Articolo metodologico

Generazione di colture del tessuto polmonare umano 3D (3D-LTC) per la modellazione di malattia

21.7K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/58437

⸱

12 febbraio 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Comprehensive Pneumology Center, Ludwig-Maximilians-Universität and Helmholtz Zentrum Munich, 2German Center of Lung Research (DZL), 3Translational Lung Research and CPC-M bioArchive, Helmholtz Zentrum München, Comprehensive Pneumology Center Munich DZL/CPC-M, 4Department of Experimental Medical Science, Lung Bioengineering and Regeneration, Lund University, 5Wallenberg Center for Molecular Medicine, Lund University, 6Stem Cell Centre, Lund University, 7Asklepios Fachkliniken Munich-Gauting, 8Department of Medicine, Division of Pulmonary Sciences and Critical Care Medicine, University of Colorado

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per la preparazione di fette di agarosio-riempito umano del polmone di taglio di precisione da tessuto resecato del paziente che sono adatti per la generazione di colture di tessuti del polmone 3D per malattie polmonari umane modello negli studi biologici e biomedici.

Abstract

Traduzione del romanzo scoperte alla malattia umana è limitata dalla disponibilità di modelli basati su tessuto umani della malattia. Fette di taglio di precisione del polmone (tributo) utilizzati come colture del tessuto polmonare 3D (3D-LTC) rappresentano un elegante e modello della coltura cellulare 3D biologicamente molto rilevante, che assomigliano a altamente in situ tessuto a causa della loro complessità, biomeccanica e molecolari composizione. Affettare del tessuto è ampiamente applicata in vari modelli animali. 3D-LTC derivato dal tributo umano può essere utilizzato per analizzare le risposte a nuovi farmaci, che potrebbero ulteriormente aiutare a comprendere meglio i meccanismi e gli effetti funzionali delle droghe nel tessuto umano. La preparazione del tributo da campioni di tessuto chirurgicamente resecata del polmone di pazienti, che hanno avvertito la lobectomia polmonare, aumenta l'accessibilità di malati e tessuto peritumorale. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la generazione di tributo umano dal tessuto chirurgicamente resecato elastico morbido paziente polmonare. Dell'agarosi è stato introdotto nello spazio broncoalveolare di resectates, così conservando la struttura del polmone e aumentando la rigidità del tessuto, che è cruciale per affettare successive. 500 µm spessore fette sono state preparate dal blocco di tessuto con un vibratomo. Pugni di biopsia prelevati da tributo garantiscono paragonabile tessuto dimensioni del campione e aumentano ulteriormente la quantità di campioni di tessuto. Le colture di tessuto polmonare generato può essere applicate in una varietà di studi di biologia del polmone umano, tra cui la patofisiologia e meccanismi di diverse malattie, quali processi fibrotici ai suoi livelli cellulari migliori alle (sub-). Il vantaggio più alto del 3D-LTC ex vivo modello è la sua rappresentazione stretta del polmone umano in loco per quanto riguarda l'architettura del tessuto 3D, diversità del tipo di cellula e anatomia del polmone, nonché il potenziale per la valutazione del tessuto da singoli pazienti, che è rilevante per sviluppare nuove strategie per la medicina di precisione.

Introduzione

Malattie polmonari acute e croniche sono una causa importante di morbilità e mortalità in tutto il mondo1. Per i pazienti con malattie polmonari croniche come broncopneumopatia ostruttiva (BPCO)2, asma grave3, polmone cancro4 e diffusa del parenchima polmonare malattie5, terapie curative non sono attualmente disponibili. Sebbene studi in modelli animali di malattie polmonari hanno approfondito la comprensione della malattia pathomechanisms6 ed hanno portato all'identificazione di potenziali nuovi bersagli terapeutici7,8,9, questi modelli presentano rilevanti differenze biologiche e fisiologiche rispetto per gli esseri umani10. Per superare queste discrepanze fra biologia murina ed umana così come anatomia, umano ex vivo 3D polmonare coltura tissutale (3D-LTC) sistemi sono utilizzati in vari settori della ricerca biomedica. Questi sistemi di coltura di 3D-LTC si basano sulle fette di taglio di precisione del polmone (tributo). La generazione di tributo ex vivo permette l'analisi di una terza dimensionalità spaziale, che consente per l'indagine dei rapporti spaziali e funzionali delle cellule in intero alveoli e airways11, come pure l'interstizio, sistema vascolare e mesotelio. In particolare, tributo modelli ex vivo è pluricellulari, che significa che essi contengono cellule più funzionale dei polmoni in situ, così strettamente che rappresenta nativo ambiente biologico delle cellule e superando così il limitato cellula-cellula e interazione cellula-matrice in maggior parte 2D si avvicina la coltura delle cellule. Fino ad ora, ex vivo murino tributo sono stati utilizzati per modellare le malattie polmonari, come BPCO12, di fibrosi polmonare13, polmone cancro14, infezione virale15,16, di displasia broncopolmonare17, e asma18. Tuttavia, una parte considerevole delle terapie farmacologiche romanzo nelle malattie polmonari umane che sono state studiate in studi clinici non si traducono in clinica a causa della loro mancanza di efficacia o di sicurezza, assumingly a causa ancora notevoli differenze tra uomo e murino biologia e malattia19,20,21.

