Qui, presentiamo un protocollo per isolare rapidamente i nuclei di alta qualità dal tessuto fresco o congelato per sequenziamento di RNA massicciamente parallelo a valle. Includiamo opzioni lisi delle cellule e la rottura detergente-meccanica e ipotonico-meccanica del tessuto, entrambi dei quali possono essere utilizzati per l'isolamento dei nuclei.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Isolamento dei Nuclei del midollo spinale adulto per il sequenziamento massivamente parallelo Single-nucleo RNA
In questo articolo
Avviso di errata corrige
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Sommario
Abstract
Espressione genica di una singola cella di sondaggio consente l'identificazione del tipo di cella e stato della cellula. Sequenziamento di RNA di cella singola è emerso come un potente strumento per lo studio di profili trascrizionali delle cellule, particolarmente in tessuti eterogenei, come il sistema nervoso centrale. Tuttavia, metodi di dissociazione richiesti per il sequenziamento di singola cellula possono portare a modifiche sperimentali nella morte delle cellule e l'espressione genica. Inoltre, questi metodi sono generalmente limitati ai tessuti freschi, limitando così gli studi su archiviazione e materiale bio-banca. Sequenziamento di singolo nucleo RNA (snRNA-Seq) è un'alternativa attraente per gli studi trascrizionale, dato che esso identifica i tipi di cellule con precisione, permette lo studio del tessuto che è congelato o difficile dissociare, e riduce la dissociazione indotta trascrizione. Qui, presentiamo un protocollo ad alta velocità per il rapido isolamento dei nuclei per downstream snRNA-segg. Questo metodo attiva l'isolamento dei nuclei da campioni di midollo spinale fresco o congelato e può essere combinato con due piattaforme di incapsulamento di parallelismo massivo della gocciolina.
Introduzione
Il sistema nervoso è composto da gruppi eterogenei di cellule che visualizzano una gamma diversificata di proprietà morfologiche, biochimiche ed elettrofisiologiche. Mentre il sequenziamento di RNA di massa è stato utile per determinare le modifiche a livello di tessuto nell'espressione genica in condizioni diverse, non preclude il rilevamento delle modifiche trascrizionali a livello di singola cellula. Gli avanzamenti recenti nell'analisi trascrizionale monocellulari hanno permesso la classificazione delle cellule eterogenee in gruppi funzionali basati sul loro repertorio molecolare e possono essere sfruttati anche per rilevare insiemi di neuroni che erano stato recentemente attivi. 1 , 2 , 3 , 4 negli ultimi dieci anni, lo sviluppo della singola cella RNA sequenziamento (scRNA-Seq) ha permesso lo studio dell'espressione genica in cellule individuali, offrendo una visione diversità di cellula-tipo. 5
L'emergere di approcci scalabili come parallelismo massivo scRNA-Seq, ha fornito piattaforme ai tessuti eterogenei sequenza, tra cui molte regioni del sistema nervoso centrale. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 tuttavia, metodi di dissociazione di singola cellula possono portare a morte cellulare, nonché di modifiche sperimentali nell'espressione genica. 16 lavoro recente ha adattato i metodi di sequenziamento di singola cella per consentire la conservazione dei profili trascrizionali endogeni. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 queste strategie sono state particolarmente adatte per la rilevazione di espressione genica (IEG) inizio immediato seguito stimolo sensoriale o comportamento. 3 , 4 In futuro, questa strategia potrebbe essere utilizzata anche per studiare i cambiamenti dinamici in tessuti negli Stati di malattia o in risposta allo stress. Di questi metodi, sequenziamento singolo nucleo RNA (snRNA-Seq) è un approccio promettente che non comporta la dissociazione di cella stressanti e può essere utilizzato su difficile dissociare il tessuto (ad esempio il midollo spinale), come pure congelati tessuto. 4 , 17 , 18 , 19 adattato da precedenti metodi di isolamento di nuclei,20,21,22,23,25 snRNA-Seq in genere utilizza delle cellule e la rottura rapida dei tessuti Lisi sotto condizioni di freddo, centrifugazione e separazione dei nuclei da detriti cellulari. 4 nuclei possono essere isolati per il sequenziamento di nuova generazione a valle su piattaforme multiple di incapsulamento gocciolina microfluidica. 4 , 7 , 24 , 25 questo metodo permette un'istantanea dell'attività trascrizionale di migliaia di cellule in un momento nel tempo.
