Articolo metodologico

Isolamento dei tilacoidi fisiologicamente attivo e il loro uso nelle analisi di trasporto energia-dipendente della proteina

DOI:

10.3791/58393

⸱

28 settembre 2018

 ,  ,  , 
1Department of Plant Biology, University of California - Davis

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vi presentiamo protocolli qui per isolamento ad alto rendimento di tilacoidi fisiologicamente attivo e analisi di trasporto di proteina per la traslocazione di cloroplasto doppia arginina (cpTat), secretiva (cpSec1) e vie di segnale riconoscimento delle particelle (cpSRP).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cloroplasti sono gli organelli in piante verdi responsabile per lo svolgimento di numerose vie metaboliche essenziali, in particolare la fotosintesi. Entro i cloroplasti, il sistema a membrana tilacoide ospita tutti i pigmenti fotosintetici, complessi del centro di reazione e la maggior parte degli elementi portanti dell'elettrone ed è responsabile della sintesi di ATP di luce-dipendente. Oltre il 90% delle proteine del cloroplasto sono codificate nel nucleo, tradotta nel citosol e successivamente importati nel cloroplasto. Ulteriore trasporto di proteine in o attraverso la membrana tilacoide utilizza uno dei quattro percorsi di spostamento. Qui, descriviamo un metodo ad alto rendimento per l'isolamento di trasporto-competente tilacoidi dai piselli (Pisum sativum), insieme a saggi di trasporto attraverso le tre energia-dipendente cpTat, cpSec1 e cpSRP-ha mediato le vie. Questi metodi consentono sperimentazioni relative alla localizzazione della proteina tilacoide, trasporto energetica e i meccanismi di traslocazione di proteine attraverso le membrane biologiche.

Introduzione

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Quasi tutti i macchinari PROTEINICO responsabili cloroplasto corretta funzione deve essere spostati dal cytosol1. Presso le buste del cloroplasto, substrati della proteina sono importati attraverso il Traslocone della membrana esterna (TOC) e il Traslocone della membrana interna (TIC)2. Ulteriormente il targeting per il thylakoid membrana e lume si verifica attraverso la doppia arginina traslocazione (cpTat)3, il secretiva (cpSec1)4, il segnale riconoscimento delle particelle (cpSRP)5e i percorsi di inserimento spontaneo6 . Un metodo per l'isolamento ad alto rendimento dei cloroplasti fisiologicamente attivi e membrane tilacoidali è necessario misurare l'energetica e la cinetica di un evento di spostamento, per comprendere i meccanismi di trasporto diversi in ciascun percorso e per localizzare un substrato particolare proteina di interesse per uno qualsiasi dei sei comparti distinti del cloroplasto.

L'isolamento delle membrane da cloroplasto offre meglio sperimentale controllo sui fattori ambientali (quali le concentrazioni di sale e substrato, la presenza di ATP/GTP e condizioni di pH) che influenzano la misurazione dell'energetica di trasporto e cinetica. Questo ambiente in vitro si presta all'esplorazione dei dettagli meccanicistici di spostamento per gli stessi motivi. Inoltre, mentre software predittivo per la localizzazione delle proteine cloroplasto è migliorata7,8, in vitro trasporto saggi forniscono un metodo più veloce per la conferma nel corso di base di microscopia fluorescente saggi che richiedono un tag fluorescente geneticamente codificato, impianto di trasformazione e/o gli anticorpi specifici. Qui, presentiamo protocolli per isolamenti cloroplasto e tilacoidale da piselli (Pisum sativum), così come per le analisi di trasporto ottimizzate per ciascuna delle vie traslocazione thylakoid energia-dipendente.

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Protocollo

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1. materiali iniziale

  1. Ammollo circa 55 g di piselli per 3 ore in 400 mL di acqua distillata e quindi seminare in un vassoio di plastica (35 x 20 cm x 6 cm) in terreno coperto con sottile strato di vermiculite.
  2. Crescere il vassoio di piselli a 20 ° C sotto ciclo luce/buio (50 µE/m2s) 12/12 h per 9-15 giorni.
  3. Preparare il substrato proteico secondo un metodo preferito.
    Nota: Abbiamo preparato substrati della proteina usando una varietà di metodi, tra cui 1) trascrizione in vitro da plasmidi purificati seguita da traduzione utilizzando estratti di germe di grano o di lisati di reticolociti di coniglio in presenza [3H]-leucina o [35S]-metionina, 2) traduzione in vitro utilizzando un kit di trascrizione/traduzione accoppiato come il TnT Kit Promega, con radiolabeling come sopra, e 3) la purificazione della proteina overexpressed in Escherichia coli. Prodotti radioattivi in vitro traduzione generalmente vengono temprati con 50mm aminoacido freddo prima dell'uso in reazioni di trasporto. Ciascuno di questi metodi in genere richiede qualche ottimizzazione per ogni nuova proteina substrato. Per un esempio di un sistema accoppiato in vitro , vedere Ling e Jarvis (2016)9.