In parecchi anni, tributo umano è stati in gran parte utilizzati per valutare la tossicità polmonare di sostanze chimiche e farmaci. Solo recentemente, tessuto polmonare umano è stato utilizzato dai pazienti con COPD22,23, asma24e di fibrosi polmonare25, a perseguire studi fisiopatologici e farmacologici. Utilizzando materiale resecato organo paziente e generazione di tributo, uno può ricapitolare le caratteristiche importanti della malattia in un complesso tessuto 3D ambiente22 che rappresenta e mantenendo la maggior parte della diversità cellulare nativa dell'organo. Inoltre, il tessuto malato applicato in una varietà di configurazioni sperimentali è stato indicato per imitare la malattia-come i cambiamenti nel fegato, intestino e reni26,27,28,29.

Tuttavia, l'elaborazione del tessuto polmonare rimane impegnativo per diversi motivi. A differenza di tessuto solido, parenchima polmonare nativo tende a comprimere senza ventilazione ed esibisce inferiore rigidità dei tessuti. Queste proprietà ostacolano l'affettamento del tessuto. Così, riempimento delle vie aeree e lo spazio alveolare con basso punto di fusione dell'agarosi punto conserva la struttura del polmone nativo e fornisce la rigidità necessaria per taglio di precisione affettare di polmoni murine ed umane30. Resectates di polmone umano donato per scopi di ricerca sono per loro natura anatomicamente, geneticamente e fisiologicamente altamente diversificata, così spesso che presenta un'alta variabilità inter-paziente durante l'esecuzione di esperimenti25. In contrasto con l'intero lobo o espianti intero polmone, campioni del polmone resecati mediante chirurgia toracica non necessariamente seguire i segmenti anatomici e, pertanto, richiedono una preparazione speciale. In questo articolo, forniamo un protocollo dettagliato e ottimizzato per la generazione di tributo umano dal tessuto polmonare resecato e loro successiva coltivazione e uso sperimentale all'affezione polmonare di modello.

Protocollo

L'uso di tessuti umani è stato approvato dal comitato etico dell'Università Ludwig-Maximilian [Monaco di Baviera, Germania (progetto numero 455-12)]. Le resezioni polmonari umane senza tumore sono state fornite dall'Asklepios Biobank per malattie polmonari (numero di progetto Gauting, Germania, 333-10).

Nota: Tutte le procedure di produzione umana di tributo (Figura 1) sono fatte sotto cappa a flusso laminare sterile.

1. preparazione di strumenti e materiali

  1. Preparare tutti i materiali per l'inflazione del tessuto polmonare con agarosio come descritto di seguito.
    1. Preparare il medium di coltivazione: per volta Eagle Medium (DMEM) F-12 di Dulbecco completata con L-Glutammina, HEPES, 10.000 IE penicillina, 10.000 IE streptomicina e siero bovino fetale di 0.1% (v/v).
      Nota: Mezzo è usato a 37 ° C.
    2. Preparare un vassoio sterile coperto con la carta velina. Posizionare una piastra di coltura sterile cm 15 cella sul vassoio.
    3. Riempire il piatto di cultura cellulare con 15 mL di medium di coltivazione.
    4. Preparare una soluzione di agarosio 3% (p/v) sciogliendo la quantità appropriata di agarosio di punto basso punto di fusione in un minimo di 30 mL di medium di coltivazione.
    5. Riscaldare la soluzione in un forno a microonde fino a ebollizione. Raffreddare la soluzione di agarosio a 42 ° C in un bagno d'acqua. Tenere la soluzione di agarosio liquido memorizzata nel bagno d'acqua.
    6. Preparare diverse provette coniche da 50 mL riempite con il liquido dell'agarosi.

2. tessuto polmonare resecato

  1. Archivio fresco tumore polmone libero tessuto di lobectomia resectates immediatamente dopo resezione in DMEM F-12 medio a 4 ° C fino al passaggio 3.
  2. Non superare il tempo di ischemia fredda di 4-8 h prima della lavorazione.

3. controllo e selezione del tessuto resecato prima del riempimento dell'agarosi

  1. Sollevare il tessuto dal mezzo con le pinzette. Al fine di evitare danni al tessuto, specialmente alla pleura, gestire il tessuto con le pinzette alle vie aeree solo.
  2. Punteggio ottenuto la qualità di tessuto dai criteri del polmone dell'agarosi riempimento punteggio definito nella tabella 1.
  3. Se la qualità del tessuto è segnata sopra o uguale a 72, procedere al passaggio 4. Se la qualità del tessuto è segnata sotto i 60, non continuare ulteriormente con riempimento dell'agarosi.
    Nota: Se il punteggio del tessuto è tra 60 e 68, l'agarosio-riempimento e tessuto affettare ancora potrebbe produrre risultati ragionevoli, e una decisione definitiva per il prolungamento dell'esperimento deve essere effettuata caso per caso. Tuttavia, tessuto polmonare che non soddisfano i requisiti di cui sopra, non riesce per lo più nell'agarosi di riempimento.