Ci sono strategie multiple per rilasciare i nuclei dalle cellule prima di isolamento e sequenziamento, ciascuno con i propri vantaggi e svantaggi. Qui, descriviamo e confrontare due protocolli per consentire l'isolamento dei nuclei dal midollo spinale adulto per il parallelismo massivo a valle snRNA-Seq: detergente-meccanica Lisi e Lisi ipotonica-meccanico. Detergente-meccanica Lisi fornisce la rottura completa del tessuto e una maggiore resa finale dei nuclei. Meccanica-Lisi ipotonica includono un livello controllabile di rottura del tessuto, fornendo un'opportunità per la selezione di un equilibrio tra la quantità e la purezza del rendimento nucleare finale. Questi approcci forniscono paragonabile rendimento del RNA, rilevati numeri di geni al nucleo e la cellula-tipo di profilatura e anche entrambi possono essere utilizzati con successo per snRNA-segg.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutto il lavoro animale è stato eseguito secondo un protocollo approvato dal Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo Animal Care e Comitato di uso. Bilanciato campioni di maschi e femminili topi wild-type ICR/CD-1, tra 8 e 12 settimane vecchio, sono stati utilizzati per tutti gli esperimenti. Topi devono essere manipolati conformemente alle linee guida istituzionali Animal Care e Comitato di uso locale.
1. preparazione dei materiali e buffer
- Preparare tutti i buffer il giorno di utilizzo e pre-chill sul ghiaccio (Vedi tabella 1).
- Se usando il detersivo-meccanica Lisi, preparare il tampone di lisi detergente (> 500 µ l per campione), tampone di saccarosio basso (> 6 mL per campione), tampone di saccarosio densità (> 12,5 mL per campione) e la soluzione di risospensione (> 1 mL).
- Se si utilizza Lisi ipotonica-meccanica, preparare il tampone di Lisi ipotonica (> 5 mL per campione), mezzo di EB (> 5 mL per campione), tampone di saccarosio basso (> 3 mL per campione), buffer di densità di saccarosio (> 12,5 mL per campione) e la soluzione di risospensione (> 1 mL).
- Aggiungere 25 μL di ditiotreitolo (DTT) a 25 mL di buffer di saccarosio basso e un altro 25 μL di DTT a 25 mL di buffer di gradienti di densità di saccarosio appena prima di iniziare il protocollo.
- Coprire la superficie per dissezione con foglio di alluminio per minimizzare la contaminazione del campione con fibre da carta assorbente o delle protezioni di banco, che possono ostruire i canali microfluidici utilizzate per acquisire i singoli nuclei.
- Con una soluzione di decontaminazione di RNasi, spray strumenti per dissezione e spazio sul banco. Inoltre, spruzzare all'interno del tubo di omogeneizzatore lisata (se si utilizza la lisi cellulare detergente-meccanico) e del tubo di Oak Ridge con una soluzione di decontaminazione di RNAsi. Sciacquare il tubo lisata e Oak Ridge con acqua ultrapura, RNAsi-libera.
- Pre-raffreddare tutte le provette per il prelievo (50 mL conica, Oak Ridge) e tubi omogeneizzatore lisata sul ghiaccio.
- Fuoco polacco una serie di pipette Pasteur (se utilizza Lisi ipotonica-meccanica delle cellule).
2. preparazione del midollo spinale
- Se si utilizza il tessuto fresco, eutanasia il mouse da inalazione di CO2 . A seguito di eutanasia, spruzzare il cappotto del mouse con etanolo al 70% per minimizzare la contaminazione di capelli nel campione.
- Decapita il mouse con forbici chirurgiche sharp, RNAsi-libera. Successivamente, si sollevano delicatamente addominale della pelle con il forcipe e fare un'incisione lungo la lunghezza del corpo per esporre gli organi interni.
- Eviscerate il mouse tirando gli organi interni dalla cavità del corpo usando il forcipe. Non usare asciugamani di carta per pulire la zona o per rimuovere gli organi come questo può introdurre contaminanti. Utilizzando le forbici, tagliare la colonna vertebrale tra le vertebre spinali, L2 e L3.
Nota: Con la pratica, questo passaggio può essere raggiunto in meno di 30 secondi.- Per espellere il midollo spinale, adatta una siringa da 3 mL contenenti PBS ghiacciata con un ago da 25 G ¼ di pollice. Posizionare la punta dell'ago nell'estremità sacrale della colonna vertebrale. Utilizzare due dita per pizzicare le vertebre per creare una guarnizione stretta intorno alla punta dell'ago e premere lo stantuffo per espellere il midollo spinale rostralmente. Luogo il midollo spinale in una capsula di Petri con PBS ghiacciata.
