Articolo metodologico

Risonanza di superficie-enhanced Raman Scattering Nanosonda Ratiometry per la rilevazione di cancro ovarico microscopico tramite ricevitore di folato di Targeting

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DOI:

10.3791/58389

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25 marzo 2019

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1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Department of Chemistry, The Graduate Center of the City University of New York, 3Molecular Pharmacology Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (CMINT), Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 5Gerstner Sloan Kettering Graduate School of Biomedical Sciences, 6Department of Radiology, Weill Cornell Medical College of Cornell University, 7Dana-Farber Cancer Institute and Harvard Medical Center

In questo articolo

Sommario

Cancro ovarico forma metastasi durante la cavità peritoneale. Qui, presentiamo un protocollo per rendere e uso folato-recettore mirati a risonanza superficie-enhanced Raman scattering nanosonde che rivelano queste lesioni con formazione immagine di alta specificità via raziometrici. Le nanosonde sono amministrati intraperitonealmente ai topi vivi, e le immagini derivate correlano bene con l'istologia.

Abstract

Cancro ovarico rappresenta la malignità ginecologica più letale. Maggior parte dei pazienti presentano in stadio avanzato (stadio FIGO III o IV), quando già verificata una diffusione metastatica di locale. Tuttavia, il cancro ovarico ha un unico modello di diffusione metastatica, in quanto gli impianti del tumore inizialmente sono contenuti all'interno della cavità peritoneale. Questa caratteristica potrebbe consentire, in linea di principio, la resezione completa del tumore impianti con intento curativo. Molte di queste lesioni metastatiche sono microscopici, che li rende difficili da identificare e trattare. Neutralizzare tali micrometastasi è creduto per essere un obiettivo importante verso l'eliminazione di ricorrenza del tumore e sopravvivenza a lungo termine di raggiungimento. Raman imaging con superficie maggiore risonanza Raman scattering nanosonde può essere utilizzato per delineare microscopici tumori con l'alta sensibilità, grazie alla loro brillante e bioorthogonal firme spettrali. Qui, descriviamo la sintesi di due 'sapori' di tali nanosonde: un anticorpo-funzionalizzati di uno che il recettore per acido folico è destinato — sovraespresso in molti cancri ovarici — e una Nanosonda controllo non mirati, con distinti spettri. Le nanosonde sono co-somministrati per via intraperitoneale di modelli murini di adenocarcinoma ovarico umano metastatico. Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Comitato del Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Cavità peritoneale degli animali è chirurgicamente esposti, lavata e scansionata con un microphotospectrometer di Raman. Successivamente, le firme di Raman delle due nanosonde sono disaccoppiate utilizzando un algoritmo di montaggio classico minimi quadrati, e i loro rispettivi punteggi suddivisi per fornire un segnale raziometrico di folato-mirati tramite sonde non mirati. In questo modo, metastasi microscopiche sono visualizzate con elevata specificità. Il principale vantaggio di questo approccio è che l'applicazione locale nella cavità peritoneale — che può essere fatto comodamente durante la procedura chirurgica — puoi taggare i tumori senza sottoporre il paziente all'esposizione sistemica di nanoparticelle. Falsi positivi segnali derivanti dal legame non specifico di nanosonde su superfici viscerali possono essere eliminati seguendo un approccio raziometrici dove nanosonde mirate e non mirati con distinte firme Raman sono applicati come una miscela. La procedura è attualmente ancora limitata dalla mancanza di un commerciale grandangolari Raman imaging sistema di telecamere, che una volta disponibile consentirà l'applicazione di questa tecnica in sala operatoria.

Introduzione

Imaging con 'surface enhanced Raman scattering' Raman (SERS) nanoparticelle ha mostrato grande promessa nel delineare le lesioni in una varietà di impostazioni e per molti differenti del tumore tipi1,2,3,4 . Il vantaggio principale di nanoparticelle SERS è la loro firma spettrale di impronte digitali-come, offrendo loro indiscutibile rilevazione che non è confuso dal fondo biologico segnali5. Inoltre, l'intensità del segnale emesso viene ulteriormente amplificato con l'uso di molecole reporter (coloranti) con massimi di assorbanza in linea con il laser di eccitazione, dando luogo a 'superficie maggiore risonanza Raman scattering' (SERRS) nanoparticelle con ancora maggiore sensibilità6,7,8,9,10,11,12.