4. polmone tessuto inflazione riempiendolo di agarosio

  1. Sollevare il tessuto dal supporto di memorizzazione e drenare il terreno in eccesso dal tessuto. Trasferire il tessuto polmonare nella piastra di coltura di 15cm preparato al punto 1.1.2.
  2. Riempire una siringa da 30 mL con l'agarosi di punto basso punto di fusione da 1.1.3.
  3. Preparare un catetere venoso periferico rimuovendo l'otturatore e associarlo a una siringa da 30 mL
  4. Identificare un Bronco (0,5-3 mm di diametro) nel tessuto che è una sezione intatta del tessuto di ventilazione (vedere la Figura 2).
  5. Inserire la cannula nel Bronco selezionato (0,5-3 mm di diametro).
  6. Spingere delicatamente la cannula delicatamente in avanti per quanto possibile.
  7. Sigillare il Bronco intorno la cannula comprimendo la parete bronchiale intorno la cannula con il forcipe, idealmente bloccaggio qualsiasi arteria polmonare adiacente allo stesso tempo.
  8. Occludere gli altri ulteriori vie aeree con una pinza chirurgica per prevenire agarosio che perdeva attraverso queste vie aeree.
  9. Sollevare il tessuto con le pinze dalla piastra di coltura.
  10. Manualmente versare agarosio con la siringa non più veloce di 0,3 mL/s. La velocità di riempimento dell'agarosi potrebbe variare tra circa 0,05 e 0,3 mL/s a causa della resistenza eterogenea delle vie aeree e/o atelectasia.
  11. Se alta resistenza durante il riempimento o fuoriuscita dal tessuto dell'agarosi è osservato, ripetere l'intera procedura con un bronco diverso dal punto 4.4. Eseguire risoluzione dei problemi come descritto di seguito.
    Nota: Il grado di riempimento dell'agarosi dipende fortemente la posizione del catetere nel tessuto e penetrazione profonda dei risultati del catetere nel riempimento di agarosio di piccolo cono come regioni (*) del tessuto polmonare (Figura 2).
    1. In caso di elevata resistenza, prova di posizionamento del catetere conduce ad corretto riempimento della maggior parte delle regioni del tessuto (#) (Figura 2D).
    2. Come le spine dei primo agarosio solidificato in bronchi prossimali o altre vie respiratorie ostruzioni (freccia) possono portare a un riempimento incompleto del tessuto (Figura 2E), non forzare l'agarosio riempimento come questo potrebbe portare a difetti in area riempita, ma non in un ripieno di le parti di tessuto ostruito.
    3. Se l'albero respiratorio derivato dal Bronco cannulato viene danneggiato durante la resezione e l'agarosio riempimento risultati in una costante fuoriuscita di liquido agarosio (freccia in Figura 2F), inserire il catetere in una parte più periferica del sistema delle vie respiratorie per riempire almeno una piccola parte del tessuto (*) (Figura 2). Inoltre, sigillare le vie aeree periferiche danneggiate con una pinza chirurgica (freccia) (Figura 2 H).
  12. Applicare dell'agarosi fino a riempita completamente il tessuto polmonare. Non gonfiare eccessivamente il tessuto come ciò potrebbe causare danni irreversibili alla struttura del tessuto e delle sue celle.
  13. Morsetto del Bronco che è stato utilizzato per il riempimento immediatamente. Rimuovere la cannula prima del bloccaggio.
  14. Incubare il tessuto in terreno di coltura a 4 ° C per 30 min garantire solidificazione dell'agarosi.
  15. Se il tessuto resecato ha più voci bronchiale, ripetere il passaggio 4.2 a 4,13 fino a quando tutte le parti del tessuto sono pieni di agarosio.
  16. Archiviare le sezioni di tessuto polmonare di agarosio riempito a 4 ° C fluido freddo fino ad affettare.

5. taglio di precisione del polmone affettare

  1. Identificare le aree nel tessuto polmonare che sono solidamente pieni di agarosio. Solidamente campiture non crollerà quando vengono pressate delicatamente con una pinzetta contro il fondo della piastra di coltura delle cellule.
    1. Accise, un blocco di3 : 1-1,5 cm di regioni descritto in 5.1, mentre un lato dovrebbe ancora essere ricoperta di pleura.
  2. Collegare ogni blocco individuale del tessuto con il lato pleurico contattando il titolare del vibratome utilizzando una colla del cianoacrilato.
    Nota: La pleura è leggermente elastica e pertanto impedisce il taglio con la lama del vibratome. Posto sotto la custodia di tessuto, la pleura non interferirà con il taglio e, soprattutto, forma una barriera naturale tra la colla del cianoacrilato e parenchima del tessuto, permettendo per minima diffusione della colla.
  3. Tagliare il tessuto polmonare con il vibratome con le seguenti impostazioni: spessore: 500 µm, frequenza: 100 Hz, ampiezza del coltello: 1,2 mm, velocità di avanzamento della lama di 3-12 µm/s, che dipende dalla rigidità dei tessuti. Ridurre la velocità di sporgenza della lama se la fetta non è tagliata correttamente, o se il blocco di tessuto stesso inizia a vibrare.
  4. Trasferire delicatamente la fetta sollevandola con forcipe dal vassoio del vibratome in un pozzetto di una piastra 12-pozzetti riempito con medium di coltivazione. Infine, incubare le fette di polmone in un'incubatrice in condizioni di coltura cellulare standard.
  5. Fermata affettare quando 2-3 mm del blocco del tessuto sono lasciati unsliced poiché la colla del cianoacrilato può aver compromesso l'integrità del tessuto di questa regione.