2. quantificazione e isolamento cloroplasto

Nota: Il primo passo nella preparazione dei tilacoidi è l'isolamento dei cloroplasti intatti10. Tutti i materiali dovrebbero essere tenuti a freddi durante la preparazione. Risospensione dei cloroplasti deve essere maneggiati con delicatezza, come rottura in questa fase può limitare severamente thylakoid successiva resa.

  1. Preparare in seguito soluzioni in anticipo.
    1. 2 x rettifica Buffer (2xGB): 100 millimetri K-HEPES pH 7.3, sorbitolo di 660 mM, 2 mM MgCl2, 2mm MnCl2, 4mm EDTA, 0,2% di BSA.
    2. 2 x importazione Buffer (2xIB): 100 mM K-Tricine o K-HEPES pH 8.0, sorbitolo di 660 mM, 8 mM MgCl2.
      Nota: Le concentrazioni di MgCl2 che vanno da 3 mM a 10 mM sono state utilizzate senza differenze osservabili.
  2. Preparare un gradiente di densità continuo mediante centrifugazione di una miscela di 15 mL di Percoll e 15 mL di 2xGB a 30.900 g in un rotore ad angolo fisso per 30 min a 4 ° C con il freno fuori.
  3. Raccogliere circa 25 g di piselli 9-15 giorno vecchio e omogeneizzare in 95 mL di 1xGB. O un frullatore con lame affilate o un Polytron sono stati utilizzati con successo. Filtrare la miscela attraverso almeno 2 strati di Miracloth in un imbuto.
    Nota: Limitare la quantità di staminali tessuto non è necessario ma semplificano il processo di omogeneizzazione, riducendo così la rottura del cloroplasto che possa verificarsi con miscelazione prolungata.
  4. Pellet a 3.000 g in un rotore oscillante per 5 min a 4 ° C e Risospendere delicatamente in 1 mL di 1xGB. Un pennello può essere la più delicata tecnica di risospensione.
  5. Strato con attenzione la sospensione verde in cima al gradiente di Percoll e centrifugare a 8.000 g in un rotore oscillante per 10 min a 4 ° C con il freno fuori.
  6. Accuratamente raccolto la banda inferiore verde contenente cloroplasti intatti in una nuova provetta. Spin recuperati intatti cloroplasti a 1.800 g in un rotore oscillante per 5 min a 4 ° C, scartare il surnatante e Risospendere delicatamente in 1xIB. Ripetere questo passaggio di lavaggio una volta di più, risospendere in 30 mL di 1xIB ogni volta, con il finale risospensione in 1 mL di 1xIB.
  7. Per quantificare il contenuto di clorofilla (Chl), mescolare 10 µ l di sedimento completamente cloroplasti con 5 mL di 80% di acetone e filtrare attraverso carta da filtro Whatman 1 (spessore nominale 180 µm). Annotare l'assorbanza a 720 nm, 663 nm e 645 nm in uno spettrofotometro e calcolare la concentrazione di Chl utilizzando la seguente formula11:
    [Chl] mg/mL = [40.2* (un663 – un720) + 101.4* (un645 – un720)] * 0,1
  8. Regolare i cloroplasti a 1mg/mL Chl equivalenti con 1xIB.

3. isolamento dei tilacoidi

Nota: Tilacoidi sono preparati da Lisi ipotonica dei cloroplasti intatti. Ciò si ottiene esponendo i cloroplasti in un buffer ipotonico carente sorbitolo. Tilacoidi isolato possono essere utilizzato per qualsiasi delle vie di traslocazione analizzante, ma stromal Estratto (SE) inoltre deve essere isolato durante questa preparazione se vie o cpSec1 o cpSRP sono di essere studiato.