Una barriera che deve essere affrontato per l'adozione del SE(R)RS nanoparticelle13 e molti altri nanoparticella costrutti14,15 per uso clinico è la loro modalità di somministrazione, come iniezione endovenosa cause sistemiche esposizione dell'agente e necessita di test approfonditi per escludere potenziali effetti avversi. In questo articolo, vi presentiamo un altro paradigma basato sull'applicazione di nanoparticelle localmente in vivo, direttamente nella cavità peritoneale durante la chirurgia, seguita da una fase di lavaggio per rimuovere eventuali nanoparticelle non associati1. Questo approccio è in linea con i nuovi approcci terapeutici che sono attualmente sotto inchiesta che fanno anche uso di instillazione locale di agenti nella cavità peritoneale, chiamata chemioterapia ipertermica intraperitoneale (HIPEC). Così, lo stesso principio dovrebbe essere relativamente facile da integrare in un flusso di lavoro clinico. Abbiamo studiato la biodistribuzione delle nanoparticelle dopo applicazione intraperitoneale e non hanno osservato alcun assorbimento rilevabile nella circolazione sistemica1. Inoltre, l'approccio di applicazione locale aggira il sequestro delle nanoparticelle dal sistema reticoloendoteliale, così i numeri delle nanoparticelle richieste sono marcatamente ridotti. Tuttavia, quando applicato localmente, nanoparticelle funzionalizzate anticorpo tendono ad aderire sulle superfici viscerali anche in assenza del loro obiettivo. Al fine di ridurre al minimo i falsi segnali positivi a causa di adesione delle nanoparticelle non specifici, perseguiamo un approccio raziometrici, dove una Nanosonda molecolare mirata fornisce il segnale specifico e una Nanosonda controllo non mirati, con differente spettro Raman, conti per fondo16,17. Abbiamo dimostrato questa metodologia di risonanza maggiore superficie topica spettroscopia raziometrici Raman recentemente in un modello murino di cancro ovarico diffuso1.

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di sviluppare due SERRS nanosonde, uno destinato ed uno non-specifici, da applicare localmente in modelli murini, per la prevalenza e la sovraespressione di un cancro di immagine relativo biomarcatore utilizzando raziometrici rilevamento delle due sonde via Raman imaging. In questo lavoro, il recettore per acido folico (FR) è stato scelto come destinazione, si tratta di un marcatore upregulated in molti cancri ovarici18,19. Raman microimaging con nanoparticelle basato su SERS è stata dimostrata anche per cancro cella identificazione20. Due distinti "sapori" di nanoparticelle di Raman sono sintetizzati, ciascuna derivazione l'impronta digitale da un colorante organico differente. Le nanoparticelle sono costituiti da un nucleo d'oro a forma di stella, circondato da un guscio di silice e dimostrare la risonanza plasmonica di superficie a circa 710 nm. Il reporter di Raman (colorante organico) è depositato in concomitanza con la formazione del guscio di silice. Infine, per le nanosonde FR-mirati (αFR-NPs) il guscio di silice è coniugato con gli anticorpi, mentre le nanosonde non mirati (nt-NPs) sono passivati con un monostrato di polietilenglicole (PEG).

Questa tecnica è stata usata con successo per mappare i tumori al microscopio in un modello di xenotrapianto di topo di cancro ovarico metastatico diffuso (SKOV-3), dimostrando la sua applicabilità per uso in vivo. Può anche essere esteso per uso nei tessuti asportati, fenotipizzazione del tumore, o determinazione di margine dopo debulking come mostrato in un cognate Studio21.

