Qui presentiamo un protocollo per lo sviluppo di un sistema inducibile dominante-negativo, in cui tutta la proteina può essere inattivata in modo condizionale reversibilmente overexpressing una versione mutante dominante-negativo di esso.
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Articolo metodologico
Inibizione della proteina viscoelastica e reversibile dominante-negativo (DN)
In questo articolo
Sommario
Abstract
Inibizione della proteina di dominante-negativo (DN) è un metodo potente per manipolare la funzione della proteina e offre parecchi vantaggi sopra altri approcci basati sul genoma. Ad esempio, sebbene chimerici e Cre-LoxP strategie di targeting sono stati ampiamente utilizzate, le limitazioni intrinseche di queste strategie (cioè, l'attività del promotore che perde, espressione di Cre mosaico, ecc.) sono significativamente limitati loro applicazione. Inoltre, un'omissione completa di molti geni endogeni è embrionalmente letale, rendendo impossibile per studiare la funzione del gene nella vita postnatale. Per affrontare queste sfide, abbiamo apportato modifiche significative a un protocollo iniziale di ingegneria genetica e combinato una versione breve (transgenica) del gene Rb1 con una proteasi lisosomica procathepsin B (CB), per generare un modello murino di DN di Rb1 (CBRb). A causa della presenza di una proteasi lisosomiale, la proteina di fusione CB-RB1 intera e il suo complesso interagente vengono instradati per degradazione proteasome-mediata. Inoltre, la presenza di un elemento di induttore (rtTA) tetraciclina nel costrutto transgenico consente una regolazione viscoelastica e reversibile della proteina RB1. La presenza di un promotore di ROSA-CAG onnipresente nel modello del topo CBRb lo rende uno strumento utile per eseguire l'ablazione gene Rb1 transitorio e reversibile e fornire ai ricercatori una risorsa per comprendere la sua attività in praticamente qualsiasi tipo di cellula dove RB1 è espresso.
Introduzione
Maggior parte degli approcci puntando le ablazioni di gene e la proteina si basano su processi permanenti, che generalmente conducono alla completa eliminazione o troncamento del gene, sequenze di RNA o proteine di interesse (PDI). L'obiettivo generale di questo metodo è quello di progettare una proteina ricombinante per abolire la funzione della proteina endogena, selvaggio-tipo. Abbiamo rivisitato e rinnovato una strategia alternativa1,2, che permette per l'ablazione temporanea di un PDI tramite inibizione di DN. Questo metodo funziona per multimerici e peptidi monomerici ma è più adatto per proteine che fun....
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Protocollo
Generazione di esperimenti associati con lo studio e cura degli animali il topo transgenico CBRb e tutti sono stati approvati dalla Creighton University istituzionale animale cura ed uso Committee (IACUC) ed eseguita dai loro orientamenti.
1. transgenici CB-Myc6-Rb1 costrutto
Nota: La clonazione del CBRb in un vettore di pTet_Splice è stato fatto in un processo a più fasi (Figura 1A e 1B).
-
Eseguire la prima fase di clonazione nel pCS2 + CB-Myc6 vettoriale.
- Per creare il CBRb transgene costrutto, amplif....
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Risultati
In genere, una mutazione di DN la progettazione richiede una notevole quantità di informazioni sulla struttura e funzione del PDI. Al contrario, la strategia di DN presentata qui è particolarmente utile quando le informazioni strutturali e funzionali per il PDI sono limitate. Se il PDI è una proteina multimerica, una fusione di una subunità di una proteasi lisosomica dominante può inibire il multimer assemblato e, potenzialmente, altri ligandi attraverso una combinazione di proteolisi del.......
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Discussione
Per aggirare le limitazioni associate tradizionali strategie transgeniche, abbiamo cercato di generare un modello di topo in cui un PDI endogeno può essere inattivato in modo condizionale overexpressing una forma mutante di DN di esso in maniera spatiotemporal. Per abolire la funzione di PDI endogeni, diverse opzioni sono state proposte15,16,17. Abbiamo modificato un precedente strategia genetica1 combina.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Il pCS2 + CB-Myc6 vettore era un regalo da Marshall Horwitz (Università di Washington, Seattle, WA, USA). Le cellule di HEI-OC1 sono state gentilmente concesse da Fedrico Kalinec (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, CA, USA). Supporto tecnico è stato fornito dal genoma di Mouse UNMC Core Engineering (C.B. Gurumurthy, Don Harms, Rolen Quadros) e la Creighton University Integrated Biomedical Imaging Facility (Richard Hallworth, John Billheimer). La UNMC Mouse Genome ingegneria è stata sostenuta da un premio per lo sviluppo istituzionale (IDea) da NIH/NIGMS, concedere numero P20 GM103471. L'Integrated Facility di Imaging biomedico è stato sostenuto dalla ....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM | GIBCO-BRL | 11965-084 | |
| Minimum Essential Medium Eagle, MEME | Sigma | M8042 | |
| Siero fetale bovino | Sigma | F2442 | |
| Lipofectamina | DharmaFECT | T-2010-03 | |
| Sal I | Roche | 11745622 | |
| EcoRV-HF | New England BioLabs | R3195S | |
| NotI | Roche | 13090730 | |
| CaspaTag | Millipore | APT523 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Staurosporina | Sigma | S4400 | |
| CyQuant NF | Invitrogen | C35007 | |
| Retinoblastoma 1 anticorpo | Abcam | Ab6075 | |
| c-Myc anticorpo | Sigma | M5546 | |
| b-actina | Sigma | A5316 | |
| Ki-67 | Thermofisher scientific | MA5-14520 | |
| Fallodina | Thermofisher scientific | A12379 | |
| Lettore di micropiastre a fluorescenza | FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech | ||
| Microscopio a epifluorescenza | NikonEclipse80i | ||
| La linea di mouse TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) è disponibile presso il Jackson Laboratory come JAX#032011. |
Riferimenti
- Li, F. Q., et al. Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease. Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).
- Tarang, S., et al.
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Ristampe e permessi