  1. Preparare in anticipo le seguenti soluzioni.
    1. Buffer di lisi ipotonico: 50mm K-Tricine o K-HEPES pH 8.0, 8 mM MgCl2.
    2. 2 x grezzo Stroma Buffer (per la concentrazione del SE): 100 millimetri K-HEPES pH 8.0, sorbitolo di 660 mM, 8 mM MgCl2.
    3. Tampone di Laemmli (per SDS-PAGE, completati con EDTA): 125 mM Tris-HCl pH 6.8, SDS 10%, 20% glicerolo, blu di bromofenolo 0,05 mg/mL, 10% β-mercaptoetanolo, 10mm EDTA.
  2. Se non è necessario SE recuperare, centrifugare i cloroplasti intatti a 1.000 g in un rotore oscillante per 6 min a 4 ° C.
    1. Scartare il surnatante e risospendere a 1 mg/mL in tampone di Lisi ipotonica. Incubare in ghiaccio al buio per 10 min, con occasionali di miscelazione.
    2. Recuperare i tilacoidi mediante centrifugazione a 3.200 g nel rotore per 8 min oscillante a 4 ° C. Lavare i tilacoidi due volte, risospendere con 1-2 mL di tampone di lisi ogni volta. Risospendere con 1 mL di 1xIB e requantify Chl come sopra dal protocollo di isolamento del cloroplasto.

4. concentrazione e recupero stromal Estratto

  1. Se ripristino SE è necessario, dividere i cloroplasti intatti in 600 aliquote µ l in provette per microcentrifuga da 1,5 mL e centrifugare ogni provetta a 1.000 g nel rotore per 6 min oscillante a 4 ° C.
    Nota: Questo volume è conveniente quando si utilizzano provette microcentrifuga da 1,5 mL, che aiuta a prevenire la dispersione del pellet eventuali per membrane residue.
    1. Risospendere a 1mg/mL Chl in tampone di Lisi ipotonica e incubare in ghiaccio al buio per 10 minuti, come descritto al punto 3.2.1.
    2. Centrifugare le provette a 3.200 x g a rotore per 8 min oscillante a 4 ° C e la luce verde o giallo surnatante seguente cloroplasto lisi di trasferimento ad un nuovo tubo del microcentrifuge con un volume uguale di 2 x grezzo Stroma Buffer.
    3. Lavare tilacoidi con 2 volumi di tampone di lisi (approssimazione di 0,5 mg/mL) e raccogliere mediante centrifugazione a 3.200 g nel rotore per 8 min oscillante a 4 ° C. Risospendere a 1mg/mL Chl in 1xIB su ghiaccio.
    4. Centrifugare il greggio stroma a 42.000 g in un rotore ad angolo fisso per 30 min a 4 ° C per rimuovere membrane residue. Immunoblotting per proteine dell'involucro esterno e quello interno può essere utilizzato per verificare la purezza del surnatante.
    5. Raccogliere il 95% del volume da ciascuna provetta senza disturbare la piccola pallina di colore giallo-verde. Nota il volume prelevato da ciascuna provetta.
    6. Per preparare l'estratto concentrato di stromal (SE), raccogliere i raccolti supernatanti e concentrarsi quintuplo utilizzando un concentratore a 4 mL 30 kDa MWCO.
      Nota: SE preparato in questo modo equivale allo stroma derivato da cloroplasti a 2,5 mg/mL CHL. Se necessario, SE possono essere dieci volte concentrati a 5 mg/mL Chl equivalenti. SE sarà di colore dorato e viscoso. Nella centrifuga di leggenda RT del laboratorio con rotore oscillante, questo richiede circa 10 min per mL concentrato.

5. trasporto attraverso la cpTat via

Nota: A differenza del cpSec1 o cpSRP, la via di cpTat non richiede componenti solubili o esogenicamente aggiunto fonti energetiche; solo la forza motrice protonica luce-driven è necessario3. Pertanto, solo isolato proteico tilacoidi e substrato sono necessari per il dosaggio. Substrati tipici sono forme intermedie del 17 kDa (come si vede nella Figura 1) e 23 kDa subunità dell'ossigeno in evoluzione complessa, iOE17 e iOE23, rispettivamente, ma forme precursore, prOE17 e prOE23, inoltre può essere trasportato con successo. Forme di precursore hanno l'intera bipartita sequenza N-terminale targeting, mentre forme intermedie hanno solo il thylakoid sequenza di targeting.