SERRS nanosonde forniscono una robusta piattaforma per la creazione di Tag più mirati per biomarcatori, sintetizzati con semplici reazioni chimiche come indicato schematicamente in Figura 1. Qui, presentiamo il protocollo per la sintesi dei due tipi di nanosonde SERRS (sezioni 1-3), lo sviluppo di un modello murino di cancro ovarico adatto (sezione 4), l'amministrazione di nanosonde e imaging (sezione 5) e infine l'analisi dei dati e visualizzazione (sezione 6).

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Protocollo

Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Comitato del Memorial Sloan Kettering Cancer Center (n. 07/06/11).

1. oro Nanostar nucleo sintesi

Nota: Nanostars oro sono utilizzati come nuclei per entrambi i sapori di nanosonde SERRS utilizzati in questo esperimento.

  1. Preparare 800 mL di soluzione di (C6H8O6) di acido ascorbico di 60 mM in acqua deionizzata (DI) e 8 mL di 20 mM tetrachloroauric (HAuCl4) soluzione acida in acqua deionizzata. Raffreddare a 4 ° C.
  2. Eseguire questo passaggio di reazione a 4 ° C. Posizionare una beuta contenente 800 mL di soluzione di acido ascorbico su una piastra magnetica e indurre un vortice costante. Aggiungere rapidamente 8 mL della soluzione di acido tetrachloroauric nel vortice. In pochi secondi, nanostars formerà e la soluzione assumerà un colore blu scuro. Nel caso in cui il colore in qualsiasi momento diventa rosa o viola, che significa la formazione di nanosfere, la sospensione deve essere eliminata e la sintesi eseguito un nuovo tentativo.
  3. Versare la sospensione nanostar in provette coniche da 50 mL e centrifugare per 20 min (4 ° C, 3.220 x g). Aspirare il surnatante lasciando approssimativo 200 µ l della soluzione in ogni provetta. Prestare attenzione per non disturbare il pellet di nanoparticelle nella parte inferiore del tubo.
    Nota: Il surnatante dovrebbe avere una tinta blu a causa del restante nanostars sospesi.
  4. Usando una micropipetta, agitare la soluzione per sospendere e raccogliere le nanoparticelle da ciascuna provetta. Parte del pellet può essere compattato sul fondo del tubo e non sarà risospendere anche con vigorosa pipettaggio-scartare questa parte.
  5. Trasferire la sospensione di nanoparticelle su una videocassetta di dialisi (MWCO 3.5 kDa) e Dializzare almeno tre giorni contro 2 L di acqua deionizzata, cambiando l'acqua ogni giorno. Conservare nanostars in dialisi a 4 ° C per fino a un mese con cambi d'acqua ogni 3-4 giorni.
    Nota: Il nanostars dovrebbe essere tenuto in dialisi fino a quando richiesto per la reazione di silication, come descritto nella sezione 2.

2. formazione del guscio di silice

Nota: Due sapori di nanosonde Raman sono sintetizzati. La procedura di sintesi è la stessa per entrambi, con l'unica differenza è la molecola di reporter del Raman (tintura) utilizzata. In questo esperimento, perclorato di IR780 e IR140 sono usati. La reazione deve essere eseguita sempre in contenitori di plastica. La sintesi è altamente scalabile e può essere registrata per la quantità desiderata di injectate richiesto. Qui, una sintesi di lotti medi è descritto, che possono essere scalati in modo lineare a volumi inferiori o superiori secondo le necessità, con le stesse concentrazioni e tempi di reazione. Le reazioni per i due tipi di Nanosonda SERRS possono essere eseguite in parallelo. Prestare attenzione per evitare la contaminazione incrociata. Sonicazione deve essere eseguite per il redispersion di nanoparticella pellet dopo centrifugazione durante fasi di lavaggio, o dopo che le nanoparticelle sono state conservate per più di un'ora. Sonicazione deve essere eseguita fino a quando le nanoparticelle sono chiaramente sospesa nella soluzione, in genere per 1 s.

