Lo studio di proteine importazione in cloroplasti utilizzando protoplasti

Sommario

Qui descriviamo un protocollo per esprimere proteine in protoplasti utilizzando il metodo di trasformazione PEG-mediata. Il metodo fornisce facile espressione di proteine di interesse e di indagine efficiente di localizzazione della proteina e il processo di importazione per varie condizioni sperimentali in vivo.

Abstract

Il cloroplasto è un organulo essenziale che è responsabile di vari processi cellulari nelle piante, come la fotosintesi e la produzione di molti metaboliti secondari e di lipidi. Cloroplasti richiedono un gran numero di proteine per questi vari processi fisiologici. Oltre il 95% delle proteine del cloroplasto sono nucleo-codificato e importati in cloroplasti dal cytosol dopo traduzione sui ribosomi citosolici. Così, targeting di queste proteine di nucleo-codificato cloroplasto a cloroplasti o l'importazione corretta è essenziale per il corretto funzionamento di cloroplasti, come pure la cellula della pianta. Nucleo-codificato cloroplasto proteine contengono sequenze di segnale per il targeting specifico di cloroplasti. Macchinario molecolare localizzata al cloroplasto o citosol riconoscere questi segnali ed eseguire il processo di importazione. Per studiare i meccanismi di importazione di proteina o targeting per cloroplasti in vivo, abbiamo sviluppato un metodo basato su protoplasti rapido, efficiente per analizzare la proteina importazione in cloroplasti di Arabidopsis. In questo metodo, usiamo protoplasti isolati dai tessuti fogliari di Arabidopsis. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l'utilizzo di protoplasti per studiare il meccanismo mediante il quale le proteine vengono importate in cloroplasti.

Introduzione

Il cloroplasto è uno degli organelli più importanti nelle piante. Una delle funzioni principali dei cloroplasti è di svolgere la fotosintesi¹. I cloroplasti svolgono anche molte altre reazioni biochimiche per la produzione di acidi grassi, aminoacidi, nucleotidi e numerosi metaboliti secondari^1,2. Per tutte queste reazioni, cloroplasti richiedono un gran numero di diversi tipi di proteine. Tuttavia, il genoma del cloroplasto contiene solo circa 100 geni^3,4. Di conseguenza, cloroplasti necessario importare la maggior parte delle loro proteine dal cytosol. Infatti, la maggior parte delle proteine del cloroplasto sono stata indicata per essere importati dal cytosol dopo traduzione^4,5,6. Cellule vegetali richiedono meccanismi specifici per l'importazione di proteine dal cytosol ai cloroplasti. Tuttavia, anche se questi meccanismi di importazione di proteina sono stati studiati per i parecchi decenni passati, ancora non completamente capiamo loro a livello molecolare. Qui, forniamo un metodo dettagliato per la preparazione di protoplasti ed esogenicamente che esprimono i geni in protoplasti. Questo metodo potrebbe essere prezioso per chiarire i meccanismi molecolari alla base di importazione di proteina in cloroplasti in dettaglio.

Importazione di proteine possa essere studiati utilizzando molti approcci diversi. Uno di questi metodi prevede l'utilizzo di un in vitro della proteina importazione sistema^7,8. Utilizzando questo approccio, in vitro-tradotta proteine precursori vengono incubati con cloroplasti purificata in vitro, e importazione di proteina è analizzata da SDS-PAGE seguita da analisi western blot. Il vantaggio di questo approccio è che ogni passaggio dell'importazione di proteina in cloroplasti possa essere studiata in dettaglio. Pertanto, questo metodo è stato ampiamente utilizzato per definire i componenti del macchinario molecolare della proteina importazione e dissezionare informazioni di sequenza per i peptidi di transito. Più recentemente, è stato sviluppato un altro approccio che coinvolge l'uso dei protoplasti da tessuti fogliari e si è diffuso per lo studio di proteine importazione in cloroplasti^9,10. Il vantaggio di questo approccio è che i protoplasti forniscono un ambiente cellulare che è più vicino a quella di cellule intatte rispetto al sistema in vitro . Così, il sistema di protoplasti permette di affrontare molti altri aspetti di questo processo, come gli eventi associati citosolici e come viene determinata la specificità dei segnali di targeting. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per l'uso dei protoplasti di studiare proteine importazione in cloroplasti.