  1. Preparare la miscela di trasporto di cpTat con 0,33 mg/mL Chl tilacoidi, 5mm ATP da un brodo preparato in 1xIB e 8mm ditiotreitolo (DTT) da un brodo preparato in 1xIB, sul ghiaccio. ATP non è strettamente necessario per questa reazione se condotti nell'ambito dell'illuminazione.
  2. Avvia trasporto introducendo 01:30 volume per volume della proteina substrato nel trasporto mescolare. Se proteina substrato non è preparata a 1xIB, preparare una diluizione con 2xIB in primo luogo, quindi utilizzare 01:30 volume per volume del substrato diluito nel mix trasporto 1:1.
    Nota: Le concentrazioni di substrato varierà in base al metodo di preparazione. In genere, preparazioni in vitro permetterà nanomolari micromolar importi, mentre sovraespressione permetterà per micromolar agli importi millimolar. Metodi di rilevamento devono anche essere considerati, come autoradiografia e fluorography sono più sensibili di immunoblotting.
  3. Illuminare la sospensione a 80-100 µE/m2s di radiazione fotosinteticamente attiva (PAR) per 10 min a temperatura ambiente. Se la cinetica del trasporto è richiesto, la pre-equilibrare mix tilacoidi e la reazione a temperatura ambiente e illuminare per fino a 30 min.
  4. Arrestare la reazione di trasporto con una diluizione 8 volte di 1xIB ghiacciata e recuperare tilacoidi mediante centrifugazione a 3.200 g in microcentrifuga per 5 min a 4 ° C.
  5. Rimuovere residuo substrato che non è stato trasportato, risospendere il pellet thylakoid in 120 µ l di 1xIB e digerire le proteine esterne tramite l'aggiunta di 6 µ l di 2 mg/mL termolisina e 10 mM CaCl2 in 1xIB.
  6. Incubare la reazione di proteasi in ghiaccio per 40 min e poi placare la proteasi raddoppiando il volume con 25 mM EDTA preparato in 1xIB.
  7. Recuperare i tilacoidi mediante centrifugazione a 3.200 g in una microcentrifuga per 5 min a 4 ° C. Lavare tilacoidi recuperati in 120 μL di 5mm EDTA in 1xIB e trasferirlo in una nuova provetta.
  8. Centrifugare a 3.200 g in una microcentrifuga per 5 min a 4 ° C. Risospendere in un appropriato volume di tampone di Laemmli completati con 10 mM EDTA. Un volume di 40 µ l di solito è sufficiente a rilevare substrato su un gel di SDS-PAGE e conserva il campione per ripetere i gel quando necessario.
  9. I campioni in un bagno di acqua bollente per 10 min e analizzare da SDS-PAGE. Autoradiografia, fluorography o macchiarsi occidentale delle proteine non-nativi o epitopo-tag sono stati utilizzati con successo per il rilevamento delle proteine trasportati.

6. trasporto attraverso la via di cpSec1

Nota: Il trasporto attraverso il Traslocone cpSec1 richiede la proteina stromal cpSecA112,13, che possono essere acquistati tramite sovraespressione in e. coli14,15 o recuperati dalla concentrazione dello stroma durante l'isolamento thylakoid. Un substrato tipico è la subunità 33 kDa dell'ossigeno in evoluzione complessa (prOE33), come si vede nella Figura 2.

  1. Preparare la miscela di trasporto cpSec1 con 0,33 mg/mL Chl tilacoidi, 0,83 mg/mL Chl equivalente SE o 1,5 μg di cpSecA1 ricombinante e 5mm ATP sul ghiaccio e incubare per 10 min. Una miscela di reazione di trasporto tipico qui è 72 μL, fino da 60 μL a causa dell'aggiunta di SE.
    1. Se invece SE verrà utilizzato cpSecA1 ricombinante, regolare cpSecA1 purificata con un volume uguale di 2xIB, quindi diluire ad una concentrazione conveniente per aggiungere delle reazioni di trasporto (ad esempio, 0,75 µ g / µ l).
      Nota: Per l'archiviazione a lungo termine, cpSecA1 viene memorizzato sul ghiaccio in una stanza controllata, refrigerata dopo purificazione come congelamento abolisce l'attività.
  2. Avvia trasporto introducendo 01:10 volume per volume della proteina substrato al trasporto mescolare. Se la proteina substrato non è preparata a 1xIB, preparare una diluizione di 1:1 con 2xIB e aggiungere 01:10 volume per volume della proteina diluita per il mix di trasporto.
  3. Incubare la reazione a temperatura ambiente per 10 min, con 80 – 100 µE/m2s PAR. Ancora una volta, tempi più lunghi possono essere necessari per alcuni substrati o cinetica.
  4. Dopo trattamento con luce, diluire 8 volte con gelide reazioni 1xIB e centrifugare a 3200 g in microcentrifuga per 5 min a 4 ° C.
  5. Trattare con termolisina e dissetare con EDTA come sopra in passaggi 5.5 attraverso 5.7.
  6. Centrifugare a 3.200 g in microcentrifuga per 5 min a 4 ° C e risospendere il pellet in un appropriato volume di tampone di Laemmli completati con 10 mM EDTA. Posto a bagnomaria per 10 min prima del caricamento su gel di SDS-PAGE bollente.