  1. Nel tubo A (un tubo conico di 50 mL), mescolare 10 mL di isopropanolo, 500 µ l di TEOS, 200 µ l di acqua deionizzata e 60 µ l di colorante (perclorato di IR780 o IR140, 20mm in DMF (dimetilformammide)).
  2. In tubo B (provetta conica da 15 mL), mescolare 3 mL di etanolo e 200 µ l di idrossido di ammonio. Sonicare nanostars da passo 1.4 per disperdere eventuali cluster in soluzione e aggiungere 1,2 mL di nanostars al tubo.
    Nota: la soluzione di idrossido di ammonio è altamente volatile e difficile da dispensare con precisione. Conservarlo a 4 ° C, finché necessario, per agevolare il pipettaggio.
  3. Posizionare il tubo A su un Vortex e indurre un vortice costante. Rapidamente aggiungere il contenuto del tubo B nel vortice e continuando a mescolare per circa 5 s. trasferire immediatamente un agitatore e lasciare reagire per 15 min mentre si stringono a 300 giri/min, a temperatura ambiente.
  4. Dopo l'incubazione di 15 min, placare la reazione con l'aggiunta di etanolo per riempire il tubo da 50 mL. Centrifugare per 20 min a 3.220 x g e a 4 ° C.
  5. Aspirare il supernatante, lasciando circa 0,5 mL di soluzione, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Aggiungere 1 mL di etanolo e agitare con una pipetta per risospendere le nanoparticelle. Trasferire in una provetta da centrifuga da 1,5 mL e lavare 4 volte con etanolo da centrifugazione a 11.000 x g per 4 min, aspirare il supernatante e risospendere il pellet di sonicazione per circa 1 s.
    Nota: In questa fase, le nanoparticelle silicate possono essere funzionalizzate, come descritto nella sezione 3, o risospesi in DI acqua con un passaggio di lavaggio supplementare, per la conservazione a 4 ° C per fino ad una settimana.

3. superficie funzionalizzazione

Nota: IR780 SERRS nanosonde saranno coniugati con gli anticorpi recettore-targeting folato tramite un reticolante di PEG a forma αFR-NPs; IR140 SERRS controllo nanosonde saranno coniugati con un monostrato di PEG passivante, per nt-NPs. Entrambi sapori si formano attraverso una reazione di tiolo-maleimide in reazioni separate ma parallele.

  1. Lavare le nanoparticelle due volte da centrifugazione a 11.000 x g per 4 min, aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 1 mL di etanolo di sonicazione. Ripetere la fase di lavaggio una volta di più, ma redisperse in 1 mL di etanolo di 85%, 10% 3-MPTMS (3-mercaptopropyltrimethoxysilane) e 5% DI acqua. Incubare a temperatura ambiente per 1-2 h per introdurre i tioli sulla superficie della particella.
  2. Lavare le nanoparticelle funzionalizzate tiolo di centrifugazione a 11.000 x g per 4 min, aspirare il supernatante e risospendere il pellet di sonicazione, due volte in etanolo, due volte in DI e infine in HEPES (4-(2-idrossietil) -1- tampone acido piperazineethanesulfonic) (10 mM, pH 7.1) e mettere da parte.
    Nota: MES (2-(N- morfolino) ethanesulfonic acido) buffer o HEPES deve essere utilizzato. Buffer con maggiore salinità, come PBS (phosphate-buffered saline), può indurre l'aggregazione delle nanoparticelle.
  3. Per l'anticorpo funzionalizzato αFR-NPs, reagire 200 µ g di anticorpi (clone dell'anticorpo di anti-folato associazione proteina [LK26]) con dieci volte eccesso molare di reticolante PEG (poly(ethylene glycol) (N-Idrossisuccinimide 5-pentanoato) etere N′-(3- maleimidopropionyl) aminoethane (CAS: 851040-94-3), in dimetilsolfossido (DMSO)) in 500 µ l di tampone MES (10 mM, pH 7.1) per 30 min.
  4. Rimuovere l'eccesso reticolante e concentrato anticorpo mediante centrifugazione la soluzione di anticorpo-PEG in un filtro centrifugo (MWCO 100 kDa). Per i filtri centrifughi utilizzati in questo studio, eseguire centrifugazione per 10 min a 14.000 x g e 23 ° C. Recuperare gli anticorpi coniugati in una nuova provetta invertendo il filtro e centrifugazione a 1.000 x g per 2 min.
  5. Pipettare le nanoparticelle di IR780 da passo 3.2 nel tubo con gli anticorpi e agitare con la pipetta per mescolare. Incubare la miscela per almeno 30 min a temperatura ambiente, o, in alternativa a 4 ° C durante la notte per formare i αFR-PN.
  6. Per formare nt-NPs, aggiungere 1% w/v methoxy-terminated (m) PEG5000-maleimide (CAS: 99126-64-4) dissolto in DMSO per le nanoparticelle IR140 SERRS da passo 3.2 e lasciare reagire in 500 µ l di tampone MES (10 mM, pH 7.1) per almeno 30 min a temperatura ambiente, o, in alternativa a 4 ° C Per la notte.
  7. Per la somministrazione ai topi (sezione 5), spin-down sia sapori Nanosonda a 11.000 x g per 4 min, aspirare il surnatante per rimuovere la soluzione con libera non reagita anticorpi/PEG e redisperse ogni sapore nel buffer di MES (10 mM, pH 7.1) a 600 concentrazione di pM . Quando risospendere le nanoparticelle, ridurre al minimo l'esposizione non necessaria per l'ecografia, per prevenire la denaturazione dell'anticorpo.

