Articolo metodologico

Un modello In Vitro di un sistema di perfusione di piatti paralleli per studiare l'aderenza batterica per l'innesto di tessuti

DOI:

10.3791/58476

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7 gennaio 2019

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1Cardiovascular Developmental Biology, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven, 2Centre for Molecular and Vascular Biology, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven, 3Department of Biohybrid & Medical Textiles, AME - Helmholtz Institute for Biomedical Engineering, RWTH Aachen University, 4European Homograft Bank, Saint Jean Clinique, 5Division of Clinical Cardiac Surgery, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven

In questo articolo

Sommario

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Descriviamo un interno progettato in vitro camera modello di flusso, che permette l'indagine di aderenza batterica all'innesto di tessuti.

Abstract

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Vari Tubi valvolati e stent-montate valvole sono utilizzati per sostituzione della valvola di efflusso del ventricolo destro (RVOT) del tratto in pazienti con cardiopatia congenita. Quando si utilizza materiali protesici tuttavia, questi innesti sono suscettibili di infezioni batteriche e varie risposte dell'ospite.

Identificazione dei fattori batterici e host che svolgono un ruolo vitale in endovascular aderenza dei microrganismi è di importanza per comprendere meglio la fisiopatologia di insorgenza di infezioni come l'endocardite infettiva (IE) e di sviluppare misure preventive strategie. Pertanto, lo sviluppo di modelli competenti a indagare adesione batterica in condizioni fisiologiche taglio è necessario. Qui, descriviamo l'uso di una nuova concezione in vitro aspersione camera basato su piastre parallele che permette che lo studio di aderenza batterica ai diversi componenti dei tessuti dell'innesto esposto come matrice extracellulare, cellule endoteliali e zone inerti . Questo metodo combinato con formazione di colonie (CFU) contando unitàè adeguato per valutare la propensione di materiali d'innesto all'adesione batterica sotto flusso. Ulteriormente, il sistema dell'alloggiamento di flusso potrebbe essere utilizzato per studiare il ruolo di emocomponenti in adesione batterica in condizioni di taglio. Abbiamo dimostrato che l'origine del tessuto, loro morfologia superficiale e la specificità di specie batteriche non sono i principali fattori determinanti in aderenza batterica all'innesto di tessuti utilizzando il nostro modello di aspersione in-House progettata in vitro .

Introduzione

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Staphylococcus aureus (S. aureus) impiega una varietà di strategie di virulenza di aggirare il sistema di difesa immunitaria ospite colonizzando superfici biologiche o non biologici impiantate nella circolazione umana, che porta a gravi infezioni intravascolari come sepsi e IE1,2,3,4,5. Resti di IE un importante trattamento complicanze nei pazienti dopo l'impianto di valvole cardiache protesiche mentre singoli fattori che contribuiscono all'insorgenza di IEare non ancora pienamente compreso6,7. In condizioni di flusso, batteri ritrovarvi con le forze di taglio, di cui hanno bisogno per superare allo scopo di rispettare il vaso muro8. Modelli, che consentono di studiare l'interazione tra batteri e tessuto della valvola prostetica o endotelio sotto flusso, sono di interesse in quanto riflettono la situazione in vivo più.

Parecchi meccanismi specifici facilitano l'aderenza batterica alle cellule endoteliali (ECs) e alla matrice subendothelial esposta (ECM) che porta alla colonizzazione dei tessuti e alla maturazione delle vegetazioni, essendo essenziali punti iniziali in IE9. Varie proteine di superficie stafilococciche o MSCRAMMs (microbiche superficiale componenti riconoscere molecole matrice adesiva) sono stati descritti come mediatori di adesione di cellule dell'ospite e di proteine ECM interagendo con le molecole come fibronectina, fattore di fibrinogeno, collagene e von Willebrand (VWF)8,10,11. Tuttavia, in considerazione di pieghevole intra-molecolari di alcuni fattori di virulenza, per lo più studiati in condizioni statiche, molte di queste interazioni possono avere rilevanza diversa nelle infezioni endovascolari nel sangue circolante.