- A questo punto, congelare il tessuto e conservare a-80 ° C oppure utilizzare immediatamente per detergente-meccanico (passaggio 3) o lisi di ipotonico-meccanico (passaggio 4).
- Se utilizzando tessuto congelato, mantenere il tessuto sul ghiaccio secco, procedere al detergente-meccanico (passaggio 3) o ipotonica-meccanico (passaggio 4) lisi.
3. lisi delle cellule detersivo-meccanico
- Mettere il midollo spinale lombare in un omogeneizzatore lisata pre-refrigerato e aggiungere 500 mL pre-refrigerati buffer di lisi detergente.
Nota: Un mouse nel midollo spinale lombare è 325,5 mg ± mg 63,9 errore standard della media (SEM, N = 4). 50 mg – 1,5 g di tessuto può essere utilizzato con successo. - Lisata con 5 colpi di pestello (pestello 'sciolto'), quindi il 5-10 colpi di pestello B ('stretto' pestello). Evitare di sollevare l'omogeneizzatore fuori della soluzione di lisi tra colpi ed evitare di introdurre bolle.
- Posizionare un colino di 40 mm sopra un tubo conico pre-refrigerati da 50 mL e prewet con 1 mL di tampone basso saccarosio.
- Aggiungere 1 mL di tampone basso saccarosio per l'omogeneizzatore lisata contenente i nuclei grezzi nel buffer di lisi e mescolare delicatamente pipettando 2 – 3 volte.
- Passare la preparazione di nuclei grezza sopra il filtro di 40 mm nel tubo conico pre-refrigerati 50 mL.
- Passare un ulteriore 1 mL di tampone di saccarosio basso sopra il filtro di 40 mm, portando il volume finale a 3 mL di buffer di saccarosio basso e 500 mL di tampone di lisi.
- Ripetere i passaggi da 3.1 – 3.6 se combinando più cavi, pool nello stesso tubo conico.
- Centrifugare il campione a 3.200 x g per 10 min a 4 ° C. Una volta terminata la centrifugazione, decantare il supernatante. Procedere al passaggio 5.
4. lisi delle cellule ipotonico-meccanica
- Luogo il midollo spinale lombare in 5 mL di tampone di Lisi ipotonica in un piatto di coltura del tessuto. Utilizzare l'estremità smussata di forbici di primavera per bisecare il midollo spinale, quindi usare le forbici di primavera per il cavo tagliato a pezzi di 3 – 4 mm, ma non tritate.
Nota: 50 mg-1,5 g di tessuto può essere utilizzato con successo. - Incubare in ghiaccio per 15 min, 2 – 3 volte di turbine.
- Aggiungere 5 mL di mezzo di EB per diluire il tampone di Lisi ipotonica.
- Triturare il tessuto 10 volte con una pipetta sierologica di 5ml, o fino a quando tutti i pezzi del tessuto muoversi agevolmente attraverso l'apertura della pipetta.
- Triturare con una serie di tre pipette Pasteur lucidati a fuoco con diametri progressivamente più stretto (~ 900 – 600 mm).
- Per ogni pipetta, triturare 5 - 15 volte, permettono di tessuto per stabilirsi, rimuovere 1 – 2 mL di surnatante contenente nuclei dissociati e passare sopra un filtro di 40 mm in una provetta conica da mL 50 pre-refrigerati.
- Dopo la triturazione con la pipetta di Pasteur più piccolo di dimensioni, assicurarsi che l'omogeneizzato scorre senza intoppi attraverso la punta della pipetta. Passare la soluzione rimanente sopra il filtro di 40 mm nella provetta conica da 50 mL.
Nota: Il numero totale di triturazioni può essere registrato a piacere. Le meningi del midollo spinale del mouse resterà, ma è importante triturare qualsiasi blocchi visibili del midollo spinale. Passare il restante omogeneato sopra il filtro di 40 m. Evitare di introdurre bolle durante la triturazione.
- Centrifugare il campione filtrato a 1.000 x g per 10 min a 4 ° C. Una volta terminata la centrifugazione, decantare e scartare il surnatante. Procedere al passaggio 5.