4. Mouse modello sviluppo

  1. Stabilire una cultura costante della linea cellulare umana dell'adenocarcinoma ovarico (SKOV-3). Facoltativamente, per attivare il monitoraggio tramite bioluminescenza/fluorescenza, è possibile utilizzare celle transfected SKOV-3 Luc+/GFP+ . Cellule di cultura in medium RPMI (Roswell Park Memorial Institute) con 10% siero fetale di vitello e passaggio due volte a settimana. Per iniezione, incubare le cellule con 0.25% trypsin/0.05% EDTA per 3 min a staccare e successivamente lavare e risospendere in PBS a 2 x 106 cellule/100 µ l.
  2. Per stabilire il modello di micrometastasi ovarico, iniettare 200 µ l di sospensione cellule SKOV-3 intraperitonealmente in topi athymic femminili (FOXn1nu/FOXn1nu topi, 6-8 settimane di età). Diffusione peritoneale diffusa si verifica in circa 4 settimane. Se usando le cellule SKOV-3 Luc+ , la crescita del tumore può essere monitorata con bioluminescenza attraverso la somministrazione di 2 mg di luciferina beetle in 50 µ l PBS tramite iniezione retroorbital.

5. Nanosonda iniezione e Imaging

  1. Preparare nanosonde (αFR-NPs e nt-NPs) come descritto nelle sezioni 1-3 e mescolare con un rapporto di 1:1, per una concentrazione finale di 300 pM di ogni tipo nel buffer di MES (10 mM, pH 7.1). Facoltativamente, preparare gli standard di riferimento di 30 pM di ciascuno dei sapori Nanosonda in piccole provette coniche (100 µ l).
  2. Iniettare per via intraperitoneale 1 mL della sospensione di nanoparticelle in ogni mouse e massaggiare delicatamente il ventre per distribuire le nanoparticelle all'interno della cavità peritoneale. Restituire il mouse nella sua sede. Dopo 25 o più minuti, eutanasia il mouse via CO2 asfissia.
  3. Fissare il mouse su una piattaforma chirurgica, in posizione supina (per tutto l'addome di imaging, la piattaforma deve essere montabile sul palco microscopio dritto).
    1. Utilizzando seghettate pinze e le forbici di dissezione, togliere la pelle per esporre il peritoneo ed eseguire una grande incisione sagittale (tra 2 e 3 cm di lunghezza) per esporre l'intero addome. Allegare i lembi peritoneali sulla piattaforma. Lavare l'interno della cavità peritoneale con almeno 60 mL di PBS utilizzando una spruzzetta in plastica.
      Nota: Per abilitare sgomberata imaging dell'intero addome, intestini devono essere mobilitate o asportato. Per l'asportazione, resecare con una legatura dei vasi mesenterici al fine di ridurre l'emorragia nella cavità addominale.
    2. In alternativa, per specifici organi di immagine, asportare li dopo il lavaggio con PBS e metterli su un vetrino da microscopio.
  4. Trasferire la piattaforma o la diapositiva di un microspectrophotometer di Raman con configurazione ottica verticale e un tavolino motorizzato per l'imaging; utilizzare un sistema commerciale con un 300 mW 785 nm diodo laser, con una grata di 1.200 scanalature ogni mm, centrato a 1.115 cm-1.
    1. Concentrarsi sulla zona di interesse utilizzando ottiche luce bianca, parafocale con il laser Raman. Selezionare l'area per l'imaging e la risoluzione desiderata; in questo rapporto è stata utilizzata una modalità di acquisizione ad alta velocità (spettri acquisiti nell'ambito dell'illuminazione laser continuo con il tavolino del microscopio costantemente in movimento, con risoluzione spaziale efficace 14,2 µm di 200 µm; all'ingrandimento 5x, 100 mW di potenza all'obiettivo, e < 100 ms esposizione per punto).
