Qui descriviamo un protocollo per la generazione di nanoliposomi cationici, che si basa sul metodo a secco-pellicola e possono essere utilizzato per la cassaforte e consegna efficiente in vitro di trascritti di RNA messaggero.
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Articolo metodologico
Generazione di nanoliposomi cationici per la consegna efficiente In Vitro di trascritti di RNA messaggero
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo sviluppo di RNA messaggero (mRNA)-base terapeutica per il trattamento di varie malattie diventa sempre più importante a causa del positivo proprietà in vitro di trascritti di mRNA (IVT). Con l'aiuto di IVT mRNA, la sintesi de novo di una proteina desiderata può essere indotta senza modificare lo stato fisiologico della cellula bersaglio. Inoltre, biosintesi della proteina può essere controllato proprio a causa dell'effetto transitorio di IVT mRNA.
Per l'efficiente transfezione delle celle, nanoliposomi (NLps) possono rappresentare un veicolo di consegna sicura ed efficiente per mRNA terapeutico. Questo studio descrive un protocollo per generare sicura ed efficiente cationici NLps costituito da DC-colesterolo e 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) come un vettore di consegna di IVT mRNA. NLps avendo una definita dimensione, una distribuzione omogenea e una capacità di complessazione alta e può essere prodotto utilizzando il metodo di film secco. Inoltre, presentiamo sistemi di prova differenti per analizzare loro complessazione ed efficacies di transfezione utilizzando sintetico enhanced proteina fluorescente verde (eGFP) mRNA, come pure il loro effetto sulla vitalità cellulare. Nel complesso, il protocollo presentato fornisce un approccio efficace e sicuro per complessazione di mRNA, che può progredire e migliorare l'amministrazione di mRNA terapeutico.
Introduzione
L'uso di mRNA modificate per applicazioni terapeutiche ha dimostrato grandi potenzialità nell'ultimo paio di anni. Nelle malattie cardiovascolari, infiammatorie e monogenetica, così come lo sviluppo di vaccini, mRNA è un agente terapeutico promettente1.
Terapia sostitutiva della proteina con mRNA offre diversi vantaggi rispetto alla terapia genica classica, che si basa sulla transfezione del DNA nelle cellule bersaglio2. La funzione di mRNA avvia direttamente nel citosol. Anche se il plasmide DNA (pDNA), un costrutto di double-stranded, circolare DNA che contiene una regione di promotore e una....
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Protocollo
1. generazione di nanoliposomi cationici (Figura 1)
- Sciogliere i lipidi DC-colesterolo (3beta - cloridrato di colesterolo [N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoil]) e DOPE (dioleoyl phosphatidylethanolamine), consegnato sotto forma di polvere, in cloroformio per ottenere una concentrazione finale di 25 mg/mL.
Nota: Conservare i lipidi disciolti a-20 ° C. - Lavorare con 25 mg/mL di soluzione madre di entrambi i lipidi. Mix 40 µ l del disciolto DC-colesterolo e 80 µ l di the DOPE disciolto in un fiasco di vetro.
Nota: La quantità totale di lipidi è di 3 mg. Per evitare la rapida evaporazione del cloroformio, mettere ....
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Risultati
Utilizzando il protocollo come descritto, NLps consistente dei lipidi DC-colesterolo e DOPE sono state preparate utilizzando il metodo di film secco (Figura 1). Durante la preparazione, la soluzione di nanoliposome Mostra diverse fasi di torbidità (Figura 2).
L'efficacia di incapsulamento del NLps può quindi essere analizzato dopo l'incapsulamento di 1 µ g di mRNA codif.......
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Discussione
Il protocollo presentato descrive la generazione di NLps con efficacia elevata incapsulamento per mRNA sinteticamente modificate, così come la transfezione affidabile di cellule in vitro. Il NLps, inoltre, garantiscono il rilascio di mRNA, che a sua volta, si traduce in una proteina funzionale all'interno delle cellule. Inoltre, le transfezioni utilizzando NLps possono essere eseguite a mezzo cellulare regolare, conseguente alta cella viabilità durante transfezione e durare fino a tre giorni dopo la trasfezione........
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) | AppliChem, Darmstadt, Germania | A2231 | |
| (3β-[N-(N′,N′-dimetilamminoetano)-carbamoil]colesterolo cloridrato (DC-Colesterolo) | Avanti, Alabama, USA | 700001 | |
| 4 ′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germania | D1306 | |
| BD FACScan system | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | ||
| Cell Fix (10x) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 340181 | |
| Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
| Dimethyl sulfoxid (DMSO) | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germania | 20385.02 | |
| Dioleoil fosfatidiletanolammina (DOPE) | Avanti, Alabama, USA | 850725 | |
| Microscopio a fluorescenza | Zeiss Axio, Oberkochen, Germania | ||
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germania | 11668019 | |
| Mini estrusore | Avanti, Alabama, USA | ||
| Acqua priva di nucleasi | Qiagen, Hilden, Germania | 129114 | |
| Opti-Mem | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germania | 11058021 | |
| tampone PBS (senza Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germania | 70011044 | |
| Kit di reagenti Quant-iT Ribo Green RNA | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germania | Q33140 | |
| RPMI (senza rosso fenolo) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germania | 11835030 | |
| Gel di silice | Carl Roth, Karlsruhe, Germania | P077 | |
| Tripsina/EDTA (0,05%) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germania | 25300054 | |
| Kit polimerasi HotStar HiFidelity | Qiagen, Hilden, Germania | 202602 | |
| Kit di purificazione QIAquick PCR | Qiagen, Hilden, Germania | 28104 | |
Pseudouridina-5'-Trifosfato (ψ-UTP) | TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1019 | |
| 5-metilcitidina-5'-trifosfato (metil-CTP) | TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1014 | |
| Cianina 3-CTP | PerkinElmer, Baesweiler, Germania | ||
| RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germania | 74104 | |
| Kit di trascrizione MEGAscript T7 | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germania | AM1333 | |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Struttura analogica | New England Biolabs, Ipswich, USA | S1411L | |
| Fosfatasi antartica | Nuovo Inghilterra Biolabs, Ipswich, USA | M0289S | |
| Agarosio | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germania | 16500-500 | |
| GelRed | Biotium, Fremont, USA | 41003 | |
| peqGOLD DNA ladder mix | VWR, Pennsylvania, USA | 25-2040 | |
| Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder | Fisher Scientific, Gö teborg, Svezia | 11528766 |
Riferimenti
- Sahin, U., Kariko, K., Tureci, O. mRNA-based therapeutics--developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).
- Yamamoto, A., Kormann, M., Rosenecker, J., Rudolph, C. Current prospoects for mRNA gene delivery. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 71 (3), 484-489 (2009).
- Williams, P. D., King....
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Ristampe e permessi