5. omogeneizzazione e gradiente di densità di saccarosio
- Dopo il passaggio 3 o 4, risospendere il sedimento con 3 mL di tampone basso saccarosio. Agitare delicatamente per rimuovere il pellet dal muro per facilitare la risospensione. Lasciate che il campione sedersi sul ghiaccio per 2 min e trasferire la sospensione in una provetta di Oak Ridge.
- Utilizzando l'omogeneizzatore a impostazione 1, omogeneizzare i nuclei nel buffer di saccarosio bassa per 15 – 30 s, mantenendo il campione sul ghiaccio.
Nota: Utilizzare 15 s se utilizza un midollo spinale lombare o 30 s se utilizzando pool di campioni o un intero midollo spinale. - Utilizzando una pipetta sierologica, strato 12,5 mL di tampone di saccarosio di densità sotto omogeneato di buffer del saccarosio basso, avendo cura di non per creare una bolla che sconvolge gli strati di densità.
- Centrifugare le provette a 3.200 x g per 20 min a 4 ° C.
- Una volta terminata la centrifugazione, immediatamente decantare il supernatante in un movimento flicking.
Nota: Un volume residuo (meno di 400 mL) di tampone di saccarosio può essere scartato se si desidera produrre un volume più basso e pulitore del campione finale, ma questo volume residuo contengono nuclei e può essere conservato per massimizzare la resa di nuclei. - Utilizzando 100 mL - 1 mL di soluzione di risospensione, risospendere i nuclei restanti sulla parete. Evitare la mielina 'aggrottare le sopracciglia' che rimane con la preparazione a base di detergente.
- Filtrare i nuclei attraverso un colino di formato del poro di 30 – 35 mm e raccogliere in un tubo pre-refrigerato.
- Determinare i nuclei rendimento utilizzando un emocitometro per contare i nuclei sotto un obiettivo 10x.
Nota: Tripan blu possa essere aggiunti per visualizzare i nuclei, che dovrebbero apparire blu. Si noti la quantità di detriti cellulari. - Procedere al passaggio 6 o 7.
6. massively Parallel snRNA-Sequencing: piattaforma accademico7
- Eseguire il sequenziamento di parallelismo massivo snRNA (ad es., goccia-Seq) metodo descritto in precedenza7 con le seguenti modifiche:4
- Regolare i nuclei ad una concentrazione finale di 225 nuclei / mL.
- Preparare con codice a barre perline ad una concentrazione di 250 perline per mL.
- Preparare il tampone di lisi con 0,7% sarkosyl.
- Regolare le portate a 35 mL / min per perline, 35 mL / min per i nuclei e 200 mL / min per l'olio.
7. massicciamente parallelo snRNA-sequenziamento: piattaforma commerciale26
- Eseguire snRNA-sequenziamento massivamente parallelo utilizzando la piattaforma commerciale (ad es., soluzione di cromo Single Cell Gene Expression) prodotti secondo istruzioni26 con la seguente modifica del produttore:
- A seguito di d'inversione-trascrizione, aggiungere un ulteriore ciclo di PCR il numero calcolato di cicli per l'amplificazione del cDNA basata sul recupero cellulare mirata per compensare la diminuzione del cDNA da nuclei rispetto alle cellule.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Qui, abbiamo effettuato l'isolamento dei nuclei dal midollo spinale lombare topo adulto per sequenziamento di RNA massicciamente parallelo a valle. Il protocollo ha coinvolto tre componenti principali: tessuto rottura e cellular Lisi, omogeneizzazione e saccarosio centrifugazione di densità (Figura 1). In pochi secondi, la lisi di detersivo-meccanici ha reso una preparazione di nuclei grezzo con un gran numero di nuclei così come detriti cellulari e tissutali...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
L'obiettivo finale di questo protocollo è quello di isolare i nuclei contenente RNA di alta qualità per analisi trascrizionale a valle. Abbiamo adattato snRNA-Seq metodi al fine di profilo di tutti i tipi di cellule nel midollo spinale. Inizialmente, abbiamo trovato che metodi dissociazione tipici delle cellule erano inefficaci per la sequenziazione di singola cellula RNA, come neuroni del midollo spinale sono particolarmente vulnerabili alla morte delle cellule. Inoltre, metodi di dissociazione delle cellule inducono l'...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Non abbiamo conflitti di interesse a divulgare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal programma intramurale di NINDS (1 ZIA NS003153 02) e NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Ringraziamo L. Li e C.I. Dobrott per il loro supporto tecnico e discussioni utili e Kathe C. per la revisione del manoscritto.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Saccarosio | Invitrogen | 15503-022 | |
| 1 M HEPES (pH = 8.0) | Gibco | 15630-080 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| MgAc | Sigma Aldrich | M5661-50G | |
| 0.5 M EDTA (pH = 8.0) | Corning | MT-46034CI | |
| Ditiotreitolo (DTT) | Sigma Aldrich | 10197777001 | Aggiungere DTT appena prima dell'uso |
| Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Acqua priva di nucleasi | Crystalgen | 221-238-10 | |
| 1 M Tris-HCl (pH = 7,4) | Sigma Aldrich | T2194 | |
| 5 M NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
| 1 M MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Nonidet P40 | Sigma Aldrich | 74385 | |
