Qui, un protocollo per l'isolamento e la caratterizzazione di CD4+ cellula T sottoinsiemi da sangue periferico umano è descritto. Purificato CD4+ T-cellule sono analizzate tramite flusso cytometry per determinare le proporzioni dei sottoinsiemi delle cellule helper T-follicolare.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Isolamento di CD4+ T-cellule e analisi della circolazione follicolare T Helper (cTfh) sottoinsiemi di cellule da sangue periferico mediante citometria a flusso di 6 colori
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'attività cellulare aberrante T-follicolare helper (Tfh) è rilevabile nelle patologie autoimmuni e la loro presenza è associata con i risultati clinici quando viene analizzato il microambiente di linfonodo nel linfoma non-Hodgkin della B-cellula. Sottoinsiemi di fare circolare le cellule helper T-follicolare (cTfh), il vano memoria circolanti di Tfh cellule nel sangue, sono anche turbati nella malattia e pertanto rappresentano potenziali nuovi biomarcatori predittivi. Test basati su sangue periferico è vantaggioso perché è relativamente non-invasiva e permette il semplice monitoraggio seriale. Questo articolo viene descritto un metodo per isolare i CD4+ T-cellule da sangue umano e un'ulteriore analisi di citometria a flusso per enumerare le cellule cTfh e le proporzioni dei loro vari sottoinsiemi (cTfhPD-1-/ + / Ciao, cTfh1, 2, 17 e 17/cTfh1). Il livello di questi sottoinsiemi è stato poi confrontato tra soggetti normali e pazienti con linfoma. Abbiamo trovato che il metodo era abbastanza robusto per ottenere risultati affidabili da materiale paziente ordinariamente raccolto. La tecnica che descriviamo per l'analisi può essere facilmente adattata a ordinamento delle cellule e applicazioni a valle come RT-PCR.
Introduzione
Le cellule helper T-follicolari (Tfh) sono un CD4+ subset di cellule T che inizialmente è stato caratterizzato in tessuti linfoidi1. Queste cellule esprimono PD-1 e i ricevitori di superficie di CXCR5, secernono IL 21 e IL-4 e mostrano l'espressione nucleare di fattore di trascrizione, BCL-62,3. Come suggerisce il nome, si trovano in centri germinali e sono essenziali per la produzione di alta affinità dell'anticorpo1.
Le risposte Dysregulated Tfh sono state implicate nella patogenesi della malattia, in particolare malattia ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
I campioni di sangue sono stati ottenuti da soggetti normali (NS) (n = 12) così come i pazienti con linfoma della zona marginale (MZL) (n = 7) e altri tipi di linfoma non-Hodgkin della B-cellula (BNHL) (FL 6 pazienti, 2 pazienti affetti da linfoma lymphoplasmacytic e della B-cellula di qualità inferiore 1 linfoma non-Hodgkin non altrimenti specificato paziente). I pazienti sono stati reclutati dalle cliniche di Ematologia presso Leicester Royal Infirmary, dopo aver dato informato, consenso scritto, con approvazione etica in luogo per tutti gli studi. Approvazione etica è stata ottenuta da Leicestershire, Northamptonshire e Rutland ricerca etica Comitato 1, riferimento....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Alta CD4+ purezza è stato raggiunto utilizzando il CD4+ protocollo di isolamento, che era affidabile attraverso tutti i campioni di sangue da noi testato (significa: 96,6%, SD: 2,38, n = 31) (Figura 3).
Identificazione di cTfh (CD4+ CXCR5+ cellule) in un soggetto normale rappresentativo è presentato (Figura 4A.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Questo protocollo rappresenta un modo semplice ed efficace per analizzare cTfh cellule di sangue periferico, che permette la rilevazione di tutti i sottoinsiemi rilevanti identificati nella letteratura finora. I campioni di sangue possono essere facilmente ed efficientemente ottenuti come parte di ambulatori standard e campioni di serie possa essere raccolti in parallelo con i dati clinici. A sua volta, in questo modo gli studi prospettivi valutando cTfh sottoinsiemi come biomarcatori per la progressione di malattia o di.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Il lavoro è stato supportato da una sovvenzione leucemia UK ETB e MJA.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| RosetteSep Cocktail di arricchimento di cellule T CD4+ umane | STEMCELL TECHNOLOGIES | 15062 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | 17144003 | |
| BUV395 Topo Anti-Umano CD183 Clone 1C6/CXCR3 | BD Horizon | 565223 | |
| BV711 Topo Anti-Umano CD196 (CCR6) Clone 11A9 | BD Horizon | 563923 | |
| BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2 | BD Horizon | 562747 | |
| BB515 Topo Anti-Umano CD4 Clonare RPA-T4 | BD Horizon | 564419 | |
| PE Topo Anti-Umano CD279 Clone MIH4 | BD Pharmingen | 557946 | |
| APC-H7 Topo Anti-Umano CD45RA Clone HI100 | BD Pharmingen | 560674 | |
| Kit di colorazione per cellule morte rosse lontane fissabile/LIVE/DEAD, per eccitazione a 633 o 635 nm | ThermoFisher Scientific | L34973 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | |
| Set di particelle di compensazione Ig, κ/controllo negativo | CompBead | 552843 | |
| FACS Citometro a flusso Aria II | BD Biosciences | 644832 | |
| FACSDiva 6.1.3 | BD Biosciences | 643629 | acquisizione citometro a flusso |
| FlowJo 10.2 | Treestar Inc. | Software di analisi dei dati per citometria a flusso | |
| Anticorpo anti-CXCR3 | BD Horizon | ||
| Anticorpo anti-CCR6 | BD Horizon | ||
| Anticorpo anti-CXCR5 | BD Horizon | ||
| Anticorpo anti-CD4 | BD Horizon | ||
| Anticorpo anti-PD-1 | BD Pharmingen | ||
| Anticorpo anti-CD45RA | BD Pharmingen | ||
| Marcatore di vitalità | ThermoFisher Scientific | L34973 |
Riferimenti
- Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., MacLennan, I. C. M. Follicular Helper T Cells. Annual Review of Immunology. 34 (1), 335-368 (2016).
- Nurieva, R. I., et al. Bcl6 Mediates the Development of T Follicular Helper Cells. Science. 325 (5943), New York, N.Y. 1001-1005 (2009). <....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
