Articolo metodologico

Uso di risonanza paramagnetica elettronica in campioni biologici a temperatura ambiente e 77 K

DOI:

10.3791/58461

⸱

11 gennaio 2019

 ,  ,  ,  , 
1Cardiovascular Pulmonary Research Laboratories and Pediatric Critical Care Medicine, Department of Pediatrics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Bruker BioSpin Corp, 3Department of Medicine, Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt University Medical Center

In questo articolo

Sommario

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Spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica (EPR) è un metodo univoco per misurare i radicali liberi. L'utilizzo di sonde di spin selettiva permette per la rilevazione dei radicali liberi in diversi compartimenti cellulari. Presentiamo un metodo pratico, efficiente per raccogliere campioni biologici che facilitano il trattamento, l'archiviazione e trasferire campioni per misure di EPR.

Abstract

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La rilevazione accurata e specifica delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) in diversi compartimenti cellulari e tessutali è essenziale per lo studio di redox-regolati segnalazione in impostazioni biologiche. Spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica (EPR) è il metodo solo diretto per valutare in modo non ambiguo i radicali liberi. Il suo vantaggio è che rileva i livelli fisiologici di specifiche specie con un'alta specificità, ma richiede tecnologia specializzata, preparazione del campione attento e controlli appropriati per garantire la corretta interpretazione dei dati. Sonde di spin ciclico idrossilammina reagiscono selettivamente con superossido o altri radicali per generare un segnale di nitrossidi che possa essere quantificato mediante spettroscopia EPR. Sonde di spin cellula-permeabile e sonde di spin progettati per accumulare rapidamente nei mitocondri consentono la determinazione della concentrazione di superossido in diversi compartimenti cellulari.

In cellule coltivate, l'uso di 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine permeabili delle cellule (CMH) lungo con e senza pretrattamento di cella-impermeabile superossido dismutasi (SOD) o uso di PEG-SOD cellula-permeabile, consente la differenziazione di extracellulare da superossido citosolico. Il 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido mitocondriale] piperidinium dicloruro (mito-TEMPO-H) permette la misura di ROS mitocondriale (principalmente superossido).

Sonde di spin e spettroscopia EPR possono essere applicati anche ai modelli in vivo . Superossido può essere rilevato in fluidi extracellulari quali il sangue e liquido alveolare, così come tessuti, come tessuto polmonare. Diversi metodi sono presentati per elaborare e conservare il tessuto per misurazioni di EPR e consegnare endovenosa 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) rotazione sonda in vivo. Mentre le misure possono essere eseguite a temperatura ambiente, campioni ottenuti da modelli in vitro e in vivo possono essere conservati a-80 ° C e analizzati da EPR a 77 K. I campioni possono essere memorizzati in stalla tubi specializzati a-80 ° C ed eseguiti a 77 K per consentire un pratico, efficiente e metodo riproducibile che facilita la memorizzazione e trasferimento di campioni.

Introduzione

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Mentre misure dello sforzo ossidativo e specie reattive dell'ossigeno sono importanti per lo studio di diverse malattie attraverso tutti i sistemi dell'organo, la rilevazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) è difficile a causa di una breve emivita e alta reattività. Una tecnica di risonanza paramagnetica elettronica (EPR) dell'elettrone è il metodo più inequivocabile per la rilevazione dei radicali liberi. Sonde di spin hanno vantaggi rispetto le sonde fluorescenti più comunemente utilizzati. Se sonde fluorescenti sono relativamente poco costoso e facile da usare e fornire rilevamento rapido, sensibile di ROS, hanno gravi limitazioni a causa di segnali artifactual, un'incapacità di calcolare le concentrazioni di ROS e una generale mancanza di specificità1 .

