una pipetta da 10 mL.
3. Centrifuga a 800 x g per 20 min a 4 ° C. I PBMC sono ora visibili sopra lo strato medio gradiente di densità.
4. Utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire le cellule in due nuove provette da 50 mL. Lavare due volte con PBS (riempire i tubi).
5. Centrifugare a 350 x g per 15 min. scartare il supernatante e risospendere in 3 mL di PBS.
6. Contare le celle utilizzando un metodo preferito.
7. Centrifugare le cellule a 350 x g per 5 min, scartare il surnatante. Nota: 1.8 a 3.2 passaggi sono facoltativi. È possibile passare direttamente al punto 3.3.
8. Risospendere le cellule in siero bovino fetale (FBS) completati con 10% di dimetilsolfossido (DMSO) e congelare giù in aliquote adatte utilizzando tubi di cryo.
   Nota: DMSO è tossico per le cellule. Lavoro veloce una volta che le cellule sono mescolate con FBS/DMSO. Le cellule possono essere memorizzati a lungo termine in azoto liquido.

2. lo scongelamento delle cellule

1. Scongelare rapidamente le cellule in bagnomaria a 37 ° C.
   Nota: DMSO è tossico per le cellule. Lavorare velocemente per limitare l'esposizione a DMSO.
2. Lavare le cellule una volta con 10 mL di fluido freddo di Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640 con GlutaMAX supplementari, Vedi Tabella materiali).
3. Centrifugare a 300 x g per 5 min, scartare il surnatante.
4. Risospendere le cellule in RPMI 1640 supplementato con sodio piruvato, MEM non essenziali aminoacidi e penicillina/streptomicina (aggiunti alla diluizione di 1 x secondo le istruzioni) e 10% FBS. Trasferire le cellule in un pallone di cultura di piccole cellule e lasciare in un incubatore a 5% CO₂, 37 ° C per 1 ora per permettere alle cellule di calibrare.

3. preparazione delle celle

1. Contare le cellule vitali utilizzando un metodo preferito.
2. Trasferire le cellule in una provetta 50 mL e centrifugare a 300 x g per 5 min, scartare il surnatante.
3. Risospendere le cellule in medium RPMI 1640 (punto 2.2) completate con 1% FBS a non più di 50 x 10⁶ cellule/mL.
4. Trasferire la quantità necessaria di sospensione cellulare per pozzetti in una piastra di fondo V ben 96.
   Nota: Numero di pozzi corrisponde al numero di condizioni da testare. Campioni per un corso di tempo di stimolazione sono disegnati da un singolo pozzo. Calcolare 50 µ l di campione al punto di tempo + 50 µ l di volume morto. Salvare i campioni per i controlli di compensazione (un campione senza macchia + un campione per tintura di codici a barre).
5. Trasferire la piastra ben 96 per un bagno di acqua pre-riscaldata 37 ° C. Riposare le cellule per 10 min.

4. la stimolazione e la fissazione delle cellule

Nota: Eseguire i passaggi da 4-8 sul banco di laboratorio (cioè, non sterile).

Attenzione: L'ingrediente principale della difficoltà Buffer I è paraformaldeide, che è tossico (inalazione e contatto). Maneggiare con cura.

1. Preparare una piastra di fondo V ben 96 con 60 µ l di tampone di difficoltà che ogni pozzetto per campione. Lasciare a bagno d'acqua di 37 ° C.
   Nota: Cellule: Fix buffer deve essere 1:1. Al fine di consentire l'evaporazione a 37 ° C, il buffer di Fix è inizialmente in abbondanza.
2. Facoltativamente, trattare le cellule con farmaci prima di stimolazione.
3. Trasferire un campione di controllo 50 µ l per il piatto di correzione. Mescolare pipettando su e giù.
4. Facoltativamente, è possibile iniziare il corso di tempo di stimolazione aggiungendo 10 µ g/mL anti-IgM alle cellule. Mescolare pipettando su e giù.
5. Trasferire un 50 µ l di campione alla piastra di correzione in ogni momento. Mescolare pipettando su e giù.
   Nota: Anti-IgM indotto segnalazione è iniziato solitamente presto (minuti).
6. Lasciare la piastra di correzione a 37 ° C per 10 min dopo l'aggiunta dell'ultimo campione.