Pertanto, vi presentiamo un interno progettato in vitro flusso parallelo-piastra camera modello, che permette di valutare l'aderenza batterica ai diversi componenti della ECM ed ECs nel contesto degli innesti del tessuto impiantato in posizione RVOT. L'obiettivo generale del metodo descritto in questo lavoro è quello di studiare i meccanismi di interazione tra batteri e tessuti sottostanti endovascular in condizioni di flusso, che sono strettamente legate all'ambiente in vivo degli agenti patogeni di circolazione sanguigna come S. aureus. Questo nuovo approccio si concentra sulla suscettibilità delle superfici di tessuto di innesto di aderenza batterica per identificare potenziali fattori di rischio per lo sviluppo di Internet Explorer.

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Protocollo

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1. preparazione dell'innesto tessuti per studi In Vitro

Nota: Sono stati utilizzati tre tipi di tessuti: innesti crioconservati omotrapianto (CH) e la vena giugulare bovina (BJV), patch di pericardio bovino (BP). In caso di BJV conduit e CH (tessuto trattati da Banca europea di omotrapianto (EHB) e conservati in azoto liquido prima dell'uso), sono stati utilizzati valvolari sia a parete. Patch di BP e BJV condotto sono stati acquistati dai produttori. Prima dell'uso, scongelare il CH seguendo le istruzioni di EHB12.

  1. Lavare tutti i tessuti con NaCl 0,9% prima dell'uso.
  2. Preparare le biopsie del tessuto utilizzando una biopsia della pelle monouso pugno per tagliare pezzi di tessuto circolare (diametro 10 mm).
  3. Tagliare tutte le patch di tessuto alla stessa altezza utilizzando il bisturi sterile monouso.
  4. Per i tessuti fissati con glutaraldeide (ad esempio conduit BJV), incubare innesto pezzi durante la notte a 4 ° C a 200 g/L di albumina umana per neutralizzare il fissativo.
  5. Lavare residui di glutaraldeide con 0,9% NaCl in micropiastra.  Ripetere 3 volte per 1 minuto.

2. preparare i batteri per esperimenti di perfusione

Nota: Tre isolati batterici sono stati utilizzati: S. aureus Cowan (ATCC 12598), s. epidermidis ATCC 149900 e S. sanguinis NCTC 7864. S. aureus e S. epidermidis sono state coltivate a 37 ° C in brodo di soia triptico (TSB) e S. sanguinis era cresciuta a 37 ° C con 5% CO2 in brodo di cervello cuore infusione (BHI).

  1. Preparare una notte cultura di batteri su una piastra di agar sangue solido.
    1. Utilizzare un'ansa sterile per raschiare i batteri congelati e inoculare su una piastra di agar sangue di Mueller-Hinton per cultura durante la notte a 37 ° C.
  2. Utilizzare un ciclo di inoculazione sterile per prendere una singola Colonia dalla coltura agar-sangue durante la notte e inoculare in 10 mL di TSB o BHI in un tubo da 14 mL e cultura durante la notte a 37 ° C.
  3. Centrifugare il pernottamento culture (3000 x g, 4 ° C, 10 min) e risospendere il pellet in 10 mL di tampone fosfato salino (PBS). Inserire le provette mL 14 sul ghiaccio.
  4. Un'aliquota di 3,7 mg/mL di soluzione di 5 (6) - carbossi - fluorescina N-idrossi-succinimidyl ester (CF) in etanolo di preparare e conservare a-20 ° C. Diluire ulteriormente il brodo del CF a 150 µ g/mL utilizzando 'ultrapura' acqua.
    Nota: Proteggere tubi dalla luce utilizzando il foglio di alluminio e conservare a-20 ° C.
  5. Centrifugare i batteri (3000 x g, 4 ° C, 10 min) e risospendere il pellet in 800 µ l di PBS e aggiungere 200 µ l della soluzione CF 150 µ g/mL (concentrazione finale di 30 µ g/mL, usato per esperimenti di perfusione). Proteggere i tubi dalla luce con carta stagnola e incubare per 30 minuti, utilizzando un agitatore orbitale.
  6. Dopo l'etichettatura, bloccare con 2% di soluzione di albumina di siero bovino (BSA) in PBS e spin (3000 x g, 4 ° C, 10 min). Seguire con un passaggio di lavaggio utilizzando 10 mL di PBS e pellet batteri mediante centrifugazione (3000 x g, 4 ° C, 10 min).
  7. Diluire i batteri con PBS per ottenere 107 unità formanti colonie (CFU) /mL (verificato CFU contando su piastre di agar sangue di Mueller-Hinton), che corrisponde ad un OD600 (densità ottica) pari a 0,65. Mantenere le provette nel buio sul ghiaccio prima di esperimenti di perfusione.
    Nota. Tenete a mente che misure600 OD riflettono il numero approssimativo dei batteri. Per contare la dose efficace inoculazione, il metodo di diluizione seriale è un ulteriore passaggio necessario per verificare il diametro esterno basato su numeri come descritto nella sezione 3.8.