Per facilitare l'uso di EPR per gli studi biologici, una varietà di sonde sono stati sintetizzati di spin che può misurare una gamma di specie del radicale libero biologicamente rilevanti nonché pO2, pH e redox afferma2,3, 4,5,6,7. Trappole di spin sono stati sviluppati anche per catturare i radicali di breve durati e durata di vita-forma addotti, che facilita la rilevazione di EPR8. Entrambe le classi (sonde di spin e spin traps) hanno vantaggi e limitazioni. Una classe comunemente usata di sonde di spin sono idrossilammine ciclici, che sono EPR-silent e reagiscono con i radicali di breve durati per formare un nitrossidi stabile. Ciclici idrossilammine reagiscono con superossido 100 volte più veloce di spin trappole, consentendo loro di competere con gli antiossidanti cellulari, ma manca di specificità e richiedono l'uso di adeguati controlli e inibitori per identificare l'origine o specie radicaliche responsabile per il segnale di nitrossidi. Mentre spin intrappola espositivo specificità, con distinte spettrale che modelli a seconda della specie intrappolata, hanno cinetica lenta per spin trapping e sono incline a biodegradazione del radicale del superossido addotti. Applicazioni per il trapping spin sono state ben documentate nella ricerca biomedica9,10,11,12,13.

L'obiettivo di questo progetto è quello di dimostrare metodi EPR pratici per la progettazione di esperimenti e preparazione dei campioni per rilevare superossido utilizzando spin sonde in diversi compartimenti cellulari in vitro e nei compartimenti differenti del tessuto in vivo. Alcuni manoscritti sono pubblicati protocolli pertinenti a questi obiettivi, usando sonde di cellula-permeabile, impermeabile cellulare e mitocondriale spin mirati al tessuto bersaglio diversi compartimenti cellulari in vitro e processo per l'analisi in modelli murini 14 , 15. costruiamo su questo corpo di letteratura convalidando un approccio per misurare superossido utilizzando una sonda di spin (CMH) 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine in diversi compartimenti cellulari in vitro per garantire accurata misurazioni, evidenziando potenziali problemi tecnici che possono falsare i risultati. Forniamo anche metodi per effettuare misurazioni di EPR in sangue, fluido di lavaggio broncoalveolare e tessuto polmonare utilizzando la sonda di spin CMH. Questi studi confrontare diversi metodi per elaborare i tessuti, nonché di presentare un metodo per iniettare un'altra sonda di spin, CPH, topi prima della raccolta del tessuto. Infine, sviluppare un metodo pratico per conservare i campioni in tubi di politetrafluoroetilene (PTFE) per consentire l'archiviazione e il trasferimento dei campioni prima di misurazioni EPR a 77 K.

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Protocollo

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Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dalla University of Colorado Denver istituzionale Animal Care e Comitato di uso.

