Articolo metodologico

Pannello di immunofluorescenza Multiplex automatizzato per gli studi di Immuno-oncologia su campioni di tessuto in formalina Carcinoma

DOI:

10.3791/58390

⸱

21 gennaio 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Pathology, MedImmune, 2Laboratory of Pathology, MedImmune, 3Akoya Biosciences Inc., 4Department of Translational Molecular Pathology, University of Texas - MD Anderson Cancer Center

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un protocollo dettagliato per un pannello indicatore di sei multiplex immunofluorescenza è ottimizzato ed eseguito, utilizzando un coloratore automatico per risultati più coerenti e un tempo di procedura più breve. Questo approccio può essere adattato direttamente da qualsiasi laboratorio per studi di immuno-oncologia.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Continui sviluppi in immuno-oncologia richiedono una maggiore comprensione dei meccanismi di immunologia del cancro. L'analisi di immunoprofiling dei campioni di tessuto da biopsie (FFPE) formalina-fisso e paraffina-incastonato è diventata uno strumento fondamentale per la comprensione della complessità dell'immunologia dei tumori e alla scoperta di nuovi biomarcatori predittivi per immunoterapia del cancro. Immunoprofiling analisi dei tessuti richiede la valutazione degli indicatori combinati, compreso sottopopolazioni delle cellule infiammatorie e immunitarie Checkpoint, nel microambiente tumorale. L'avvento dei metodi immunohistochemical multisala romanzo consente una più efficiente analisi multiparametrica delle sezioni del tessuto singolo rispetto a standard Levansucrasi immunohistochemistry (IHC). Una immunofluorescenza multiplex disponibile in commercio (se) metodo è basato sull'amplificazione del segnale di microarray e, combinato con l'analisi al microscopio multispettrale, consente una migliore separazione del segnale dei diversi marcatori nel tessuto. Questa metodologia è compatibile con l'uso di anticorpi primari non coniugati che sono state ottimizzate per standard IHC su campioni di tessuto FFPE. Qui descriviamo dettagliatamente un protocollo automatizzato che consente multiplex se etichettatura dei campioni di tessuto di carcinoma con un pannello di sei-marker della malattia multisala composta da PD-L1, PD-1, CD68, CD8, Ki-67 e i cytokeratins AE1/AE3 con 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole come una colorazione nucleare delle cellule. Il protocollo di pannello multiplex è ottimizzato in un coloratore automatico di IHC per un tempo di colorazione che è inferiore a quella del protocollo manuale e può essere direttamente applicato e adattato da qualsiasi ricercatore di laboratorio per gli studi di immuno-oncologia su campioni di tessuto umani FFPE. Sono anche descritti diversi controlli e strumenti, tra cui un metodo di controllo di goccia per controllo di qualità fine di un nuovo pannello se multiplex, che sono utili per l'ottimizzazione e convalida della tecnica.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunoprofiling analisi dei campioni di tessuto tumorale FFPE è diventata una componente essenziale degli studi di immuno-oncologia, in particolare per la scoperta e validazione di nuovi biomarcatori predittivi per immunoterapia del cancro nel contesto di studi clinici1 ,2. Cromogenico IHC, utilizzando cromogeni chimici quali diaminobenzidina, rimane la tecnica standard in patologia diagnostica per il immunolabeling di biopsia del tessuto3. IHC standard può essere utilizzato anche per il cancro del tessuto immunoprofiling, compresa la quantificazione delle sottopopolazioni dei linfocit....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nota: Il protocollo presentato qui viene descritto come eseguire la immunoprofiling di un pannello di mIF utilizzando TSA per sei anticorpi (CD68, ki67, PD-L1, PD-1, CD8 e AE1/AE3) su un coloratore automatico (Vedi Tabella materiali). Il protocollo descrive anche come eseguire i controlli di trascinamento per un controllo di qualità di un nuovo pannello di mIF (Vedi Materiali supplementari). In questo protocollo, la colorazione viene eseguita con FFPE otto vetrini dalla tonsilla umana (controllo positivo) e otto vetrini da adenocarcinoma del polmone umano. La prima diapositiva viene utilizzata per intero multiplex mac....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo descritto qui fornirà risultati come quelli mostrati nella Figura 2. Iniziare con una valutazione della colorazione nel controllo della tonsilla, cominciando con l'epitelio di superficie delle cellule squamose. L'istologia del campione tonsilla possa essere esaminata con un patologo, utilizzando la diapositiva di H & E come riferimento. Se sezioni IHC cromogenici vengono eseguiti con gli stessi marcatori nello stesso isolato del tessuto, que.......