6. generazione di tributo pugni

  1. Trasferire le fettine di polmone da un singolo pozzo un piatto vuoto 10 cm.
  2. Posizionare un perforatore di biopsia 4 mm ortogonalmente alla superficie superiore di un tributo e iniziare a muoversi il puncher in rotazioni in senso orario e in senso antiorario.
  3. Riempire mezzo di coltura cellulare nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Sollevare i pugni di tessuto con il forcipe e trasferire i pugni nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Infine, incubare i pugni di polmone sommersi nel terreno preparato a 1.1.1. in un'incubatrice di coltura cellulare in condizioni standard (ossigeno di 21% (v/v), 5% (v/v) di biossido di carbonio e 95% di umidità, a 37 ° C).

7. coltura tissutale e la raccolta del campione

  1. Cultura il tributo e pugni durante la notte in un'incubatrice in condizioni di coltura cellulare standard.
  2. Cultura tributo e pugni nella circostanza descritta per un massimo di 120 ore dopo la loro generazione per garantire funzionalità e della vitalità cellulare.
  3. Per la raccolta della proteina così come RNA, lavare tributo e punzoni tre volte in tampone fosfato salino (PBS), trasferirli in cryovials e snap-congelamento in azoto liquido.
  4. Il surnatante medio campione di tributo coltivate punzoni per l'analisi di proteine secrete.
    1. Per le analisi istologiche, lavate il tributo e punzoni tre volte con PBS e fissarle con paraformaldeide al 4% incubando per 30 min a 37 ° C. Infine, conservare il tributo in PBS a 4 ° C per la macchiatura più ulteriormente a valle.

Risultati

Generazione di tributo
La generazione del tributo può essere suddivisa in quattro fasi essenziali: la resezione chirurgica del polmone del tessuto, riempimento di agarosio, basati su vibratome tributo generazione e cultura del tributo. Il tessuto polmonare resecato è riempito con basso punto di fusione punto agarosio, che aggiunge la necessaria rigidità al tessuto polmonare per affettare e conserva la struttura originaria del polmone e l'architettura. Della nota, generazione di tributo è altamente in termini di tempo, così spesso deposito notturno del tessuto polmonare riempito in DMEM F-12 medie possa essere inclusa come un ulteriore passaggio e generazione di tributo è iniziato il giorno successivo. A seconda il seguente setup sperimentale, tributo generati possa essere incubati durante la notte in cella standard mezzo di coltura contenente siero bovino fetale di 0,1% (p/v), prima che vengano applicate condizioni sperimentali. 3D-LTC erano vitali ed hanno esibito la funzionalità cellulare (ad esempio di secrezione della proteina di tensioattivo) per fino a 120 h22 in condizioni di coltura descritte in questo protocollo (Figura 1) e potrebbe essere ottimizzato all'ulteriore miglioramento della stessa.

Riempimento dell'agarosi
Per il riempimento dell'agarosi del tessuto, una cannula di un catetere venoso periferico con un diametro di 1,3 mm collegato alla siringa agarosio è stata inserita in un bronco sulla superficie del tessuto taglio (Figura 2A). Bronchi sono spesso localizzati nei pressi di un'arteria polmonare. Mentre le arterie hanno pareti più sottili e tendono a comprimere, bronchi ha esibito un buon lume visibile. A seconda dell'integrità del tessuto, il catetere può essere avanzato attraverso diverse generazioni dell'albero respiratorio nella periferia del polmone. Il Bronco penetrato era sigillato intorno la cannula utilizzando pinzette (Figura 2B). L'arteria polmonare possono essere fissato con le pinzette, allo stesso tempo. In seguito, il tessuto viene sollevato e liquido dell'agarosi sono dolcemente instillato nelle vie respiratorie.

A seconda della posizione del catetere, una maggioranza del tessuto può essere riempita con liquido agarosio (Figura 2D). Facoltativamente, cono come alcune parti del tessuto polmonare, che riflettono il parenchima del polmone ventilato da Bronco penetrato, potrebbe avere riempito con l'agarosio (Figura 2). In entrambi gli scenari, può essere osservato un modello caratteristico delle regioni solidamente riempito di tessuto: in primo luogo, una parte importante del tessuto è riempita a spicchi (Figura 2D), o in secondo luogo, più piccolo sporgente tondo aree di accuratamente tessuto riempito regioni appaiono ( Figura 2). Qualora parti delle vie aeree ostacolano a causa di coaguli di agarosio o altre cause, parti del tessuto potrebbero non essere correttamente riempiti con agarosio. Così, solo le parti del tessuto potrebbero essere applicabile per affettare. In caso di perdite durante la procedura di riempimento di agarosio, parti dell'albero respiratorio pieno potrebbero ottenere perforati e riempimento del tessuto polmonare diventa quasi impossibile, tuttavia, possibili soluzioni includono il riempimento tramite un bronco più periferico, una più profonda penetrazione della cannula nelle vie aeree distali (Figura 2), o di bloccaggio potenziale della zona di dispersione (Figura 2 H).