1. preparazione dei reagenti

  1. Stock di diethylenetriaminepentaacetic acido (DTPA) (150 mM)
    1. Aggiungere 2,95 g di DTPA (393.35 g/mol) a 10 mL di acqua deionizzata.
    2. Per dissolvere DTPA, aggiungere 1 M NaOH goccia a goccia e portare ad un pH di 7.0.
    3. Portare il volume a 50 mL con acqua per una concentrazione finale di DTPA di 150 mM e conservare a 4 ° C.
  2. Soluzione salina tampone fosfato (PBS) (50 mM, pH 7.4)
    1. Preparare 5 M di cloruro di sodio (NaCl) (58.44 g/mol; 29,22 g/100 mL).
    2. Preparare 1 M di potassio fosfato bibasico HK2PO4 (174.18 g/mol; 17,42 g/100 mL)
    3. Preparare 1 M di potassio fosfato monobasico KH2PO4 (136,1 g/mol; 13,61 g/100 mL). Mescolare 3 mL di 5 M di NaCl con 4,24 mL di 1 M di fosfato di potassio dibasico e 0,760 mL di 1 M potassio fosfato monobasico. Controllare il pH.
    4. Portare il volume a 100 mL con acqua deionizzata.
    5. Conservare a temperatura ambiente (TA) per breve periodo (giorni) e a 4 ° C per la conservazione a lungo termine (settimane).
  3. Tampone di Krebs-Henseleit (KHB) contenente 100 µM DTPA
    1. Nella provetta conica per centrifuga da 50 mL, aggiungere 33,3 µ l di soluzione madre di DTPA 150 mM.
    2. Portare a un volume di 50 mL con buffer di Krebs-Henseleit (KHB).
    3. Preparare il tampone di fresco con DTPA ogni giorno e tenerlo a TA.
  4. Tampone Tris-EDTA contenente saccarosio
    1. Preparare brodo di 0.5 M Tris: sciogliere 15,14 g di Tris base (121.14 g/mol) in 150 mL di acqua deionizzata. Utilizzando HCl, regolare il pH a 7,8 e portare ad un volume finale di 250 mL.
    2. Sciogliere 21,4 g di saccarosio (342.29 g/mol; concentrazione finale = 0.25 mM) in 150 mL di acqua deionizzata.
    3. Aggiungere 5 mL di Tris stock di saccarosio per ottenere una concentrazione di Tris finale di 10 mM.
    4. Aggiungere 0,5 mL di brodo di EDTA 0.5 M Tris-saccarosio per ottenere una concentrazione finale di 1 mM.
    5. Controllare il pH e regolarlo a 7,4.
    6. Portare ad un volume finale di 250 mL con acqua deionizzata e conservare a 4 ° C.
  5. Eritrociti di origine bovina stock di Cu/Zn superossido dismutasi (SOD) (30.000 U/mL)
    1. Ricostituire 30.000 U di SOD in 1 mL di PBS (circa 5,7 mg, a seconda dell'attività del lotto SOD).
    2. Mescolare bene, aliquotare e conservare a-20 ° C per a breve termine (6-12 mesi) e a-80 ° C per la conservazione a lungo termine.