3. in vitro gli esperimenti di perfusione utilizzando una camera di flusso parallelo-piastra

  1. Montare le biopsie del tessuto di 10 mm di diametro e lo stesso spessore (preparato nei passaggi 1.1-1.5) in un sistema di flusso dell'alloggiamento con la superficie interna rivolta verso l'alto per entrare in contatto con la sospensione batterica.
    Nota: Lo stesso spessore del tessuto attraverso vari innesti assicura che la stessa altezza del tessuto è raggiunto nel canale permettendo a flusso laminare in tutte le condizioni. Tutti gli elementi della camera del flusso sono presentati e descritti nella Figura 1.
    1. Per iniziare il protocollo, posizionare il pezzo di tessuto rotondo tra un vetrino da microscopio con una perforazione circolare di 8 mm e una guarnizione in gomma.
      Nota: Il vetrino da microscopio possiede il film ultra-sottile inferiore per consentire la generazione del foro 8 mm. Insieme con il foglio di gomma, si corregge il tessuto per consentire il contatto diretto tra il campione e mezzo fluente e impedisce anche la dislocazione della biopsia durante l'esperimento. La superficie del tessuto oggetto dell'inchiesta, che è esposto al flusso (diametro inferiore) non può essere manipolata dal forcipe.
    2. Inserire il supporto con il tessuto il foglio di guarnizione che è incorporato nel frame inferiore in metallo della camera.
    3. Fissare il telaio di metallo superiore con il corrispondente foglio di guarnizione sulla parte inferiore della camera con il portarotolo inserite in precedenza. Successivamente montare l'intera camera con otto viti ed avvitare i dadi. Assicurarsi che l'altezza della camera è sempre lo stesso da altra parte gli innesti.
      Nota: L'altezza della camera dovrebbe essere determinato sempre al momento di serraggio delle viti. Utilizzare una pinza o un righello.
  2. Collegare la camera di flusso con una pompa peristaltica e il serbatoio del liquido con i tubi.
  3. Irrorare i tessuti con sospensioni di 107 CFU/mL (verificato CFU contando e legate alla OD600 misurazioni) fluorescente-identificati batteri in PBS con una sollecitazione di taglio di 3 dyne/cm2 (dyne per centimetro quadrato unità di pressione) da mezzi della pompa peristaltica (portata: 4 mL/min) per 1h facendo uso di un serbatoio batterica 400 mL (in-House design, Figura 1) condizionato a 37 ° C, utilizzando un termostato piastra (Tabella materiali).
  4. Continuamente ricircolare la sospensione batterica 100ml utilizzando il serbatoio di raccolta stesso.
  5. Dopo aspersione, smontare la camera per rilasciare la protesi e lavare il pezzo di tessuto due volte con 4 mL di PBS in un piatto di 12-pozzetti utilizzando l'agitatore orbitale di laboratorio per 3 minuti ciascuno. Successivamente tagliare la parte interna dell'innesto usando una biopsia della pelle punzone di un diametro inferiore.
  6. Posizionare ogni biopsia del tessuto in un tubo separato 14 mL contenente 1 mL di sterile 0,9% NaCl. Etichettare la provetta come #1.
  7. Staccare i batteri dal tessuto usando un bagno di sonicazione per 10 min (ampiezza = 100% e frequenza = 45 kHz).
    Nota: Completo distacco dei batteri dal tessuto innesti dovrebbero essere valutati sopra incubazione di patch durante la notte a 37 ° C in mezzo liquido TSB, seguita da misure600 OD rispetto per controllare le patch trattate con una soluzione gratuita di batteri.
