Qui descriviamo un protocollo per esprimere proteine in protoplasti utilizzando il metodo di trasformazione PEG-mediata. Il metodo fornisce facile espressione di proteine di interesse e di indagine efficiente di localizzazione della proteina e il processo di importazione per varie condizioni sperimentali in vivo.
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Articolo metodologico
Lo studio di proteine importazione in cloroplasti utilizzando protoplasti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il cloroplasto è un organulo essenziale che è responsabile di vari processi cellulari nelle piante, come la fotosintesi e la produzione di molti metaboliti secondari e di lipidi. Cloroplasti richiedono un gran numero di proteine per questi vari processi fisiologici. Oltre il 95% delle proteine del cloroplasto sono nucleo-codificato e importati in cloroplasti dal cytosol dopo traduzione sui ribosomi citosolici. Così, targeting di queste proteine di nucleo-codificato cloroplasto a cloroplasti o l'importazione corretta è essenziale per il corretto funzionamento di cloroplasti, come pure la cellula della pianta. Nucleo-codificato cloroplasto proteine contengono sequenze di segnale per il targeting specifico di cloroplasti. Macchinario molecolare localizzata al cloroplasto o citosol riconoscere questi segnali ed eseguire il processo di importazione. Per studiare i meccanismi di importazione di proteina o targeting per cloroplasti in vivo, abbiamo sviluppato un metodo basato su protoplasti rapido, efficiente per analizzare la proteina importazione in cloroplasti di Arabidopsis. In questo metodo, usiamo protoplasti isolati dai tessuti fogliari di Arabidopsis. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l'utilizzo di protoplasti per studiare il meccanismo mediante il quale le proteine vengono importate in cloroplasti.
Introduzione
Il cloroplasto è uno degli organelli più importanti nelle piante. Una delle funzioni principali dei cloroplasti è di svolgere la fotosintesi1. I cloroplasti svolgono anche molte altre reazioni biochimiche per la produzione di acidi grassi, aminoacidi, nucleotidi e numerosi metaboliti secondari1,2. Per tutte queste reazioni, cloroplasti richiedono un gran numero di diversi tipi di proteine. Tuttavia, il genoma del cloroplasto contiene solo circa 100 geni3,4. Di conseguenza, cloroplasti necessario importare la maggior parte delle ....
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Protocollo
1. la crescita di piante di Arabidopsis
- Preparare 1 L Gamborg B5 (B5) medio aggiungendo 3,2 g di B5 medio tra cui vitamine, 20 g di saccarosio, 0,5 g di 2-(N-morpholino) etano acido solfonico (MES) a circa 800 mL di acqua deionizzata e regolare il pH a 5,7 con idrossido di potassio (KOH). Aggiungi più deionizzata acqua portare il volume totale a 1 L. aggiungere 8 g di phytoagar e autoclave per 15 min a 121 ° C.
- Lasci che il media raffreddare fino a 55 ° C e versare 20 – 25 mL di terreno B5 in una capsula Petri (diametro 9 cm, 1.5 cm di altezza) presso un banco pulito. Asciugare le piastre per 2 – 3 giorni, comprimerle con involucro pulito e tenerli....
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Risultati
L'importazione di proteine in cloroplasti può essere esaminato mediante due approcci: analisi di microscopia e immunoblot di fluorescenza dopo separazione SDS-pagina-mediata. Qui, abbiamo usato RbcS-nt:GFP, una fusione costruire codifica i 79 residui dell'amminoacido N-terminale di RbcS contenente il peptide di transito fuso alla GFP. Quando proteine vengono importate in cloroplasti, i segnali di fluorescenza verde da proteina bersaglio RbcS-nt:GFP dovrebbe fondersi con i segnali fluoresc.......
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Discussione
Abbiamo fornito un protocollo dettagliato per l'uso dei protoplasti di Arabidopsis per studiare la proteina importazione in cloroplasti. Questo metodo è potente per studiare il processo di importazione di proteine. Questa tecnica semplice, versatile è utile per esaminare il targeting delle proteine del carico previsto di cloroplasti. Utilizzando questo metodo, protoplasti vengono preparati da tessuti fogliari di Arabidopsis11,12 , che può essere.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato effettuato con il supporto del programma di ricerca cooperativa per la scienza l'agricoltura e lo sviluppo della tecnologia (progetto n ° PJ010953012018), gestione dello sviluppo rurale e la concessione di National Research Foundation (Corea), finanziato dal Ministero della scienza e ICT (n. 2016R1E1A1A02922014), Repubblica di Corea.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| GAMBORG B5 MEDIUM CON VITAMINE | Duchefa Biochemie | G0210.0050 | |
| SACCAROSIO | Duchefa Biochemie | S0809.5000 | |
| MES MONOIDRATO | Duchefa Biochemie | M1503.0250 | |
| Agar, polvere | JUNSEI | 24440S1201 | |
| Micropore Nastro chirurgico | 3M | 1530-0 | |
| Lama chirurgica stainless No.10 | FEATHER | non disponibile | |
| , 50ml | SPL LIFE SCIENCES | 50050 | |
| Macerozyme R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Non disponibile | |
| Cellulasi ONOZUKA R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Non disponibile | |
| ALBUMINA, BOVINA (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| D-Mannitol | SIGMA | M1902-1KG | |
| CLORURO DI CALCIO, DIIDRATO | MP BIOMEDICALS | 0219463505-5KG | |
| Twister | VISION SCIENTIFIC | VS-96TW | |
| Tazza per CD-1 | SIGMA | S1145 | |
| Schermi per CD-1 | SIGMA | S3895 | |
| Petri Dish SPL | LIFE SCIENCES | 10090 | |
| Pasteur pipetta | HILGENBERG | 3150102 | |
| CENTRIFUGA DA LABORATORIO / DA BANCO | VISION SCIENTIFIC | VS-5500N | |
| Cloruro di sodio | JUNSEI | 19015S0350 | |
| Cloruro di potassio | SIGMA | P3911-1KG | |
| D-GLUCOSIO, ANIDRO | BIO BASIC | GB0219 | |
| Idrossido di potassio | DUKSAN | 40 | |
| Nitrato di calcio tetraidrato | SIGMA | C2786-500G | |
| Poli(glicole etilenico) | SIGMA | P2139-2KG | |
| Cloruro di magnesio esaidrato | SIGMA | M2393-500G | |
| Tubo 13ml, 100x16mm, PP | SARSTEDT | 55.515 | |
| Vetrini per microscopio | MARIENFELD | 1000412 | |
| Occhiali di copertura per microscopio | MARIENFELD | 101030 | |
| Camera di conteggio | MARIENFELD | 650030 | |
| Axioplan 2 Microscopio per immagini | Carl Zeiss | Non disponibile | |
| Microprovetta 1,5ml | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| 2- Mercaptoetanolo | SIGMA | M3148-250ML | |
| Dodecil solfato di sodio (SDS), grado di proteomica | VWR | M107-500G | |
| TRIS, grado ultra puro | VWR | 0497-5KG | |
| DTT (DL-Ditiotreitolo), grado biotecnologico | VWR | 0281-25G | |
| sale di bromofenolo blu di sodio ACS | VWR | 0312-50G | |
| glicerolo | JUNSEI | 27210S0350 | |
| Living Colors A.v. Anticorpo monoclonale (JL-8) | TAKARA | 632381 |
Riferimenti
- Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
- Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
- Rolland, N., et al.
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Ristampe e permessi
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