  6. Soluzione di lavoro di SOD (1000 U/mL)
    1. Trasferire un'aliquota di 30 µ l di 30.000 stock SOD U/mL in un 870 µ l di PBS sterile.
    2. Mantenere la soluzione sul ghiaccio e usarlo fresco.
  7. Stock di phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA) (5 mM)
    1. Sciogliere 1 mg di PMA (616.83 g/mol) in µ l 325 di DMSO (concentrazione finale = 5 mM).
    2. Aliquota di una soluzione PMA di 5 mM e conservare a-20 ° C.
  8. Soluzione di lavoro di PMA (125 µM)
    1. Diluire un'aliquota di 10 µ l di Stock in PMA di 5 mM in 390 µ l di PBS sterile.
    2. Mantenere la soluzione sul ghiaccio e usarlo fresco.
    3. Per un controllo del veicolo per PMA, utilizzare 10 µ l di DMSO in 390 µ l di PBS.
  9. Cloruro di diphenyliodonium (DIP) (2,5 mM)
    1. Sciogliere 3,2 mg di tuffo (316.57 g/mol) in 4 mL per ottenere uno stock di 2,5 mM.
    2. Preparare la soluzione e usarlo fresco.
  10. Deferoxamina mesilato sale (DFO) (20 mM)
    1. Sciogliere 4,5 mg di DFO (656,79 g / mol) in µ l 340 per ottenere uno stock di 20 mM.
    2. Preparare la soluzione e usarlo fresco.
  11. Preparazione di antimycin stock A (AA) (5 mM)
    1. Sciogliere 5,4 mg di AA (532 g/mol) in 2 mL di etanolo (concentrazione finale = 5 mM).
    2. Aliquota del titolo in fiale di vetro e conservare a-20 ° C.
  12. Preparazione delle sonde di spin
    1. Bolla 50mm fosfato tampone contenente 100 µM DTPA con azoto per 30 min per rimuovere l'ossigeno disciolto dal buffer.
    2. Rimuovere la sonda di spin dal congelatore a-20 ° C e lasciare il contenitore di venire a RT (10-15 min).
    3. Pesare 2,4 mg di 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine· HCl (CMH) (237,8 g/mol)
    4. Sciogliere CMH in 1 mL di tampone fosfato deossigenato per una concentrazione finale di 10 mM.
    5. Pesare 5 mg di dicloruro di 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium (mito-TEMPO-H) (529.1 g/mol).
    6. Sciogliere mito-TEMPO-H in 1 mL di tampone fosfato deossigenato per una concentrazione finale di 9,5 mM.
    7. Pesare 4,9 mg di 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine· HCl (CPH) (223.7 g/mol).
    8. Sciogliere CPH in 1 mL di tampone fosfato deossigenato per una concentrazione finale di 22 mM.
    9. Aliquotare e conservare a-80 ° C (gelo-disgelo non è raccomandato).