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| Glutamax (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| B27 (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| 1x PBS | Crystalgen | 221-133-10 | |
| 0,04% BSA | New England Biolabs | B9000S | |
| 0,2 U/ μ L Inibitore dell'RNAsi | Lucigen | 30281-1 | |
| Oak Ridge Centrifuga Tubo | Thermo Scientific | 3118-0050 | |
| Monouso Cotone Tappo Borosilicato-Glass Pasteur Pipets | Fisher | Scientific 13-678-8B | |
| Tessuto di vetro Dounce (2 mL) | Kimble | 885303-002 | |
| Pestello in vetro di grande spazio | Kimble | 885301-0002 | |
| Pestello in vetro di piccola distanza | Kimble | 885302-002 | |
| T 10 Omogeneizzatore Basic Ultra Turrax | IKA | 3737001 | |
| Strumento di dispersione (S 10 N – 5G) | IKA | 3304000 | |
| Trypan Blue Stain (0,4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 40 μ filtro per celle m | Falcon | 352340 | |
| MACS SmartStrainers, 30 μ m | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Provette coniche | Denville Scientific | 1000799 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuga | Thermo Fisher Scientific | 75004505 | |
| Fiberlite F15-6 x 100y Rotore ad angolo fisso | Thermo Fisher Scientific | 75003698 | |
| Pipette stereologiche: 5 mL, 10 mL | Denville Scientific | P7127 | |
| Emocitometro | Daigger Scientific EF16034F | ||
| Chemgenes Barcoding Beads | Chemgenes | Macosko-2011-10 | |
| RNaseZap Soluzione di decontaminazione RNasi | Invitrogen | AM9780 | |
| Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μ m) | Corning | 352235 | |
| Selezionatore cellulare MoFlo Astrios | Beckman Coulter | B25982 | |
| Kit multiplex di cromo i7, 96 rxns | 10X Genomics | 120262 | |
| Cromo a cellula singola 3' Kit di librerie e perline di gel v2, 4 rxns | 10X Genomics | 120267 | |
| Kit di chip A a singola cellula di cromo, 16 rxns | 10X Genomics Piastra per coltura tissutale | ||
| (60 mm x 15 mm) | Corning | 353002 |
Riferimenti
- Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).
- Hu, P., et al. Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq. Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).
- Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
- Sathyamurthy, A., et al. Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior. Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).
- Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).
- Campbell, J. N., et al. A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types. Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity. Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
- Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26 (8), 967(2016).
- Shin, J., et al. Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).
- Villani, A. C., et al. Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors. Science. 356 (6335), (2017).
- Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).
- Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7, 11022(2016).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).
- Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
- Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
- Halder, R., et al. DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory. Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- 10X Genomics. Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing (2018).
- 10X Genomics. Single Cell 3' Reagent Kits v2 User Guide. , (2018).
- Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord. Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).
- Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 6031(2017).
- Bakken, T. E. Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing. bioRxiv. , (2018).
- Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing
Posted by JoVE Editors on 11/20/2018. Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. The Protocol section was updated.
Step 3.1 was updated from:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.
to:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 μL pre-chilled detergent lysis buffer.
Step 3.6 was updated from:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.
to:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 μL of the lysis buffer.
Step 5.5 was updated from:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
to:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 μL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
Step 5.6 was updated from:
Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.
to:
Using 100 μL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.
Steps 6.1.1 - 6.1.4 were updated from:
- Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.
- Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.
- Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
- Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.
to:
- Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per μL.
- Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per μL.
- Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
- Adjust the flow rates to 35 μL per min for beads, 35 μL per min for nuclei, and 200 μL per min for oil.