5. fluorescente cella Barcoding (FCB)

Nota: Per un elenco di codici a barre reagenti, vedere tabella 1 .

1. Lavare le cellule fisse 3 x con PBS (riempire i pozzetti).
2. Centrifugare a 500 g per 5 min. eliminare il supernatante.
3. Preparare una piastra di fondo V ben 96 con codici a barre reagenti. Pipettare 5 µ l di ciascun reagente di codici a barre per pozzetto nel numero di combinazioni necessarie per macchiare tutti i campioni seguendo la matrice di colorazione, per esempio, in Figura 1B. Ogni campione avrà una combinazione unica di codici a barre differenti concentrazioni.
4. Risospendere le cellule in 190 µ l di PBS e trasferimento alla piastra di codici a barre. Mescolare accuratamente.
   Nota: Macchia un esempio di compensazione con la più alta concentrazione finale utilizzata per ciascun reagente di codici a barre e salvare un campione senza macchia.
5. Lasciare le cellule per 20 min a temperatura ambiente al buio.
6. Lavare le cellule marcate 2 x con flusso lavare (PBS, 1% FBS, 0,09% di sodio azide) (riempire i pozzetti).
7. Centrifugare a 500 g per 5 min. eliminare il supernatante.
8. Aggiungere 190 µ l di flusso lavare alle cellule e si combinano negli esempi di codice a barre in una provetta da 15 mL. Ogni controllo di compensazione di trasferimento ad un tubo separato 1,7 mL.
9. Centrifugare a 500 g per 5 min. eliminare il supernatante.

6. cella permeabilizzazione per antigene intracellulare di colorazione

Attenzione: L'ingrediente principale di Perm Buffer III è metanolo che è tossico (inalazione e contatto) e infiammabili. Maneggiare con cura.

1. Trasferire 2 mL di soluzione di Perm III in una provetta da 15 mL. Lasciare a-20 ° C quindi è ghiacciata al momento dell'impiego.
   Nota: Il Buffer di Perm può essere lasciato a-20 ° C dall'inizio dell'esperimento.
2. Aggiungere 1,5 mL di Buffer di Perm ghiacciata per la popolazione delle cellule con codice a barre (in una provetta da 15 mL) e 100 µ l di ogni controllo di compensazione (in tubi di 1,7 mL) drop-wise mentre nel Vortex per evitare che le cellule si aggregano assieme.
3. Trasferire le cellule direttamente a-80 ° C. Lasciare agire per un minimo di 30 min.
   Nota: È naturale per mettere in pausa l'esperimento a questo punto. Le cellule in Perm Buffer possono essere memorizzati a lungo termine a-80 ° C.

7. anticorpi

Nota: Per un elenco dei segnalati anticorpi fosfo-specifici, vedere Tabella materiali .

1. Trasferire le cellule da-80 ° C per una scatola di ghiaccio.
2. Lavare 3 volte con flusso lavare.
   Nota: È importante aggiungere flusso lavare in eccesso per vedere il pellet cellulare, ad esempio, aggiungere 3 mL di flusso lavare per la popolazione delle cellule con codice a barre e 1 mL per ogni controllo di compensazione.
3. Centrifugare a 500 g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
4. Risospendere la popolazione delle cellule con codice a barre in un volume di flusso lavare, che permette di 25 µ l di sospensione cellulare a macchia di fosfo-anticorpo. Risospendere i controlli di compensazione in 200 µ l di flusso lavare.
5. Preparare gli anticorpi per la colorazione in una piastra di fondo V ben 96. Il volume finale sarà 50 µ l/pozzetto. Ogni pozzetto, aggiungere fosfo-specifici dell'anticorpo diluito nel flusso lavare ad un volume finale di 10 µ l, marcatore di superficie diluito nel flusso lavare ad un volume finale di 15 µ l e 25 µ l di sospensione cellulare.
   Nota: Diluizioni di anticorpo devono essere titolata in base prima dell'esperimento. Includono il controllo di isotipo.
6. Lasciare le cellule per 30 min a temperatura ambiente al buio.
7. Lavare le cellule marcate 2 x con flusso lavare (riempire i pozzetti).
8. Centrifugare a 500 g per 5 min. eliminare il supernatante.
9. Risospendere le cellule in 150 µ l di flusso lavare.