7. inserimento attraverso il Pathway di cpSRP

Nota: L'integrazione di cpSRP-mediata di luce complesse proteine (LHCP) visto nella Figura 3 la raccolta richiede cpSRP54, cpSRP43 e cpFtsY16. Questi componenti vengono forniti per la reazione di trasporto attraverso Estratto concentrato di stromal, come descritto per il protocollo di trasporto cpSec1.

  1. Preparare il cpSRP trasporto mix con 0,33 mg/mL Chl tilacoidi, 0,83 mg/mL SE equivalente Chl e 5mm ATP sul ghiaccio e incubare per 10 min.
  2. Avvia trasporto introducendo 01:10 volume per volume della proteina substrato al trasporto mescolare. Se la proteina substrato non è preparata a 1xIB, preparare una diluizione di 1:1 con 2xIB e aggiungere 01:10 volume per volume della proteina diluita per il mix di trasporto.
  3. Incubare la reazione a temperatura ambiente per 10 min a 80 – 100 µE/m2s PAR.
  4. Dopo trattamento con luce, diluire 8 volte con gelide reazioni 1xIB e centrifugare a 3.200 g in microcentrifuga per 5 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 120 µ l di 1xIB.
  5. Trattare con termolisina come sopra nelle sezioni 5.5 tramite 5.7. Termolisina digestione è necessaria qui per valutare integrazione riuscita membrana. Lavare tilacoidi recuperati in 120 μL di 5mm EDTA in 1xIB e trasferirlo in una nuova provetta.
  6. Centrifugare a 3.200 g in microcentrifuga per 5 min a 4 ° C e risospendere il pellet nuovamente in un appropriato volume di tampone di x Laemmli 2 completati con 10 mM EDTA. Posto a bagnomaria per 10 min prima dell'analisi di SDS-PAGE bollente.
    Nota: Integrazione di maturo LHCP (mLHCP) è valutato dalla comparsa di un prodotto di degradazione della proteasi-protetto (mLHCP-D) circa 1.5-2 kDa minore l' ApoAlert mLHCP17.

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Risultati

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Per misurare la quantità di substrato correttamente trasportato, è utile includere una o più corsie di "ingresso per cento". Per i dati presentati di seguito, è stato utilizzato il 10% della reazione trasporto finale senza tilacoidi. Questo ingresso"percentuale" aiuta anche a visualizzare le dimensioni del substrato precursore. La percentuale rappresenta una quantità del substrato con cui al substrato confronta trasportato contro nota, definita e possa essere regolata su o giù come necess...

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Discussione

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Cloroplasto e tilacoidale isolamento

La rottura eccessiva può causare nel cloroplasto povero isolamento e così povero thylakoid resa dopo la separazione della sfumatura. È meglio omogeneizzare il tessuto raccolto delicatamente facendo in modo che tutto il materiale è sommerso prima di miscelazione e pulsare in 15 cicli di s fino a quando completamente omogeneizzato. Se necessario, utilizzare più cicli più brevi di miscelazione con meno tessuto in ogni round.

Tutti i ma...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo manoscritto è stato preparato con finanziamento da parte della divisione di scienze chimiche, Geoscienze e Biosciences, 408 ufficio energia delle scienze di base del dipartimento di energia attraverso Grant DE-SC0017035