  8. Utilizzare un metodo di diluizione seriale su piastre di agar sangue di Mueller-Hinton per contare CFUs.
    1. Preparare una provetta singola 14 mL con 10 mL di soluzione fisiologica sterile per effettuare diluizioni seriali della sospensione batterica ottenuta dopo sonicazione. Etichettare questo tubo come #2.
      Nota: Per ogni un provetta esperimento di tessuto con 10 mL di 0,9% NaCl è necessaria.
    2. Preparare tre provette di 14 mL con 10 mL di sterile 0,9% NaCl per diluizioni seriali di sospensione batterica iniziale dal punto 2.7. Etichettare le provette come segue #3, #4, #5.
      Nota: Questo passaggio è necessario conoscere il reale numero CFU in sospensione batterica utilizzato per l'esperimento di aspersione.
    3. Vortice mescolare ogni tubo per 15 s. Vortex le provette con la biopsia del tessuto, nonché la sospensione batterica iniziale per effettuare diluizioni seriali.
    4. Preparare tre piastre di agar, due per l'esperimento di tessuto (aspersione di batteri e aspersione di controllo di PBS) e la terza per la sospensione batterica iniziale utilizzata per le aspersioni.
    5. Etichetta tre settori per piastra per l'esperimento di tessuto nel seguente modo 10-1, 10-3 e 10-4. Per contare il numero di CFU nella perfusati batterica, la targhetta di etichettatura come segue: 10-1, 10-3, 10-5 e 10-7.
      Nota: Tutte le indicazioni sull'agar piastre come 10-1, 10-3 e così via si riferiscono al numero finale di CFU/mL calcolato il giorno successivo. Piastra di controllo non richiede tutti i settori. Prima dell'uso, piastre di agar sangue dovrebbero essere posto sotto la cappa laminare e aperto per rimuovere l'umidità in eccesso.
    6. Per continuare la preparazione delle diluizioni seriali, trasferire 100 µ l di filmato #1 filmato #2 e mescolare energicamente con vortice.
    7. Sviluppa 100 µ l del contenuto del filmato #1 e #2 sui corrispondenti settori 10-1 e 10-3 della piastra di agar. Allo stesso modo, diffondere 10 µ l di filmato #2 sul settore 10-4, ripetere questo passaggio 4 volte per ottenere 4 crescite separate da ogni volume di 10 µ l.
      Nota: A causa del piccolo volume usato per la placcatura sul settore 10-4, si consiglia di avere più numero di goccioline di effettuare un numero medio di CFUs coltivati.
    8. Per preparare le diluizioni seriali della cultura iniziale, trasferire 100 µ l di sospensione batterica da passo 2.7 in provetta #3 e mescolare energicamente con vortice. Aggiungere 100 µ l del tubo #3 al tubo #4 e mescolare bene, ripetere la procedura per successiva tubo #5.
    9. Stendere 100 µ l del contenuto delle provette #3, #4, #5 e la sospensione batterica regolata (punto 2.7), rispettivamente, su settori 10-3, 10-5, 10-7 e 10-1 della piastra di agar sangue.
    10. Lasciare le piastre di agar sangue nella cappa laminare di aria secca gli spread batterici, in genere per 10 minuti. In seguito, è possibile posizionare le piastre a 37 ° C per l'incubazione durante la notte.
    11. Dopo una notte di incubazione, contare le colonie batteriche per ottenere il numero di CFU derivanti dall'adesione per le biopsie del tessuto così come CFU/mL della sospensione batterica iniziale usato per l'aspersione. Esprimere i risultati come CFU/cm2.