2. rilevamento di superossido in vitro

  1. Rilevamento di totale, extracellulare e intracellulare superossido in PMA-stimolato 264.7 celle grezze a RT
    1. A seguito di un'adeguata tecnica asettica, scongelare 264.7 celle grezze e loro passaggio nei media DMEM completati con 10% FBS (bassa endotossina-libera) e 1% antimicotico/ampicillina a 37 ° C in incubatore a CO2 .
    2. Seme 264.7 celle grezze a 1 x 106 cellule/pozzetto in piastre da 6 pozzetti un giorno prima del trattamento.
    3. Delicatamente rimuovere e lavare le cellule una volta con 1 mL di tampone KHB.
    4. Aggiungere KHB contenente 100 µM DTPA in ciascun pozzetto e trattare in un volume totale di 500 µ l con il seguente:
    5. Per pozzi pretrattati con SOD, aggiungere 15 µ l/pozzetto di soluzione di lavoro di SOD (1000 U/mL; concentrazione finale di SOD = 30 U/mL) e incubare per 10 min a 37 ° C prima dell'aggiunta di CMH e PMA.
    6. Aggiungere 12,5 µ l/pozzetto di stock CMH 10mm (concentrazione finale = 0,25 mM).
    7. Aggiungere 40 µ l/pozzetto di soluzione di lavoro 125 µM PMA (concentrazione finale = 10 µM) o 40 µ l veicolo (magazzino 10 µ l di DMSO in 390 µ l di PBS).
    8. Incubare per 50 min a 37 ° C in un incubatore a CO2 .
    9. Rimuovere le piastre dall'incubatrice e metterli immediatamente in ghiaccio.
    10. Raccogliere buffer da ogni pozzetto in separata, 1,5 mL, provette. Tenere il ghiaccio in tutto.
    11. Aggiungere 100 µ l di tampone KHB fresco contenente 100 µM DTPA, delicatamente raschiare le cellule e risospendere pipettando su e giù più volte. Tenere il ghiaccio in tutta risospensione delle cellule.
    12. Carico del campione raccolto nei passaggi 2.1.10 e 2.1.11 (50 µ l) in ciascuna delle provette capillari. Entrambe le estremità della guarnizione ed eseguire l'EPR.
      Nota: Sempre una provetta o bene (senza cellule) contenente la sonda nel buffer (stessa concentrazione = 0,25 mM), trattati alle stesse condizioni come le cellule (stesso tempo di incubazione e temperatura) come un controllo, poiché la priorità bassa intensità della sonda è temperatura - e tempo-dipendente.
    13. Impostare i parametri di acquisizione EPR seguenti: frequenza di microonda = 9,65 GHz; centro campo = 3432 G; ampiezza di modulazione = 2,0 G; larghezza di spazzata = 80 G; Potenza microonde = 19,9 mW; numero totale di scansioni = 10; tempo di spazzata = 12.11 s; e costante di tempo = 20,48 ms.
  2. Rilevamento di superossido mitocondriale in 264.7 celle grezze
    1. Seguire i passaggi 2.1.1 e 2.1.2 per seme 264.7 celle grezze un giorno prima dell'esperimento.
    2. Rimuovere i supporti e lavare le cellule una volta con 1 mL di tampone KHB.
    3. Aggiungere 200 µ l di KHB contenente 100 µM DTPA in ciascun pozzetto.
    4. Aggiungere 5,3 µ l/pozzetto di stock di mito-TEMPO-H 9,5 mM (concentrazione finale = 0,25 mM)
    5. Incubare per 10 min a RT.
    6. Aggiungere 1 µ l/pozzetto di antimycin A (AA), soluzione di riserva di 5 mM in etanolo (concentrazione finale = 25 µM).
    7. Incubare per 50 min a 37 ° C in un incubatore a CO2 .
    8. Rimuovere le piastre dall'incubatrice e metterli immediatamente in ghiaccio.
    9. Delicatamente le cellule di raschiare e risospendere pipettando su e giù. Tenere il ghiaccio.
    10. Caricare il campione in un tubo capillare. Entrambe le estremità della guarnizione.
    11. Vedere la sezione precedente per impostazione di EPR.
  3. Rilevamento di superossido in 264.7 celle grezze a 77 K
    1. Posto il buffer raccolte al passo 1.1.10 pre-preparati PTFE tubi 1-2 pollici di lunghezza (3/16" diametro x 1/8" ID). Assicurarsi che la tubazione di PTFE è dritta, quindi può essere facilmente inserito e rimosso dal dito dewar. Utilizzare un tappo di gomma per chiudere un'estremità del tubo di PTFE, pipettare il buffer o sospensione cellulare (100-150 µ l) nella tubazione di PTFE e sigillare il tubo con un tappo di secondo.
    2. Freeze Flash il campione in azoto liquido. Il campione può essere trasferito in una provetta con etichetta crioconservazione per conservazione a-80 ° C o eseguire immediatamente.
    3. Riempire il dito dewar con azoto liquido e inserire il tubo di PTFE contenente il campione nella barretta dewar. Assicurarsi che il campione sia centrato nello spazio attivo del risonatore ed eseguire EPR a 77 K.
      Nota: Avviare il flusso di gas di azoto a tuo spettrometro 15-30 min prima le misurazioni e continuare questo flusso in tutto le misure per impedire la condensazione di acqua nel risonatore.
    4. Impostare i parametri di acquisizione EPR seguenti: frequenza di microonda = 9,65 GHz; centro campo = 3438 G; ampiezza di modulazione = 4,0 G; spazzare larghezza = 150 G; Potenza microonde = 0.316 mW; numero totale di scansioni = 10; tempo di spazzata = 60 s; e costante di tempo = ms 1,28.