Taglio di precisione del polmone affettare
Blocchi a una lunghezza e una larghezza di 1-1,5 cm di tessuto sono stati asportati da regioni di tessuto, che erano completamente pieni di agarosio solidificato (Figura 3A-3B). Successivamente, i blocchi di tessuto sono stati incollati sul supporto del tessuto del vibratome (Figura 3). 500 µm spessore tributo sono stati generati, considerando che il blocco di tessuto del vibratome stava avanzando in avanti con velocità tra 3-12 µm/s. (Figura 3D-3F). Infine, il tributo era immersi in mezzo di coltura cellulare contenente siero bovino fetale di 0,1% (p/v) e coltivate in condizioni di coltura cellulare standard, come delineato passaggio 7.

Letture sperimentali di umano 3D-LTC dopo 48h di coltura
Una colorazione di immunofluorescenza rappresentativo, come precedentemente descritto da Alsafadi et al.25, è mostrata nella Figura 4A-4 C. Immunolabeling di fibronectina (rossa) e nuclei delle cellule (DAPI, blu), ammessi per l'imaging della struttura alveolare conservata in 3D-LTC umana ex vivo. Trattamento dell'essere umano tributo prende a pugni con una citochina profibrotic cocktail (tra cui il fattore di crescita trasformante beta 1, fattore di crescita piastrinico derivato AB, lipophosphatidyl acido e fattore di necrosi tumorale alfa) per 48 h ha provocato fibrosi-come i cambiamenti in essere umano 3D-LTC. Di qPCR, è stata osservata un'induzione significativa della matrice extracellulare fibrosi rilevanti componenti geni del collagene tipo 1 e fibronectina in 3D-LTC pugni sul trattamento con il profibrotic cocktail (Figura 4). Inoltre, i livelli della proteina del vimentin marcatore mesenchimali sono stati trovati upregulated in 3 su 4 pazienti dopo il trattamento di pugni 3D-LTC (Figura 4E).

Processo PCLS: resezione tissutale, riempimento di agarosio, preparazione della fetta, coltura; diagramma della linea temporale.
Figura 1: flusso di lavoro di generazione di tributo. Tumore-libero aree delle resezioni polmonari sono accuratamente controllati a causa della loro integrità del tessuto. Se il tessuto è segnato adatto per un ulteriore uso (segnando è spiegato dettagliatamente nella sezione materiali e metodi), successiva è riempita di liquido dell'agarosi. Blocchi di tessuto riempiti con agarosio solidificato successivamente vengono tagliati con un vibratomo. Sommerso nel mezzo di coltura cellulare, 3D-LTC sono coltivate fino a 120 h dopo la loro generazione. Analisi a valle di 3D-LTC comportano espressione della proteina o RNA, fluorescenza tessuto live imaging, come pure l'immunofluorescenza che macchia dopo la fissazione del tessuto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Impostazione dell'esperimento di perfusione polmonare con diagramma dell'arteria e del bronco, dimostrando il processo di iniezione.
Figura 2: riempire il tessuto polmonare con basso punto di fusione dell'agarosi punto. Il tessuto polmonare è cannulato con un catetere venoso periferico che viene inserito in un bronco adiacente all'arteria polmonare (Figura 2A). Pinzette vengono utilizzate per fissare la cannula nel Bronco e bloccare l'arteria polmonare per evitare perdite di liquido agarosio. Agarosio liquido a 42 ° C viene versato in tessuto polmonare con una siringa da 30 mL (Figura 2B). Un posizionamento distale della cannula durante il riempimento si tradurrà in piccole aree di tessuto riempito (Figura 2), mentre il posizionamento prossimale garantisce il riempimento di un più grande volume di tessuto (Figura 2D). Eventuali ostruzioni delle vie aeree ridurrà la quantità di tessuto volume che può essere riempito (Figura 2E). In caso di fuoriuscita di agarosio, una cannula distale posizionamento e/o bloccaggio del lato perdite consente agarosio corretto riempimento del tessuto polmonare (Figura 2F-2h). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Processo di sezionamento dei tessuti; diagramma, preparazione del blocco di tessuto, taglio al microtomo, configurazione sperimentale.
Figura 3: taglio di precisione del polmone affettare. Un tessuto polmonare correttamente riempito dell'agarosi è utilizzato per asportare un pezzo di un blocco di tessuto (1 x 1,5 cm x 1 cm) con un bisturi (Figura 3A). Successivamente il blocco di tessuto asportato è incollato al titolare del tessuto, barra della scala indica 1 cm (Figura 3B). Preferibilmente, il tessuto è incollato con la sua superficie pleurica alla superficie di fissaggio del tessuto come mostrato in Figura 3. 500 µm spessore fette sono tagliate del vibratome con un coltello zaffiro in un angolo di 10° - 15° rispetto il tessuto (Figura 3D e 3E). La procedura di taglio si traduce in fette di 2-3 cm3 grande polmone intatto, scala bar = 5 mm (Figura 3F). Inoltre, utilizzando un perforatore di biopsia, possono essere generati piccoli pugni riproducibile con un diametro di 4 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Analisi di colture cellulari; confronto tra immunofluorescenza (A-C), espressione genica (D) e livelli di proteine (E).
Figura 4: letture sperimentali di umano 3D-LTC dopo 48h di cultura. Un pugno umano 3D-LTC di 4 mm di diametro è stato immunostained per fibronectina (in rosso) e DAPI (in blu) (Figura 4A-4C). Scala bar = 1.000 µm. Figura 4 Mostra l'immagine unita. Analisi del RNA del tributo mediante RT-PCR quantitativa Mostra un aumento significativo dell'espressione del gene COL1A1 e FN1 dai cocktail profibrotic25. Figura 4E Visualizza un immunoblot di lisati di intera proteina del tributo, che sono stati curati con un cocktail fibrotica25. Sondaggio per il Vimentin e β-actina ha dimostrato un'espressione di proteina aumentata del marcatore mesenchymal (vimentin) dopo trattamento con profibrotic fattori nei campioni dei pazienti 1, 3 e 4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