Protocollo

1. la crescita di piante di Arabidopsis

1. Preparare 1 L Gamborg B5 (B5) medio aggiungendo 3,2 g di B5 medio tra cui vitamine, 20 g di saccarosio, 0,5 g di 2-(N-morpholino) etano acido solfonico (MES) a circa 800 mL di acqua deionizzata e regolare il pH a 5,7 con idrossido di potassio (KOH). Aggiungi più deionizzata acqua portare il volume totale a 1 L. aggiungere 8 g di phytoagar e autoclave per 15 min a 121 ° C.
2. Lasci che il media raffreddare fino a 55 ° C e versare 20 – 25 mL di terreno B5 in una capsula Petri (diametro 9 cm, 1.5 cm di altezza) presso un banco pulito. Asciugare le piastre per 2 – 3 giorni, comprimerle con involucro pulito e tenerli in frigorifero fino all'uso.
3. Sterilizzare Arabidopsis thaliana semi con 1 mL di etanolo al 70% (v/v) in una provetta da centrifuga (e-tubo) agitando continuamente per 2 – 3 minuti rimuovere il surnatante, aggiungere 1 mL di soluzione di ipoclorito di sodio 1% (v/v) e agitare continuamente per 2 – 3 min. 100 preparare – 150 semi per piastra di Petri.
   1. I surnatanti di rimuovere e lavare i semi con 1 mL di acqua distillata. Ripetere questo passaggio 4x. Mettere i semi sterilizzati a 4 ° C per 3 giorni sincronizzare la germinazione del seme.
4. Seminare i semi di 100 – 150 su B5 piastre utilizzando una micropipetta e sigillare la piastra con nastro chirurgico.
5. Crescere le piante in una stanza di crescita con un ciclo di luce/buio di 16 h/8 h a 100 µmol·m p^-2-1 intensità della luce, 70% di umidità relativa e temperatura di 20 ° C per 2 settimane.

2. preparazione del plasmide

Nota: Plasmidi di elevata purezza devono essere utilizzati per la trasformazione; è consigliato l'uso di un kit di purificazione del plasmide commerciale.

1. Purificare il plasmide (RbcS-nt:GFP) utilizzando un kit di isolamento del DNA. Per concentrare gli sforzi del DNA, eseguire precipitazione dell'etanolo in una provetta da 1,5 mL e dissolva la pallina del DNA in 100 µ l di acqua distillata. Determinare la concentrazione del plasmide utilizzando uno spettrofotometro a 260 nm. Diluire il plasmide ad una concentrazione finale di ~ 2 µ g / µ l. mantenere il plasmide a-20 ° C fino all'utilizzo.

3. isolamento di protoplasti

1. Preparare le seguenti soluzioni.
   1. Preparare la soluzione di enzima per contenere 0.25% (p/v) macerozyme, cellulasi 1,0% (p/v), 400 mM D-mannitolo, cloruro di calcio di 8 mM (CaCl₂), 0,1% (p/v) albumina di siero bovino (BSA) e 5 mM MES. Regolare il pH a 5.6 con KOH.
      1. Filtrare la soluzione di enzima utilizzando un'unità di filtro di acetato di cellulosa con una dimensione dei pori di 0.45 μm. Aliquotare 25 mL della soluzione enzimatica in provette coniche da 50 mL e mantenere a-20 ° C. Scongelare la soluzione enzimatica a temperatura ambiente (TA) e mescolare bene prima dell'uso.
   2. Preparare una soluzione di saccarosio del 21% (p/v) sciogliendo 21 g di saccarosio in 100 mL di acqua deionizzata e autoclave la soluzione.
   3. Preparare soluzione W5 per contenere 154 mM di cloruro di sodio (NaCl), 125 mM CaCl₂, 5mm potassio cloruro (KCl), glucosio di 5 mM e 1,5 mM MES. Regolare il pH a 5.6 con KOH ed autoclave la soluzione.
   4. Preparare la soluzione di Marco per contenere 400 mM D-mannitolo, cloruro di magnesio (MgCl₂), 15 mM e 5 mM MES. Regolare il pH a 5.6 con KOH ed autoclave la soluzione.
   5. Preparare 1 M D-mannitolo e 1m nitrato di calcio stock soluzioni per rendere la soluzione di PEG. Autoclave queste soluzioni.
2. Raccolta tessuti fogliari intatto da 2 settimane-vecchio piante da ~ 1 – 2 B5 piastre utilizzando un coltello chirurgico e posto le foglie raccolte in un 50 mL conica tubo da 25 mL di soluzione degli enzimi. Posizionare il tubo conico contenente i tessuti di soluzione e foglia di enzima orizzontalmente su un agitatore rotante con movimentazione delicata al buio. Ci vogliono 8 – 12 h per digestione completa dei tessuti fogliari.
3. A 8 – 12 h dopo l'incubazione, versare la soluzione di enzima (contenente protoplasti rilasciati da tessuti fogliari) in una capsula Petri fresco attraverso una maglia con 140 µm dei pori. Attentamente la soluzione di enzima del protoplasto-contenenti in cima 15 mL di soluzione di saccarosio al 21% (p/v) di strato e centrifugare esso a 98 x g per 10 min con le impostazioni più basse di accelerazione e decelerazione in un rotore basculante.
4. Utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire con cautela i protoplasti dallo strato superiore (soluzione enzimatica) e all'interfaccia tra l'enzima soluzione e la soluzione di saccarosio di una provetta conica da 50 mL contenente 30 mL di soluzione di W5. Centrifugare la provetta a 51 x g per 6 min. In questa fase, protoplasti sarà nel pellet nella parte inferiore del tubo conico.
5. Scartare il surnatante con attenzione usando una pipetta senza disturbare il pellet di protoplasti. Aggiungere 25 mL di soluzione di W5 e Risospendere delicatamente i protoplasti. Incubare la soluzione del protoplasto in un frigorifero a 4 ° C per almeno 1 h per la stabilizzazione.