3. EPR misure in liquidi

  1. Sangue intero
    1. Trattamento di topi (8-12 settimane) con una singola dose di bleomicina endotracheale (Bleo; 100 µ l a 1 U/mL) disciolto in PBS o PBS da solo come descritto in precedenza16,17.
    2. Eutanasia topi somministrando per via inalatoria isoflurano (1.5-4%) seguito da dissanguamento e dislocazione cervicale. Aspirare il sangue attraverso il ventricolo di destra in una siringa rivestita con eparina (1000 USP/mL) contenenti 100 µM DTPA e trasferirlo in una provetta da 1,5 mL.
    3. In un tubo separato da 1,5 mL, aggiungere 15 µ l di PBS contenente 100 µM DTPA e 3 µ l di CMH (10 mM) a 132 µ l di sangue per un volume totale di 150 µ l e concentrazione di CMH finale di 0,2 mM.
    4. Incubare il sangue per 10 min a 37 ° C in un bagno d'acqua.
    5. Togliere le provette dal bagnomaria.
    6. Prendere un'aliquota di sangue in un tubo capillare di carico ed eseguire EPR a RT con i seguenti parametri di acquisizione EPR: microonde frequenza = 9,65 GHz; centro campo = 3432 G; ampiezza di modulazione = 1,0 G; larghezza di spazzata = 80 G; Potenza microonde = 19,9 mW; numero totale di scansioni = 3; tempo di spazzata = 12.11 s; e costante di tempo = 20.48 ms. in alternativa, i campioni possono essere flash congelati come descritto nel passo 2.3 per misurazioni a 77 parametri di acquisizione di K. EPR sono i seguenti: frequenza di microonda = 9,65 GHz; centro campo = 3438 G; ampiezza di modulazione = 4,0 G; spazzare larghezza = 150 G; Potenza microonde = 0.316 mW; numero totale di scansioni = 2; tempo di spazzata = 60 s; e costante di tempo = ms 1,28.
  2. Fluido di lavaggio broncoalveolare (BALF)
    1. Dopo l'eutanasia (Vedi punto 3.1.2), raccogliere BALF lentamente instillando e prelevare 1 mL di PBS contenente 100 µM DTPA tre volte in una siringa tramite una cannula inserita nella trachea.
    2. In una provetta da 1,5 mL, trattare 200 µ l di BALF con 4 µ l di CMH (10 mM) per ottenere una concentrazione finale di 0,2 mM.
    3. Incubare BALF per 50 min a 37 ° C in un bagno d'acqua.
    4. Prendete i tubi dal bagno di acqua e metterli sul ghiaccio.
    5. Carico BALF in un tubo capillare ed esecuzione EPR a RT con le stesse impostazioni di EPR come utilizzato nel passo 1.1.13, o flash congelato in azoto liquido, come descritto al punto 2.3.
  3. Misure EPR in sangue e BALF a 77 K
    1. Seguire il protocollo di cui sopra per raccogliere il sangue (punti 3.1.1. a 3.1.4) e BALF (passaggi 3.2.1 a 3.2.4).
    2. Posto 150 µ l di sangue trattato o BALF in PTFE tubi (in 1-2). Utilizzare un tappo di gomma per chiudere un'estremità del tubo di PTFE prima dell'aggiunta del campione e un altro tappo per sigillare il tubo.
    3. Freeze Flash il campione in azoto liquido.
    4. Vedere la sezione 2.3 per dettagli sull'esecuzione di EPR in campioni congelati in tubazione di PTFE usando il dito che Dewar a 77 K. Run congelati CMH trattati con i campioni di sangue in una settimana.