CriterioPunti
Il campione di tessuto è intatto superficie pleurica.20
Il campione di tessuto sembra in modo macroscopico intatto, priva di incisioni, schiacciamento, rotture e distorsioni.20
Il campione di tessuto contiene almeno un bronco con un diametro > 1mm.20
Non contiene il campione di tessuto o soltanto poco importi di sangue.4
Il campione di tessuto è stato memorizzato completamente in mezzo e non mostra alcun segno evidente di atelectasia.4
Il campione di tessuto è stato resecato nelle ultime quattro ore.4
Il campione di tessuto è maggiore di 5cm nel relativo più grande diametro.4
Punteggio ottenuto in somma:

Tabella 1: polmone dell'agarosi riempimento punteggio. Il polmone dell'agarosi riempimento Punteggio (LAFS) correla con il tasso di successo per riempire una resezione di tessuto con agarosio per la sua produzione successiva di tributo vibratome-basato. Il Punteggio riassume tutti i punti di criteri soddisfatti dal tessuto. Un LAFS pari o di sopra 72 predice agarosio buona proprietà di riempimento, un punteggio inferiore a 60 prevede un altamente probabile fallimento di agarosio riempimento del tessuto.

Discussione

Il protocollo descritto in questo manoscritto copre la generazione di tributo da resectates tessuto polmonare umano riempiendolo con liquido agarosio e successiva vibratome affettare. Generazione delle fette del tessuto è stata dimostrata prima per un paio di organi, come fegato e cervello, mentre la rigidità intrinseca di questi organi ammessi diretta affettare senza alcuna modifica del tessuto. Di nota, l'adeguata preparazione iniziale del tessuto polmonare è il passaggio più importante nella generazione di tributo. Riempimento dell'agarosi del polmone è il metodo di scelta per stabilizzare la sua natura morbida ed elastica e di garantire una produzione di tributo omogeneo e riproducibile. Grandi vie aeree del tessuto polmonare resecato sono cannulati per fornire accesso alle piccole vie aeree, nonché per il parenchima polmonare intatta. La mancanza di un pleura intatto, che rende quasi impossibile la agarosio riempimento, è delle principali ragioni perché tessuto polmonare per lo più non è utilizzabile per affettare del polmone. Prospetticamente, una pleura sintetico originariamente progettato per eseguire gli esperimenti funzionali su impalcature di decellularizzazione potenzialmente potrebbe essere applicato per ottenere successo dell'agarosi riempimento degli espianti che non dispongono di un intatto pleura31. Resezioni risultante in un pezzo di tessuto polmonare umano con intatto pleura sono essenziali per la generazione di blocchi di tessuto per affettare. Tessuto resecato è più disponibile a causa di tumore-liberi del tessuto da resezioni del cancro del rispetto completamente intatti lobi o espianti di intero-polmone di pazienti che hanno subito il trapianto del polmone.

Comunemente, i due sistemi vengono utilizzati per produrre tributo: il Krumdieck del tessuto affettatrice15 e vibranti microtomi (vibratomes). Affettatrici di tessuto generano fette facendo passare un blocco di tessuto attraverso un serbatoio metallico, che taglia il tributo a 90° alla fine di questa nave. Vibratomes generare tributo spostando un vibrante coltello orizzontalmente sopra un blocco ancorato del tessuto che è immerso in un bagno di medie raffreddato, che rispetto all'affettatrice Krumdieck esercita meno forza di taglio sul tessuto. Ciò provoca meno duro trattamento del tessuto prima di coltivazione. D'altra parte, il taglio del vibratome è più tempo e lavoro consumando. Nelle nostre mani, vibratome affettare abilitata alla produzione di un massimo di 100 tributo o 500 tributo pugni in un giorno, sufficiente per gli studi più sperimentali. TRIBUTO può essere coltivato in vari modi: (a) allegato ai Trans-pozzi, generando così un'interfaccia liquido aria sistema (ALI), (b) come cultura di organo dinamico (DOC), o (c) sommersa in mezzo di coltura cellulare alle condizioni di coltura cellulare standard. La coltivazione in dettaglio del tributo era precedentemente descritti22,23,25; Tuttavia, uno standard comune delle condizioni di coltivazione tra loro utilizzo in vari laboratori in tutto il mondo è ancora mancano. In particolare, il tempo di cultura potrebbe essere critico: come in murino tributo, una perdita di cellule alveolari di tipo positivo 2 SFTPC è osservata dopo 144 h, ma non dopo 120 ore22. Inoltre, attività metabolica sembra rimanere stabile in murino22 e tributo umano25 per 120 ore.