4. fluorescenza microscopia di batteri aderiti all'innesto di tessuti all'aspersione

  1. Dopo aspersione, lavare i pezzi di tessuto con PBS (Vedi punto 3.5) e tagliare la parte interna di un innesto usando un punzone di un diametro inferiore.
  2. Preparare una piastra a 6 pozzetti e posizionare le gocce di mezzo di montaggio (Tabella materiali).
  3. Posizionare ogni pezzo di tessuto irrorato dalla superficie verso il basso su una sola goccia di mezzo di montaggio.
  4. Leggere una piastra utilizzando uno scanner di fluorescenza (Tabella materiali). Impostare i parametri delle lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione secondo un fluoroforo utilizzato per etichettare batterica.

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Risultati

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Per comprendere meglio i meccanismi dietro IE sviluppo, questo modello consente la valutazione di batterico e tessuto connesso fattori presenti nella situazione in vivo dell'inizio di infezione.

In dettaglio, l'approccio di romanzo in vitro permette di quantificare adesione batterica in condizioni di flusso ai tessuti diversi innesto irrorando fluorescente identificati batteri sopra i tessuti esercitan...

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Discussione

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Le osservazioni cliniche recenti dare consapevolezza speciale a IE come complicazione in pazienti sottoposti a sostituzione della valvola del RVOT6,13. Disfunzione della valvola impiantata in IE è il risultato dell'interazione batterica con l'innesto di endovascular che conduce al vasto infiammatorio e procoagulante reazioni1,14. Il modello presentato romanzo in vitro ci ha permesso di indagare s...

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Ringraziamenti

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Questo studio è stato sponsorizzato da un grant di ricerca fondo KU Leuven (OT/14/097) dato a RH. TRV è stato borsista della Fondazione di ricerca FWO - Flanders (Belgio; Concedere il numero - 12K0916N) e RH è supportato dalla clinica ricerca fondo di UZ Lovanio.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cerotto pericardio bovino (BP), Pericardium SuppleSynovis Surgical Innovations, USAPC-0404SN
Condotti per vene giugulari bovine (BJV)Condotto Contegra; Medtronic Inc, USAM333105D001
CH omotrapianto crioconservatoHomograft Bank (EHB)-
Acu-PunchAcuderm Inc, USAP850 (8 mm); P1050 (10 mm)
albumina umanaFlexbumin; Baxter, BelgioBE171464
LOTTO:16G12C
Brodo di soia triptico (TSB)Fluka, Steinheim, Germania22092-500G
Brodo per infusione di cuore (BHI)Fluka53286-500G
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).Gibco14190-094
5(6)-Carbossifluoresceina N-idrossisuccinimide estere (CF)Sigma-Aldrich, Germania21878-100MG-F
Pompa peristaltica (MODELLO ISM444B)Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Germania631942-2
Bagno di sonicazionePulitore ad ultrasuoni VWR; VWR, Radnor, Pa142-6044230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogen di ThermoFisherP36930
InCell Analyzer 2000 (scanner a fluorescenza)GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa29027886
Arium Pro VF - acqua ultrapura - H2OMilliQ Millipore87206462
Vetrini microscopici - Camere di coltura tissutale (1 pozzetto)Sarstedt94.6140.102
1 pozzetto su Lumox staccabileSarstedt94.6150.101
Acciaio inossidabile - lame chirurgicheSwann-Morton311
Tygon Silicone Tubing, 1/8"ID x 1/4"ODCole-ParmerEW-95702-06Intervallo di temperatura: – Da 80 a 200 gradi C
Sterilizzare: Con ossido di etilene, irradiazione gamma o autoclave per 30 minuti, 15 psi di pressione
PharMed BPT TubingSaint-GobainAY242012Autoclavabile 30 minuti a 121 gradi; C
Tygon LMT-55 TubiSaint Gobain Performance Plastics&commercio;Termostato 15312022
BMG BIOMEDIZINTECHNIK300-0042230V, 90VA, 50Hz
European

Riferimenti

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