4. EPR misurazioni sul tessuto polmonare

  1. Flash del tessuto polmonare congelati
    1. Dopo aver raccolto il BALF al punto 3.2.1, viene aperto il torace e polmoni lavata con 10 mL di PBS freddo tramite ventricolo destro per rimuovere il sangue. Freeze Flash il tessuto polmonare in azoto liquido. Tessuto polmonare congelati sono memorizzabili a-80 ° C fino a 6 mesi fino all'utilizzo per misure di EPR.
    2. Stabilizzare il tessuto polmonare su ghiaccio secco con una pinzetta e tagliare i pezzi più piccoli (5-15 mg) del tessuto polmonare con una lama tagliente.
    3. Pesare il tessuto in una provetta da 1,5 mL, collocare la provetta sulla scala e tarare la bilancia, quindi aggiungere i pezzi di tessuto e registrare il peso.
    4. Il tessuto nel tubo da 1,5 mL, aggiungere µ l 196 di KHB contenenti DTPA e 4 µ l di CMH (0,2 mM) per ottenere un volume totale di 200 µ l.
    5. Incubare per 1h a 37 ° C in un bagno d'acqua.
    6. Rotazione verso il basso (per pochi secondi) in una microcentrifuga a 3.884 x g.
    7. Mettere sul ghiaccio e dispensare 150 µ l del surnatante nella tubazione di PTFE e congelare per le misurazioni di 77 K, come descritto nella sezione 2.3.
      Nota: Per questo metodo, l'eterogeneità della ferita deve essere considerata. Per una lesione polmonare indotta da bleomicina, dato che è una lesione altamente eterogenea, è consigliabile tagliare diversi pezzi di tessuto provenienti da diverse parti del polmone da ogni mouse. In alternativa, un pezzo più grande del tessuto può essere omogeneizzato in tampone KHB 100 µM DTPA con un rapporto di 1:6 peso / volume (mg / µ l) come descritto di seguito.
  2. Tessuto polmonare fresco conservato nel buffer di saccarosio
    1. Svuotare i polmoni lavati con PBS freddo per rimuovere il sangue come fatto al punto 3.1.2.
    2. Omogeneizzare il tessuto polmonare fresco in tampone Tris-EDTA contenente saccarosio 0,25 M con un rapporto polmone/buffer (mg / µ l) di 1:6 lisata tessuto macinino con un vetro o un pestello PTFE.
    3. Aggiungere 50 µ l dell'omogeneato del polmone a 450 µ l di KHB contenente 100 µM DTPA.
    4. In una provetta da 1,5 mL (in un volume totale di 100 µ l), a 98 µ l di omogenato di polmone in KHB, aggiungere 2 µ l di CMH di stock di 10 mM per ottenere una concentrazione finale di 0,2 mM.
    5. Incubare per 20 min a 37 ° C in un bagno d'acqua.
    6. I campioni su ghiaccio e caricarli in un tubo capillare. Eseguire EPR al RT (impostazioni utilizzate nel passaggio 2.1.13).
    7. Per verificare il contributo di specie specifiche e fonti utilizzando diversi inibitori, pretrattare 88 µ l di omogenato di polmone + /-inibitore, regolazione con KHB per ottenere un volume finale di 98 µ l. In questo esperimento, gli inibitori incluso 10 µ l di SOD (100 U/mL), 4 µ l di deferoxamina (DFO; concentrazione finale = 800 µM), o 4 µ l di cloruro di diphenyliodonium (DIP; concentrazione finale = 100 µM). Incubare per 20 min a 37 ° C in un bagno d'acqua.
    8. Aggiungere 2 µ l di CMH ed incubare per un altro 20 min a 37 ° C, seguita da misure EPR come descritto sopra. Includere un campione in bianco abbinato una tantum con CMH KHB contenente saccarosio tampone. In alternativa, conservare le aliquote degli omogeneati del polmone rimanente (punto 3.1.2) a-80 ° C per le misurazioni successive.
      Nota: Il volume totale può essere scalato come necessario.
  3. Misure EPR il tessuto polmonare da topi iniettati con filare sonde in vivo (a RT utilizzando delle cellule del tessuto)
    1. Preparare soluzione stock CPH sciogliendo 4,9 mg di CPH in 1 mL di tampone fosfato filtrato e deossigenato 50 mM.
    2. Anestetizzare topi con isoflurano inalato (1.5-4%) per 20-30 secondi fino a quando non risponde alla punta pizzico. Iniettare la rotta di topi tramite retroorbital con 100 µ l di sonda spin CPH per un peso corporeo di 25 g del mouse (dose finale = 20 mg/kg) e permettere alla sonda di circolare per 1 h. immediatamente dopo l'iniezione retroorbital, aggiungere una goccia di 0.5% proparacaine HCl sulla zona del contorno occhi per preve dolore oculare NT e secchezza. Monitorare i topi per 1 h e procedere alla raccolta del tessuto.
    3. Raccogliere il tessuto polmonare, come descritto in precedenza e flash congelare i polmoni.
    4. Tagliare 20-30 mg di tessuto congelato su ghiaccio secco e registrare il peso esatto.
    5. Pulire delicatamente il tessuto con salviettine per assorbire l'acqua superficiale.
    6. Posizionare il tessuto all'interno della finestra della cella del tessuto (un accessorio permette misurazioni EPR per campioni di tessuto) ed eseguire EPR per determinare il totale giri. I dati possono essere espresso come totali giri per mg di tessuto.