      Nota: I tubi con le nanosonde di riferimento dal passaggio 5.1 è collocabile all'interno dell'area immagine se lo si desidera, per fornire standard di riferimento interno per l'analisi successiva. Assicurarsi che nessun estranei sorgenti luminose tranne il laser raggiungono l'obiettivo.
  5. Facoltativamente, preparare il campione per l'elaborazione istologica e la convalida tramite la fissazione in paraformaldeide al 4% in PBS durante la notte a 4 ° C. Sciacquare almeno due volte con PBS a 4 ° C per 15 min. Conservare il campione in etanolo al 70% in acqua fino elaborazione istologica standard e inclusione in paraffina. Per la convalida istologica dei tumori, sezioni (5 µm di spessore) da diverse profondità del blocco paraffina possono essere macchiati con ematossilina ed eosina (H & E).

6. elaborazione dei dati e visualizzazione

Nota: Ogni trattamento dei dati è stato effettuato con un'interfaccia di utente grafica sviluppata internamente, utilizzando il software commerciale. Tutte le funzioni utilizzate sono equivalenti generici disponibili in altri ambienti informatici.

  1. Ottenere gli spettri di riferimento per i due sapori, interrogando puri sospensioni di ciascuno. Gli spettri di riferimento possono essere derivati da punto scansioni di nanosonde, imaging di nanosonde in piastre a pozzetti, o includendo riferimenti interni nelle scansioni sperimentale nei tubi di riferimento (cfr. punto 5.1).
  2. Elabora gli spettri di riferimento, utilizzando la sottrazione della linea di base (filtro Whittaker, λ = 200), normalizzazione dall'area sotto la curva e filtro derivato Savitzky Golay (polinomio di secondo grado in forma, primo ordine derivato, larghezza = 15 gradini). Questi spettri pre-elaborati servirà come riferimenti per il modello classico minimi quadrati (CLS).
  3. Elabora i dati di esempio dall'immagine nello stesso modo come gli spettri di riferimento. Ottenere punteggi CLS per ogni punto campione utilizzando un algoritmo CLS disponibile. I punteggi di CLS (DCL) diretti sono semplicemente le coordinate della proiezione di uno spettro di campione sullo spazio lineare definito dalla matrice inversa generalizzata (Moore-Penrose inverso) degli spettri di riferimento. Altro raccordo algoritmi possono essere utilizzati (non negativi minimi quadrati, minimi quadrati parziali o altri).
    Nota: Alcuni algoritmi di raccordo possono dar luogo a punteggi negativi, che in questo contesto non sono fisiche. Se questo è il caso, una soglia potrebbe essere impostata per escludere i punteggi negativi o un algoritmo vincolata non negativi minimi quadrati essere impiegato invece.
  4. Calcolare il rapporto puntuale dei punteggi sul riferimento per le nanoparticelle mirate (punteggiαFR) sopra i punteggi sul riferimento per le nanoparticelle non mirati (punteggint). Se i punteggi sono non negativi, il rapporto può essere espresso in maniera logaritmica:
    R = log10(αFRdi spartiti partiturent).
    Il rapporto R migliore viene visualizzato in una scala di colori divergenti centrata a zero, per esprimere l'abbondanza relativa delle sonde in ordini di grandezza. L'immagine risultante può essere sovrapposta sull'immagine luce bianco del campione, per rivelare aree di sovraespressione del recettore di folato.