8. preparazione dei controlli di compensazione

1. Preparare i controlli di compensazione per l'anticorpo coniugato fluorocromi in parallelo con la macchiatura dell'anticorpo. Utilizzare perle di compensazione secondo le istruzioni del fornitore.

9. analisi di citometria a flusso di

Nota: L'esperimento può essere eseguito su un citometro a flusso con un alto Throughput Sampler (HTS).

1. Ottimizzare la tensione di tubo (PMT) fotomoltiplicatore con il controllo senza macchia.
2. Eseguire i controlli di compensazione e calcolare la matrice di compensazione.
3. Eseguire i campioni. Il tasso di eventi deve essere in conformità con le specifiche dello strumento.

10. gating strategia e analisi dei dati

1. Importare i file FCS dall'esperimento di un software di analisi di citometria a flusso come FlowJo o Cytobank (https://cellmass.cytobank.org).
2. Strategia di gating
   1. Selezionare linfociti tracciando SSC-A contro FSC-A in una trama di puntino di densità.
   2. I linfociti di visualizzare e selezionare le canottiere tracciando SSC-A contro FSC - W.
   3. Visualizzare le singole cellule e cancello la cella digitare tracciando SSC-A contro la superficie dell'indicatore.
   4. Visualizzare la popolazione di tipo delle cellule in una trama di SSC-A densità contro Pacific Blue e selezionare le diverse popolazioni di FCB basate su loro Pacific Blue intensità di colorazione (Vedi Figura 1A).
   5. Tracciare il canale di anticorpi fosfo contro il canale FCB, o come un heatmap (Vedi Figura 1A) per visualizzare gli eventi di fosforilazione.
3. Calcolare fosfo-segnali utilizzando il seno iperbolico inverso (arcsinh) di MFI (intensità fluorescente mediana) di fosfo-segnale contro controllo isotype (livelli di fosforilazione basale, Vedi Figura 1), o di stimolata contro popolazioni di cellule non stimolate (Vedi Figura 1E).

Results

Le fasi principali del protocollo fosfo flusso cytometry sono illustrate nella Figura 1A. Nell'esempio presentato, cellule di CLL sono state macchiate con il reagente di codici a barre Pacific Blue a quattro diluizioni. Codici a barre tridimensionale può essere eseguita combinando tre coloranti di codici a barre, come illustrato in Figura 1B. I singoli campioni sono poi riconducibili di gating successive su ogni barcoding reagent...