5. analisi dei dati

  1. Simulare gli spettri EPR utilizzando SpinFit modulo incorporato nel software Xenon dello spettrometro EPR EMXnano banco. Determinare la concentrazione di nitrossidi dal modulo SpinCount. In alternativa, può essere fatta una curva di calibrazione di una stabile nitrossidi come 4-idrossi-TEMPO o TEMPOL e la concentrazione può essere ottenuta confrontando l'intensità del segnale con il campione e standard.
  2. Per i dati raccolti a 77 K, utilizzare doppia integrazione seguita da SpinCount.

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Risultati

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Rilevamento di superossido utilizzando CMH è stata convalidata utilizzando la X / superossido XO generando sistema per dimostrare che il segnale di nitrossidi (CM..) completamente è stato inibito da SOD, mentre catalasi non ha avuto effetto (Figura 1A). Il superossido totale, extracellulare è stata quindi valutato in 264.7 celle grezze di incubazione le cellule con la sonda di spin CMH cellula-permeabile + /-pretrattamento di SOD. La concentrazione...

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Discussione

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La valutazione della produzione di radicali liberi nelle impostazioni biologiche è importante nella comprensione regolato segnalazione redox in salute e malattia, ma la misura di queste specie è estremamente impegnativo a causa della breve emivita di specie del radicale libero e tecnici limitazioni con metodi comunemente utilizzati. L'EPR è uno strumento prezioso e potente in biologia redox, poichè è il metodo solo non ambiguo per la rilevazione dei radicali liberi. In questo progetto, dimostriamo metodi EPR pratici per ...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato dalla University of Colorado at Scuola di medicina Dean di infrastrutture di ricerca strategiche award, R01 HL086680-09 e 1R35HL139726-01, al E.N.G e UCD CFReT premio fellowship (lui). Gli autori ringraziano il Dr. Sandra Eaton e Dr. Gareth Eaton (Università di Denver), Dr. Gerald Rosen e Dr. Joseph P. Kao (Università del Maryland), Dr. Sujatha Venkataraman (University of Colorado Denver) per utili discussioni e Joanne Maltzahn, Ashley Trumpie e Ivy McDermott (University of Colorado Denver) per il supporto tecnico.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMEMLifeTech10566-016terreni di coltura cellulare
Acido dietilentriamminapentaacetico (DTPA)Sigma AldrichD6518-5G
cloruro di sodio (NaCl) Fisher Scientific   BP358-212utilizzato per preparare 50 mM di tampone salino fosfato secondo Sigma aldrish  
fosfato di potassio bibasico (HK2PO4 )Fisher Scientific   BP363-500utilizzato per preparare 50 mM di tampone salino fosfato secondo Sigma aldrish  
fosfato di potassio monobasico (KH2PO4 )Sigma AldrichP-5379utilizzato per preparare 50 mM di tampone salino fosfato secondo Sigma aldrish...  
Buffer di Krebs-Henseleit (KHB) (Alfa Aesar, Hill)J67820
Superossido dismutasi eritrocitario bovino (SOD)Sigma Aldrich  S7571-30KU
Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA) Sigma AldrichP1585-1MGSciogliere in DMSO
Antimicina A (AA)Sigma AldrichA8674-25MGSciogliere in etanolo e conservare in fiale di vetro (MW utilizzato è il peso molecolare medio per quattro lotti)
1-idrossi-3-metossicarbonil-2,2,5,5-tetrametilpirrolidina . HCl (CMH)Enzo Life SciencesALX-430-117-M050
1-idrossi-3-carbossi-2,2,5,5-tetrametilpirrolidina . HCl (CPH)Enzo Life SciencesALX-430-078-M250
1-idrossi-4-[2-trifenilfosfonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetrametilpiperidina, 1-idrossi-2,2,6,6-tetrametil-4-[2-(trifenilfosfonio)acetamido]piperidinio dicloruro ( mito-TEMPO-H)Enzo Life SciencesALX-430-171-M005
cloruro di 1-idrossi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-4-il-trimetilammonio . HCl (CAT1H)Enzo Life SciencesALX-430-131-M250
Eparina Sagent PharmaceuticalsNDC 25021-400-10
Cloruro di difenilidonio Sigma Aldrich43088
Deferoxamin sale mesilatoSigma AldrichD9533-1G
CritosealLeica39215003
MARCA monouso BLAUBRAND  micropipette, inintraMarkSigma Aldrich 708733Capillari
PTFE FRAZIONATO FLUOROPOLIMERO TUBANTI
3/16" OD x 1/8" ID		NORELL1598774ATubo in teflon 
TAPPI IN GOMMA SILICONICA PER PROVETTE PER CAMPIONI NMR  PER TUBI A PARETE SOTTILE CON DIAMETRO ESTERNO DI 4 mm-5 mm (da 3,2 mm a 4,2 mm ID) TS-4-5-SRNORELL94987
EMXnano Spettrometro EPR da bancoBruker BioSpin GmbHE7004002
EMX NANO TISSUE CELLBruker BioSpin GmbHE7004542

Riferimenti

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  6. Epel, B., et al. Imaging thiol redox status in murine tumors in vivo with rapid-scan electron paramagnetic resonanc. Journal of Magnetic Resonance. 276, 31-36 (2017).
  7. Legenzov, E. A., Sims, S. J., Dirda, N. D. A., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y. Disulfide-Linked Dinitroxides for Monitoring Cellular Thiol Redox Status through Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy. Biochemistry. 54 (47), 6973-6982 (2015).
  8. Abbas, K., et al. Medium-throughput ESR detection of superoxide production in undetached adherent cells using cyclic nitrone spin traps. Free Radical Research. 49 (9), 1122-1128 (2015).
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  10. Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor'ev, I. A. EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines. Free Radical Research. 45 (4), 417-430 (2011).
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