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Pisum sativum seedsSeedway LLC, Hall, NY8686 - Little Marvel
MiraclothCalbiochem, Gibbstown, NJ475855-1
80% AcetoneSigma, Saint Louis, MO67-64-1
Frullatore con lame affilateWaring CommercialBB155S
Polytron 10-35Fischer Sci13-874-617
PercollSigma, Saint Louis, MOGE17-0891-01
Beckman J2-MC con rotore JA 20Beckman-Coulter8043-30-1180
Sorvall RC-5B con rotore HB-4Sorvall8327-30-1016
100 mM ditiotreitolo (DTT) in 1xIBSigma, Saint Louis, MO12/3/83Può essere congelato in aliquote per uso futuro
200 mM MgATP in 1xIBSigma, Saint Louis, MO74804-12-9Può essere congelato in aliquote per un uso futuro
Termolisina in 1xIB (2mg/mL)Sigma, Saint Louis, MO9073-78-3Può essere congelato in aliquote per un uso futuro
HEPESSigma, Saint Louis, MOH3375
K-TricineSigma, Saint Louis, MOT0377
SorbitoloSigma, Saint Louis, MO50-70-4
Cloruro di magnesioSigma, Saint Louis, MO7791-18-6
Cloruro di manganeseSigma, Saint Louis, MO13446-34-9
EDTASigma, Saint Louis, MO60-00-4
BSASigma, Saint Louis, MO9048-46-8
TrisSigma, Saint Louis, MO77-86-1
SDSSigma, Saint Louis, MO151-21-3
GliceroloSigma, Saint Louis, MO56-81-5
Blu di bromofenoloSigma, Saint Louis, MO115-39-9
B-MercaptoetanoloSigma, Saint Louis, MO60-24-2

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ellis, R. Chloroplast protein synthesis: principles and problems. Sub-cellular biochemistry. 9, 237(1983).
  2. Li, H. -m, Chiu, C. -C. Protein transport into chloroplasts. Annual review of plant biology. 61, (2010).
  3. Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M. Protein-specific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP. Journal of Biological Chemistry. 267 (4), 2688-2696 (1992).
  4. Skalitzky, C. A., et al. Plastids contain a second sec translocase system with essential functions. Plant physiology. 155 (1), 354-369 (2011).
  5. Dabney-Smith, C., Storm, A. Plastid Biology. , Springer. 271-289 (2014).
  6. Kim, S. J., Jansson, S., Hoffman, N. E., Robinson, C., Mant, A. Distinct "assisted" and "spontaneous" mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 274 (8), 4715-4721 (1999).
  7. Emanuelsson, O., Nielsen, H., Von Heijne, G. C. hloroP. ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites. Protein Science. 8 (5), 978-984 (1999).
  8. Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G., Nielsen, H. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nature protocols. 2 (4), 953(2007).
  9. Ling, Q., Jarvis, R. Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants. Journal of Visualized Experiments. (117), e54717(2016).
  10. Lo, S. M., Theg, S. M. Photosynthesis Research Protocols. , Springer. 139-157 (2011).
  11. Vernon, L. P. Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts. Analytical Chemistry. 32 (9), 1144-1150 (1960).
  12. Knott, T. G., Robinson, C. The secA inhibitor, azide, reversibly blocks the translocation of a subset of proteins across the chloroplast thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 7843-7846 (1994).
  13. Yuan, J., Henry, R., McCaffery, M., Cline, K. SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont-derived sorting. Science. 266 (5186), 796-798 (1994).
  14. Nohara, T., Nakai, M., Goto, A., Endo, T. Isolation and characterization of the cDNA for pea chloroplast SecA Evolutionary conservation of the bacterial-type SecA-dependent protein transport within chloroplasts. FEBS letters. 364 (3), 305-308 (1995).
  15. Endow, J. K., Singhal, R., Fernandez, D. E., Inoue, K. Chaperone-assisted post-translational transport of plastidic type I signal peptidase 1. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28778-28791 (2015).
  16. Luirink, J., Sinning, I. SRP-mediated protein targeting: structure and function revisited. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1694 (1-3), 17-35 (2004).
  17. Yuan, J., Henry, R., Cline, K. Stromal factor plays an essential role in protein integration into thylakoids that cannot be replaced by unfolding or by heat shock protein. Hsp70. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (18), 8552-8556 (1993).
  18. Tjalsma, H., van Dijl, J. M. Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane. Proteomics. 5 (17), 4472-4482 (2005).
  19. Widdick, D. A., Eijlander, R. T., van Dijl, J. M., Kuipers, O. P., Palmer, T. A Facile Reporter System for the Experimental Identification of Twin-Arginine Translocation (Tat) Signal Peptides from All Kingdoms of Life. Journal of Molecular Biology. 375 (3), 595-603 (2008).
  20. Yuan, J., Cline, K. Plastocyanin and the 33-kDa subunit of the oxygen-evolving complex are transported into thylakoids with similar requirements as predicted from pathway specificity. Journal of Biological Chemistry. 269 (28), 18463-18467 (1994).
  21. Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., Büchel, C. Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach. Biochemistry. 43 (45), 14508-14516 (2004).
  22. Frielingsdorf, S., Jakob, M., Klösgen, R. B. A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).
  23. Tu, C. -J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes. Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).

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