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Risultati

Ai fini del controllo di qualità, le nanoparticelle possono essere caratterizzate utilizzando una varietà di metodi durante il processo di sintesi, tra cui TEM, DLS, analisi di nanoparticle tracking e la spettroscopia di assorbimento UV/Vis, come mostrato nella Figura 2.

In questo modo, la dimensione del nucleo oro nanostar (descritto nel punto 1), la formazione del guscio di silice (sezione 2) e su...

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Discussione

Il protocollo descritto qui vengono fornite istruzioni per la sintesi di due "gusti" di nanosonde SERRS e il loro impiego nei topi per Raman imaging del tumore ovarico che iperesprimono il recettore del folato, utilizzando un algoritmo raziometrici. Il vantaggio principale di Raman imaging rispetto ad altre tecniche di imaging ottici (quali la fluorescenza) è l'alta specificità del segnale Nanosonda che non può essere confuso con eventuali segnali di origine biologica. In questa incarnazione del Raman imaging, le nanopar...

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Dichiarazioni

• MFK è elencato come un inventore su parecchi rilasciato o istanze di brevetto relative a questo lavoro. MFK è co-fondatore di RIO Imaging, Inc., che mira a tradurre SERRS nanoparticelle in cliniche.

• Gli autori dichiarano di non avere nessun altri concorrenti interessi finanziari.

Ringraziamenti

Le seguenti fonti di finanziamento (per MFK) sono riconosciute: NIH R01 EB017748, CA222836 R01 e K08 CA16396; Damon Runyon-Rachleff Innovation Award DRR-29-14, premio Sohn Piazza Pershing Pershing Square Sohn Cancer Research Alliance, MSKCC centro per Imaging molecolare & nanotecnologia (CMINT) e lo sviluppo della tecnologia e concede. I riconoscimenti sono estesi anche al supporto sovvenzioni fornito dalla concessione MSKCC NIH Core (P30-CA008748).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Name of Reagent
Acido ascorbicoSigma-AldrichA5960
3-MPTMSSigma-Aldrich175617
Idrossido di ammonio (28%)Anticorpo anti-recettore anti-folato Sigma-Aldrich338818
[LK26] AbCamab3361
Dimetil solfossidoSigma-Aldrich276855
Dimetilsolfossido (anidro)Sigma-Aldrich276855
EtanoloSigma-Aldrich792780
IR140Sigma-Aldrich260932
IR780 perclorato*Sigma-Aldrich576409Fuori produzione*
IsopropanoloSigma-Aldrich650447
N.N.DimetilformammideSigma-Aldrich227056
PEG reticolanteSigma-Aldrich757853
PEG-maleimmideSigma-Aldrich900339
Acido tetracloroauricoSigma-Aldrich244597
OrtosilicatotetraetileSigma-Aldrich86578
*IR792Sigma-Aldrich425982*Alternativa
Nome dell'apparecchiatura
Cassetta per dialisi (3.500 MWCO)ThermoFIsher87724
Filtri centrifughiMilliporeUFC510096
inVia microscopio confocale RamanRenishaw
MATLAB (v2014b)Mathworks
PLS Toolbox (v8.0)Ricerca autovettoriale

Riferimenti

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