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La rivoluzione di immunoterapia del cancro in corso è romanzo di apertura e promettente opzioni terapeutiche per i pazienti di cancro13. Progressi nel campo della immuno-oncologia richiederanno una maggiore conoscenza del microenvironment del tumore infiammatorio, non solo per capire la biologia dei meccanismi immunologici coinvolti nella carcinogenesi, ma anche per trovare biomarcatori predittivi per il nuovo trattamenti basati sull'immunoterapia1,

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato supportato da MedImmune, il biologics global R & D braccio di AstraZeneca. C.W., K.R. e C.C.H. sono dipendenti di Perkin Elmer, che produce i reagenti (kit di TSA) e multispectral scanner che sono stati utilizzati in questo lavoro. M.S., K.D., A.H., W.Z., C. Bagnall, C. Brown, J.C., A.L., K.S., M.R. e J.R.C sono dipendenti di MedImmune con proprietà di riserva e/o interessi di stock o opzioni in AstraZeneca.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Supporto editoriale è stato fornito da Deborah Shuman di MedImmune.

....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Software "InForm 2.4.2" per l'unmixing spettrale e l'analisi delle immaginiPerkinElmerCLS151066Chiamato "software di unmixing spettrale" nel testo
"Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software per la selezione di MSI e la visualizzazione complessiva della scansione dei vetrini PerkinElmerCLS151067Chiamato "software QPTIFF" nel testo
#1.5 Vetrini coprioggettiSigma Aldrich2975246
200 Proof EtanoloKoptecV1001
20x Tris-Buffered SalineVWRJ640-4L
Anticorpo DiluenteDAKOS2203
Anti-CD68 Topo MonoclonaleDAKOM087601-2Clone PG-M1
Anti-CD8 Coniglio MonoclonaleVentanaM5392SP239
Anti-CK Topo MonoclonaleDAKOM351501-2Clone AE1 / AE3
Anti-ki67 Topo MonoclonaleDAKOM724001-2Clone MIB-1
Anti-PD-1 Segnalazione cellulare monoclonale di coniglio#86163Clone D4W2J
Anti-PD-L1 Coniglio monoclonaleVentana790-4905Clone SP263
Bond Dewax SolutionLeicaAR9222Chiamato "soluzione dewax" nel testo
Bond Epitope Retrieval Solution 1LeicaAR9961Chiamato "ER1" nel testo
Bond Epitope Retrieval Solution 2LeicaAR9640Chiamato "ER2" nel testo
Bond Open Containers, 30 mLLeicaOP309700Chiamato "30 mL open containers" nel testo
Bond Open Containers, 7 mLLeicaOP79193Chiamato "7 mL open containersLeica
DS9800Chiamato "kit di rilevamento cromogenico" nel testo
Kit di rilevamento della ricerca sui legamiLeicaDS9455Chiamato "kit di rilevamento della ricerca" nel testo
Kit di titolazione dei legamiLeicaOPT9049Chiamato "kit di titolazione" nel testo
Bond Covertile universale NovocastraLeicaS21.2001Chiamato "covertiles" nel testo
Bond Wash Solution 10X ConcentrateLeicaAR9590Chiamato "10x wash solution" nel testo
BondRX AutostainerLeicaChiamato "automated stainer" nel testo
BondRX Software Version 5.2.1.204LeicaChiamato "automated stainer software" nel testo
Opal 7-Color Automation IHC KitPerkinElmerNEL801001KTChiamato "kit di colorazione multispettrale" nel testo
Perossidasi BlockLeicaRE7101
ProLong Diamond Antifade MountantThermoP36965Chiamato "slide mountant" nel testo
Starfrost SlidesFisher15-183-51
Microscopio multispettrale Vectra Polaris con software "Vectra 3.0.5" per il controllo multispettrale del microscopioPerkinElmerCLS143455Chiamato "software di controllo del microscopio" nel testo

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges. Current Opinion in Immunology. 45, 60-72 (2017).
  2. Taube, J. M., et al. Implications....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Campioni di tessuto FFPEColoratore automatico per IHCAmplificazione del segnale tramite tiramideMicroscopia multispettralePD L1 PD 1 CD68 CD8 Ki 67 AE1 AE3Metodo del controllo a gocciaSoftware di scomposizione spettralePiattaforma di imaging multispettrale

Articoli correlati