Ci sono un paio di limitazioni tecniche per la generazione di tributo: il numero e le dimensioni del resectates varia nel tempo; l'efficienza di agarosio di riempimento, che dipende dalla presenza della pleura intatta all'interno del tessuto ottenuto, determina il successo finale della generazione tributo; e distruzione del tessuto causata dalle mutazioni patologiche all'interno del tessuto polmonare (malato) ottenuti potrebbe interferire con la preparazione di tributo. Ostruzioni delle vie aeree e tessuto fibrotico manca spazio alveolare intatto ostacolare con agarosio riempimento e quindi rendere affettare del tessuto fibrotico un compito impegnativo. Enfisematose tessuti come trovano in malattie come BPCO o deficit di alfa-1-anti-tripsina non potrebbe sopportare la pressione di riempimento dell'agarosi e si tradurrà in rottura dei manufatti architettonici e gli alveoli. In questi casi, l'utilizzo di agarosio bassa concentrazione, ad esempio, 1% (p/v), potrebbe essere utile per diminuire la pressione e la velocità durante il riempimento dell'agarosi. Nel complesso, lo stato di malattia del tessuto può limitare drasticamente l'uso del tessuto per la generazione di tributo. Tutti questi parametri determinano l'importo del tributo che può essere generato dal tessuto polmonare, e anche la quantità di tempo che ci vuole per produrre il tributo. Ulteriori limitazioni di tributo sono incoerenze tra fette di polmone diversi rispetto al contenuto di dimensioni o del tessuto, che richiede ulteriori passaggi della normalizzazione per esperimenti. Per ovviare a questo, punzoni di biopsia delle regioni simili della stessa fetta possono essere generati. Questa procedura è in grado di ridurre la variabilità del tessuto e, come vantaggio aggiuntivo, aumentare il numero di campioni di tributo che può essere utilizzato per gli esperimenti.

In conclusione, colture del tessuto polmonare umano 3D da agarosio riempito tributo forniscono un modello umano complesso per lo studio della fisiologia polmonare e malattie. Il protocollo fornisce una descrizione dettagliata della preparazione del tributo da tessuto polmonare resecato e la loro coltivazione e inoltre affronta sfide in agarosio ripieno di resezioni polmonari umane e come superarli.

Dichiarazioni

Tutti gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Ringraziamenti

Gli autori sono grati a Marisa Neumann per assistenza tecnica. Tutti i tessuti del polmone sono state gentilmente concesse da CPC-M Bio-archivio. Questo lavoro è stato supportato dal centro tedesco di sovvenzioni del polmone ricerca (DZL), l'Associazione Helmholtz e CPC Research School.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Vibratomo Hyrax V50Zeiss-Hyrax
CU 65Zeiss-Vasofix
Braunü le 18 GB. Braun Melsungen AG4268130B
30 mL NORM-INJECTHenke Sass Wolf 4830001000
Bisturi monouso protetti, steriliSwann-Morton
Loctite 406HenkelLOCTITE 406
Coltelli sintetici in cristallo singolo ZaffiroDelaware-
Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 Nutreient Mixture (Ham) + L-Glutammina + 15mM HEPESGibco31330-038
Penicillina StreptomycinGibco di Life Technologies15070-063
Siero fetale bovino con processo speciale (Sera Plus)Pan BiotechP30-3702
Punch per biopsia monousopfm medical48401
96 pozzetti, nero/trasparente, piastra trattata con coltura tissutale, fondo piatto con coperchio, sterileFalcon / Corning353219
agarosio, bassa temperatura di gelificazioneSigmaA9414-100G