4. protoplasti trasformazione utilizzando polietilene glicole

1. Preparare un 40% PEG soluzione aggiungendo 4 g di PEG 8000, 4 mL di soluzione di mannitolo 1 M, 1 mL di 1 M Ca (NO₃)₂e 1,8 mL di acqua distillata in una provetta conica da 50 mL e mescolare bene. Sciogliere PEG di riscaldamento nel forno a microonde per 20 – 30 s. posto il 40% soluzione di PEG a RT per rinfrescarsi.
   Nota: Il 40% di PEG soluzione deve essere preparata fresca ogni volta. Se protoplasti non sono pellettati completamente durante l'incubazione di 4 ° C in frigorifero, centrifugare il materiale a 46 x g per 2 min.
2. Rimuovere il surnatante con attenzione ma completamente ed aggiungere la soluzione di Marco al pellet di protoplasti di cedere la concentrazione di 5 x 106/ml.
   Nota: Il numero di protoplasti può essere determinato da un emocitometro visualizzato al microscopio.
3. Posto 10 µ g di DNA plasmidico, ogni vuoto mL 13 round-fondo tubo e aggiungere 300 µ l di soluzione di protoplasti utilizzando una pipetta.
   Nota: L'estremità della punta della pipetta deve essere tagliata. Ogni volta che vengono campionati protoplasti, la soluzione contenente protoplasti dovrebbe essere risospese destra prima di pipettaggio affinché lo stesso numero di protoplasti viene aggiunto in ogni provetta.
4. Mescolare il DNA del plasmide con protoplasti ruotando delicatamente i tubi e immediatamente aggiungere 300 µ l di 40% PEG soluzione utilizzando una pipetta. Agitare delicatamente ma completamente ruotando tubi ed incubare per 30 min a temperatura ambiente; inclinare il tubo in posizione quasi orizzontale e ruotare più volte.
5. Aggiungere 1 mL di soluzione di W5 e agitare delicatamente ma completamente ruotando il tubo a mano in un modo simile. Incubare il campione per 10 min a temperatura ambiente.
6. Ripetere questo passaggio due volte utilizzando più 1,5 mL e 2 mL di soluzione di W5, rispettivamente. Incubare per 30 min dopo l'aggiunta finale di W5 soluzione.
7. Centrifugare a 46 x g per 4 min. scartare il sopranatante e aggiungere 2 mL di soluzione di W5. Mescolare delicatamente ma completamente. Incubare a 22 ° C in una camera oscura.

5. analisi dell'importazione della proteina in cloroplasti

Nota: Dopo la trasformazione PEG-mediata dei protoplasti, tempo di incubazione varia da 8 a 24 h.