Discussion

Citometria a flusso di phospho è una tecnica potente per misurare i livelli di fosforilazione della proteina in cellule singole. Poiché il metodo si basa su macchiando con gli anticorpi, citometria a flusso di phospho è limitata dalla disponibilità di anticorpo. Inoltre, al fine di ottenere risultati affidabili, tutti gli anticorpi dovrebbero essere titolati e verificati prima dell'uso. Un protocollo dettagliato per la titolazione di anticorpi fosfo-specifici è stato descritto altrove¹². Durante l...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	61870-010	Terreno di coltura cellulare
Siero fetale bovino	ThermoFisher Scientific	10270169	Additivo al terreno di coltura cellulare
Piruvato di sodio	ThermoFisher Scientific	11360-039	Additivo al terreno di coltura cellulare
MEM aminoacidi non essenziali	ThermoFisher Scientific	11140-035	Additivo al terreno di coltura cellulare
Lymphoprep	Alere Technologies AS	1114547	Mezzo di gradiente di densità
Anti-IgM	Southern Biotech	2022-01	Per la stimolazione del recettore delle cellule B
BD Phosflow Fix Buffer I	BD BD	557870	Tampone di fissazione
BD Phosflow Perm Buffer III	BD	558050	Tampone di permeabilizzazione
Alexa Fluor 488 5-TFP	ThermoFisher Scientific	A30005	Reagente per codici a barre
Blue Succinimidyl Ester	ThermoFisher Scientific	P10163	Reagente per codici a barre
Pacific Orange Succinimidyl Ester, sale di trietilammonio	ThermoFisher Scientific	P30253	Reagente per codici a barre
Perline di compensazione	Definito dall'utente		Specie corretta reattività
Provette Falcon<	em>Definito dall'utente
Provette Eppendorf	Definito dall'utente
96 piastre con fondo a V	Definito dall'utente		Compatibile con il citometro a flusso
Centrifughe	Definito dall'utente		Per provette Eppendorf, provette Falcon e piastre
Bagnomaria	Definito dall'utente		flusso a temperatura regolata
	Definito dall'utente		Con campionatore ad alta produttività (HTS)
Name	Azienda	Numero di catalogo	Comments
< strong>Antigene
AKT (pS473)	Cell Signaling Technologies	4075	Clone: D9E Reference: Myhrvold et al., 2018, Profilazione cellulare singola dei livelli di fosfo-proteina in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Gli inibitori della tirosin-chinasi della milza riducono…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skå nland et al., 2014, Co-stimolazione delle cellule T attraverso il CD2 e il CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulazione della segnalazione prossimale in normali e trasformati…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
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BLNK (pY84)	Beckton Dickinson Pharmingen	558443	Clone: J117-1278 Riferimento: Myhrvold et al., 2018, Profilazione cellulare singola dei livelli di fosfo-proteina in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Kalland et al., 2012, Modulazione della segnalazione prossimale in normali e trasformati…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Modelli distinti di segnalazione del recettore delle cellule B in…, Sangue, 129(6): 759-770
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Histone H3 (pS10)	Cell Signaling Technologies	9716	Clone: D2C8 Reference: Myhrvold et al., 2018, Profilazione cellulare singola dei livelli di fosfo-proteina in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
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LAT (pY171)	Beckton Dickinson Pharmingen	558518	Clone: I58-1169 Reference: Sciå nland et al., 2014, Co-stimolazione delle cellule T attraverso il CD2 e il CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Lck (pY505)	Beckton Dickinson Pharmingen	558577	Clone: 4/LCK-Y505  Riferimento: Myhrvold et al., 2018, Profilazione su singola cellula dei livelli di fosfo-proteina in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
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NF-κ B p65 (pS536)	Cell Signaling Technologies	4887	Clone: 93H1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Profilazione cellulare singola dei livelli di fosfo-proteine in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skå nland et al., 2014, Co-stimolazione delle cellule T attraverso il CD2 e il CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulazione della segnalazione prossimale in normali e trasformati…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
p38 MAPK (pT180/Y182)	Cell Signaling Technologies	4552	Clone: 28B10 Riferimento: Myhrvold et al., 2018, Profilazione a cellula singola dei livelli di fosfo-proteine in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skå nland et al., 2014, Co-stimolazione delle cellule T attraverso il CD2 e il CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, L'interleuchina-33 guida un endotelico proinfiammatorio…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
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p53 (pS37)	Cell Signaling Technologies	NN	Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Duplicazione di Flt3 Y591 e sovraespressione di Bcl-2…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS46)	Cell Signaling Technologies	NN	Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplicazione e sovraespressione di Bcl-2…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS392)	Cell Signaling Technologies	NN	Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplicazione e sovraespressione di Bcl-2…, Blood, 109(6):2589-96
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