Riferimenti

  1. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2010).
  2. Rosenberg, S. R., Kalhan, R., Mannino, D. M. Epidemiology of Chronic Obstructive Pulmonary Disease: Prevalence, Morbidity, Mortality, and Risk Factors. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine Med. 36 (4), 457-469 (2015).
  3. Hekking, P. P., et al. The prevalence of severe refractory asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (4), 896-902 (2015).
  4. Woodard, G. A., Jones, K. D., Jablons, D. M. Lung Cancer Staging and Prognosis. Cancer Treatment and Research. 170, 47-75 (2016).
  5. Ley, B., Collard, H. R., King, T. E. Clinical course and prediction of survival in idiopathic pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 183 (4), 431-440 (2011).
  6. Burgstaller, G., et al. The instructive extracellular matrix of the lung: basic composition and alterations in chronic lung disease. European Respiratory Journal. 50 (1), (2017).
  7. Degryse, A. L., Lawson, W. E. Progress toward improving animal models for idiopathic pulmonary fibrosis. The American Journal of the Medical Sciences. 341 (6), 444-449 (2011).
  8. Fricker, M., Deane, A., Hansbro, P. M. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Expert Opinion on Drug Discovery. 9 (6), 629-645 (2014).
  9. Sagar, S., Akbarshahi, H., Uller, L. Translational value of animal models of asthma: Challenges and promises. European Journal of Pharmacology. 759, 272-277 (2015).
  10. Williamson, J. D., Sadofsky, L. R., Hart, S. P. The pathogenesis of bleomycin-induced lung injury in animals and its applicability to human idiopathic pulmonary fibrosis. Experimental Lung Research. 41 (2), 57-73 (2015).
  11. Cooper, P. R., et al. Formoterol and salmeterol induce a similar degree of beta2-adrenoceptor tolerance in human small airways but via different mechanisms. British Journal of Pharmacology. 163 (3), 521-532 (2011).
  12. Skronska-Wasek, W., et al. Reduced Frizzled Receptor 4 Expression Prevents WNT/beta-Catenin-driven Alveolar Lung Repair in Chronic Obstructive Pulmonary Disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 196 (2), 172-185 (2017).
  13. Lehmann, M., et al. Senolytic drugs target alveolar epithelial cell function and attenuate experimental lung fibrosis ex vivo. European Respiratory Journal. 50 (2), (2017).
  14. Koch, A., et al. Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo. Cell Communication and Signaling. 12, 73(2014).
  15. Ebsen, M., et al. Infection of murine precision cut lung slices (PCLS) with respiratory syncytial virus (RSV) and chlamydophila pneumoniae using the Krumdieck technique. Pathology - Research and Practice. 198 (11), 747-753 (2002).
  16. Kennedy, J. L., et al. Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).
  17. Royce, S. G., et al. Airway Remodeling and Hyperreactivity in a Model of Bronchopulmonary Dysplasia and Their Modulation by IL-1 Receptor Antagonist. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (6), 858-868 (2016).
  18. Donovan, C., et al. Rosiglitazone elicits in vitro relaxation in airways and precision cut lung slices from a mouse model of chronic allergic airways disease. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 309 (10), L1219-L1228 (2015).
  19. Zscheppang, K., et al. Human Pulmonary 3D Models For Translational Research. Biotechnology Journal. 13 (1), (2018).
  20. Fisher, R. L., et al. The use of human lung slices in toxicology. Human & Experimental Toxicology. 13 (7), 466-471 (1994).
  21. Wang, L., et al. Differences between Mice and Humans in Regulation and the Molecular Network of Collagen, Type III, Alpha-1 at the Gene Expression Level: Obstacles that Translational Research Must Overcome. International Journal of Molecular Sciences. 16 (7), 15031-15056 (2015).
  22. Uhl, F. E., et al. Preclinical validation and imaging of Wnt-induced repair in human 3D lung tissue cultures. European Respiratory Journal. 46 (4), 1150-1166 (2015).
  23. Switalla, S., et al. Natural innate cytokine response to immunomodulators and adjuvants in human precision-cut lung slices. Toxicology and Applied Pharmacology. 246 (3), 107-115 (2010).
  24. Banerjee, A., et al. Trichostatin A abrogates airway constriction, but not inflammation, in murine and human asthma models. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (2), 132-138 (2012).
  25. Alsafadi, H. N., et al. An ex vivo model to induce early fibrosis-like changes in human precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (6), L896-L902 (2017).
  26. Westra, I. M., Oosterhuis, D., Groothuis, G. M., Olinga, P. Precision-cut liver slices as a model for the early onset of liver fibrosis to test antifibrotic drugs. Toxicology and Applied Pharmacology. 274 (2), 328-338 (2014).
  27. Vatakuti, S., Schoonen, W. G., Elferink, M. L., Groothuis, G. M., Olinga, P. Acute toxicity of CCl4 but not of paracetamol induces a transcriptomic signature of fibrosis in precision-cut liver slices. Toxicology in Vitro. 29 (5), 1012-1020 (2015).
  28. Poosti, F., et al. Precision-cut kidney slices (PCKS) to study development of renal fibrosis and efficacy of drug targeting ex vivo. Disease Models & Mechanisms. 8 (10), 1227-1236 (2015).
  29. Li, M., de Graaf, I. A., Groothuis, G. M. Precision-cut intestinal slices: alternative model for drug transport, metabolism, and toxicology research. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 12 (2), 175-190 (2016).
  30. Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
  31. Wagner, D. E., et al. Design and Synthesis of an Artificial Pulmonary Pleura for High Throughput Studies in Acellular Human Lungs. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (2), 184-195 (2014).

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Tessuto polmonare umanosezioni polmonari di precisionecolture 3D di tessuto polmonaresezione con vibratomoriempimento con agarosiobiopsia a punchanalisi di immunofluorescenzaWestern blottinganalisi qRT PCRmodellizzazione della fibrosi

Articoli correlati