Vi presentiamo protocolli qui per isolamento ad alto rendimento di tilacoidi fisiologicamente attivo e analisi di trasporto di proteina per la traslocazione di cloroplasto doppia arginina (cpTat), secretiva (cpSec1) e vie di segnale riconoscimento delle particelle (cpSRP).
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Articolo metodologico
Isolamento dei tilacoidi fisiologicamente attivo e il loro uso nelle analisi di trasporto energia-dipendente della proteina
In questo articolo
Sommario
Abstract
Cloroplasti sono gli organelli in piante verdi responsabile per lo svolgimento di numerose vie metaboliche essenziali, in particolare la fotosintesi. Entro i cloroplasti, il sistema a membrana tilacoide ospita tutti i pigmenti fotosintetici, complessi del centro di reazione e la maggior parte degli elementi portanti dell'elettrone ed è responsabile della sintesi di ATP di luce-dipendente. Oltre il 90% delle proteine del cloroplasto sono codificate nel nucleo, tradotta nel citosol e successivamente importati nel cloroplasto. Ulteriore trasporto di proteine in o attraverso la membrana tilacoide utilizza uno dei quattro percorsi di spostamento. Qui, descriviamo un metodo ad alto rendimento per l'isolamento di trasporto-competente tilacoidi dai piselli (Pisum sativum), insieme a saggi di trasporto attraverso le tre energia-dipendente cpTat, cpSec1 e cpSRP-ha mediato le vie. Questi metodi consentono sperimentazioni relative alla localizzazione della proteina tilacoide, trasporto energetica e i meccanismi di traslocazione di proteine attraverso le membrane biologiche.
Introduzione
Quasi tutti i macchinari PROTEINICO responsabili cloroplasto corretta funzione deve essere spostati dal cytosol1. Presso le buste del cloroplasto, substrati della proteina sono importati attraverso il Traslocone della membrana esterna (TOC) e il Traslocone della membrana interna (TIC)2. Ulteriormente il targeting per il thylakoid membrana e lume si verifica attraverso la doppia arginina traslocazione (cpTat)3, il secretiva (cpSec1)4, il segnale riconoscimento delle particelle (cpSRP)5e i percorsi di inserimento spontaneo6 . Un....
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Protocollo
1. materiali iniziale
- Ammollo circa 55 g di piselli per 3 ore in 400 mL di acqua distillata e quindi seminare in un vassoio di plastica (35 x 20 cm x 6 cm) in terreno coperto con sottile strato di vermiculite.
- Crescere il vassoio di piselli a 20 ° C sotto ciclo luce/buio (50 µE/m2s) 12/12 h per 9-15 giorni.
- Preparare il substrato proteico secondo un metodo preferito.
Nota: Abbiamo preparato substrati della proteina usando una varietà di metodi, tra cui 1) trascrizione in vitro da plasmidi purificati seguita da traduzione utilizzando estratti di germe di grano o di lisati di reticolociti di coniglio in presenza [
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Risultati
Per misurare la quantità di substrato correttamente trasportato, è utile includere una o più corsie di "ingresso per cento". Per i dati presentati di seguito, è stato utilizzato il 10% della reazione trasporto finale senza tilacoidi. Questo ingresso"percentuale" aiuta anche a visualizzare le dimensioni del substrato precursore. La percentuale rappresenta una quantità del substrato con cui al substrato confronta trasportato contro nota, definita e possa essere regolata su o giù come necess.......
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Discussione
Cloroplasto e tilacoidale isolamento
La rottura eccessiva può causare nel cloroplasto povero isolamento e così povero thylakoid resa dopo la separazione della sfumatura. È meglio omogeneizzare il tessuto raccolto delicatamente facendo in modo che tutto il materiale è sommerso prima di miscelazione e pulsare in 15 cicli di s fino a quando completamente omogeneizzato. Se necessario, utilizzare più cicli più brevi di miscelazione con meno tessuto in ogni round.
Tutti i ma.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo manoscritto è stato preparato con finanziamento da parte della divisione di scienze chimiche, Geoscienze e Biosciences, 408 ufficio energia delle scienze di base del dipartimento di energia attraverso Grant DE-SC0017035
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pisum sativum seeds | Seedway LLC, Hall, NY | 8686 - Little Marvel | |
| Miracloth | Calbiochem, Gibbstown, NJ | 475855-1 | |
| 80% Acetone | Sigma, Saint Louis, MO | 67-64-1 | |
| Frullatore con lame affilate | Waring Commercial | BB155S | |
| Polytron 10-35 | Fischer Sci | 13-874-617 | |
| Percoll | Sigma, Saint Louis, MO | GE17-0891-01 | |
| Beckman J2-MC con rotore JA 20 | Beckman-Coulter | 8043-30-1180 | |
| Sorvall RC-5B con rotore HB-4 | Sorvall | 8327-30-1016 | |
| 100 mM ditiotreitolo (DTT) in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 12/3/83 | Può essere congelato in aliquote per uso futuro |
| 200 mM MgATP in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 74804-12-9 | Può essere congelato in aliquote per un uso futuro |
| Termolisina in 1xIB (2mg/mL) | Sigma, Saint Louis, MO | 9073-78-3 | Può essere congelato in aliquote per un uso futuro |
| HEPES | Sigma, Saint Louis, MO | H3375 | |
| K-Tricine | Sigma, Saint Louis, MO | T0377 | |
| Sorbitolo | Sigma, Saint Louis, MO | 50-70-4 | |
| Cloruro di magnesio | Sigma, Saint Louis, MO | 7791-18-6 | |
| Cloruro di manganese | Sigma, Saint Louis, MO | 13446-34-9 | |
| EDTA | Sigma, Saint Louis, MO | 60-00-4 | |
| BSA | Sigma, Saint Louis, MO | 9048-46-8 | |
| Tris | Sigma, Saint Louis, MO | 77-86-1 | |
| SDS | Sigma, Saint Louis, MO | 151-21-3 | |
| Glicerolo | Sigma, Saint Louis, MO | 56-81-5 | |
| Blu di bromofenolo | Sigma, Saint Louis, MO | 115-39-9 | |
| B-Mercaptoetanolo | Sigma, Saint Louis, MO | 60-24-2 |
Riferimenti
- Ellis, R. Chloroplast protein synthesis: principles and problems. Sub-cellular biochemistry. 9, 237(1983).
- Li, H. -m, Chiu, C. -C. Protein transport into chloroplasts. Annual review of plant biology. 61, (2010).
- Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M.
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Ristampe e permessi