1. Microscopia a fluorescenza
   1. Posto 10 µ l della soluzione del protoplasto su un vetro di diapositiva utilizzando una pipetta con punta tagliata e attentamente coprire con un vetrino coprioggetto per evitare di danneggiare i protoplasti.
   2. Posto il vetrino sul palco di un microscopio a fluorescenza equipaggiato con filtro di eccitazione/emissione imposta per l'osservazione della proteina fluorescente verde (GFP) e auto-fluorescenza della clorofilla.
   3. Acquisizione di immagini con un raffreddato charge coupled device (CCD) fotocamera e processo di immagini utilizzando un software di fotoritocco per produrre immagini di pseudo-colore.
2. Immunoblotting e l'estrazione di proteine totali
   1. Preparare il tampone di denaturazione contenente 2,5% (p/v) sodio dodecilsolfato (SDS) e 2-mercaptoetanolo 2% (v/v).
      Nota: Importazione di proteina in cloroplasti può essere quantificato misurando il grado di peptide di transito l'elaborazione tramite l'analisi di immunoblot usando l'anticorpo anti-GFP.
   2. Trasferire i protoplasti in una provetta da centrifuga e centrifugare a 46 x g per 4 min.
   3. Rimuovere il supernatante e aggiungere 80 µ l di tampone di denaturazione. Vigorosamente vortex per 5 s e aggiungere 5 x tampone del campione SDS (250 mM Tris-Cl (pH 6,8), 0.5 M DTT, SDS 10% (p/v), blu di bromofenolo 0,05% (p/v) e 50% (v/v) glicerolo). Mescolare bene e far bollire per 10 min.
   4. Sottoporre questo campione della proteina a standard SDS-PAGE e immunoblotting con anticorpo anti-GFP.

Risultati

L'importazione di proteine in cloroplasti può essere esaminato mediante due approcci: analisi di microscopia e immunoblot di fluorescenza dopo separazione SDS-pagina-mediata. Qui, abbiamo usato RbcS-nt:GFP, una fusione costruire codifica i 79 residui dell'amminoacido N-terminale di RbcS contenente il peptide di transito fuso alla GFP. Quando proteine vengono importate in cloroplasti, i segnali di fluorescenza verde da proteina bersaglio RbcS-nt:GFP dovrebbe fondersi con i segnali fluoresc...

Discussione

Abbiamo fornito un protocollo dettagliato per l'uso dei protoplasti di Arabidopsis per studiare la proteina importazione in cloroplasti. Questo metodo è potente per studiare il processo di importazione di proteine. Questa tecnica semplice, versatile è utile per esaminare il targeting delle proteine del carico previsto di cloroplasti. Utilizzando questo metodo, protoplasti vengono preparati da tessuti fogliari di Arabidopsis^11,12 , che può essere...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
GAMBORG B5 MEDIUM CON VITAMINE	Duchefa Biochemie	G0210.0050
SACCAROSIO	Duchefa Biochemie	S0809.5000
MES MONOIDRATO	Duchefa Biochemie	M1503.0250
Agar, polvere	JUNSEI	24440S1201
Micropore Nastro chirurgico	3M	1530-0
Lama chirurgica stainless No.10	FEATHER	non disponibile
, 50ml	SPL LIFE SCIENCES	50050
Macerozyme R-10	YAKULT PHARMACEUTICAL IND.	Non disponibile
Cellulasi ONOZUKA R-10	YAKULT PHARMACEUTICAL IND.	Non disponibile
ALBUMINA, BOVINA (BSA)	VWR	0332-100G
D-Mannitol	SIGMA	M1902-1KG
CLORURO DI CALCIO, DIIDRATO	MP BIOMEDICALS	0219463505-5KG
Twister	VISION SCIENTIFIC	VS-96TW
Tazza per CD-1	SIGMA	S1145
Schermi per CD-1	SIGMA	S3895
Petri Dish SPL	LIFE SCIENCES	10090
Pasteur pipetta	HILGENBERG	3150102
CENTRIFUGA DA LABORATORIO / DA BANCO	VISION SCIENTIFIC	VS-5500N
Cloruro di sodio	JUNSEI	19015S0350
Cloruro di potassio	SIGMA	P3911-1KG
D-GLUCOSIO, ANIDRO	BIO BASIC	GB0219
Idrossido di potassio	DUKSAN	40
Nitrato di calcio tetraidrato	SIGMA	C2786-500G
Poli(glicole etilenico)	SIGMA	P2139-2KG
Cloruro di magnesio esaidrato	SIGMA	M2393-500G
Tubo 13ml, 100x16mm, PP	SARSTEDT	55.515
Vetrini per microscopio	MARIENFELD	1000412
Occhiali di copertura per microscopio	MARIENFELD	101030
Camera di conteggio	MARIENFELD	650030
Axioplan 2 Microscopio per immagini	Carl Zeiss	Non disponibile
Microprovetta 1,5ml	SARSTEDT	72.690.001
2- Mercaptoetanolo	SIGMA	M3148-250ML
Dodecil solfato di sodio (SDS), grado di proteomica	VWR	M107-500G
TRIS, grado ultra puro	VWR	0497-5KG
DTT (DL-Ditiotreitolo), grado biotecnologico	VWR	0281-25G
sale di bromofenolo blu di sodio ACS	VWR	0312-50G
glicerolo	JUNSEI	27210S0350
Living Colors A.v. Anticorpo monoclonale (JL-8)	TAKARA	632381