Articolo metodologico
Qui, descriviamo i passi essenziali per le registrazioni di cellule intere patch-clamp fatta da neuroni di sostanza gelatinosa (SG) nella fetta di midollo spinale in vitro . Questo metodo consente la proprietà intrinseca della membrana, la trasmissione sinaptica e la caratterizzazione morfologica dei neuroni di SG per essere studiato.
Studi recenti di cellule intere patch-clamp da neuroni di sostanza gelatinosa (SG) hanno fornito un grande corpo di informazioni circa i meccanismi spinali trasmissione sensoriale, regolamento nocicettivo e sviluppo cronico dolore o prurito. Implementazioni di registrazioni elettrofisiologiche insieme a studi morfologici basati sull'utilità delle fette acute del midollo spinale hanno ulteriormente migliorato la nostra comprensione delle proprietà di un neurone e la composizione dei circuiti locali in SG. Qui, presentiamo una guida dettagliata e pratica per la preparazione di fettine di midollo spinale e visualizza rappresentativo della intero-cellula registrazione e risultati morfologici. Questo protocollo permette ideale conservazione neuronale e può imitare le condizioni in vivo in una certa misura. In sintesi, la capacità di ottenere una preparazione in vitro di fettine di midollo spinale permette stabile a corrente e tensione morsetto registrazioni e così potrebbe facilitare le indagini dettagliate nelle proprietà intrinseche della membrana, circuiti locali e struttura di un neurone utilizzando diversi approcci sperimentali.
La sostanza gelatinosa (SG, della lamina II del corno dorsale spinale) è un centro di relè indiscutibilmente importante per la trasmissione e regolazione informazioni sensoriali. Si compone di interneuroni inibitori ed eccitatori, che ricevono gli input dalle fibre afferenti primarie, interneuroni locali e il sistema inibitorio discendente1endogeno. Negli ultimi decenni, lo sviluppo di preparazione fetta acuta del midollo spinale e l'avvento della registrazione della intero-cellula patch-clamp hanno permesso diversi studi sulle proprietà elettrofisiologiche e morfologiche intrinseche di SG neuroni2,
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Tutti i protocolli sperimentali descritti sono stati approvati dall'animale etica Comitato di Università di Nanchang (Nanchang, Cina PR, etico No.2017-010). Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo lo stress e il dolore degli animali sperimentali. Le registrazioni elettrofisiologiche eseguite qui sono state effettuate a temperatura ambiente (RT, 22 – 25 ° C).
1. gli animali
2. preparazione di soluzio....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Fette di acuta del midollo spinale sono stati preparati secondo lo schema indicato nella Figura 1. Dopo affettamento e il recupero, una fetta di midollo spinale è stata trasferita alla camera di registrazione. I neuroni sani sono stati identificati sulla base di aspetto soma usando la microscopia IR-DIC. Successivamente, i potenziali di azione dei neuroni SG sono stati tratti da una serie di depolarizzanti impulsi di corrente (1 s durata) quando i neuroni son.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Questo protocollo dettagli i passaggi per la preparazione di fettine di midollo spinale, che abbiamo utilizzato con successo durante gli esperimenti di cellule intere patch-clamp su SG neuroni18,19,20,21. Mediante l'implementazione di questo metodo, abbiamo recentemente riportato che la minociclina, una seconda generazione di tetraciclina, marcatamente potrebbe migliorare la trasmissione sinapt.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Natural Science Foundation of China (No. 81560198, 31660289).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| NaCl | Sigma | S7653 | Utilizzato per la preparazione di ACSF e PBS |
| KCl | Sigma | 60130 | Utilizzato per la preparazione di ACSF, saccarosio-ACSF e soluzione intracellulare a base di K+ |
| NaH2PO4· 2H2O | Sigma | 71500 | Utilizzato per la preparazione di ACSF, saccarosio-ACSF e PBS |
| CaCl2· 2H2O | Sigma | C5080 | Utilizzato per la preparazione di ACSF e saccarosio-ACSF |
| MgCl2· 6H2O | Sigma | M2670 | Utilizzato per la preparazione di ACSF e saccarosio-ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Utilizzato per la preparazione di ACSF e saccarosio-ACSF |
| D-Glucosio | Sigma | G7021 | Utilizzato per la preparazione di ACSF |
| Acido ascorbico | Sigma | P5280 | Utilizzato per la preparazione di ACSF e saccarosio-ACSF |
| Piruvato di sodio | Sigma | A7631 | Utilizzato per la preparazione di ACSF e saccarosio-ACSF |
| Saccarosio | Sigma | S7903 | Utilizzato per la preparazione di saccarosio-ACSF |
| K-gluconato | Wako | 169-11835 | Utilizzato per la preparazione di soluzione intracellulare a base di K+ |
| Na2-Fosfocreatina | Sigma | P1937 | Utilizzato per la preparazione della soluzione intracellulare |
| EGTA | Sigma | E3889 | Utilizzato per la preparazione della soluzione intracellulare |
| HEPES | Sigma | H4034 | Utilizzato per la preparazione della soluzione intracellulare |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | Utilizzato per la preparazione della soluzione intracellulare |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | Utilizzato per la preparazione di soluzione intracellulare |
| CsMeSO4 | Sigma | C1426 | Utilizzato per la preparazione di soluzioni intracellulari a base di Cs+ |
| CsCl | Sigma | C3011 | Utilizzato per la preparazione di soluzioni intracellulari a base di Cs+ |
| TEA-Cl | Sigma | T2265 | Utilizzato per la preparazione di soluzioni intracellulari a base di Cs+ soluzione |
| Neurobiotina 488 | Vettore | SP-1145 | 0,05% neurobiotina 488 potrebbe essere utilizzato per studi morfologici |
| Agar | Sigma | A7002 | 3% blocco agar è stato utilizzato nel nostro protocollo |
| Paraformaldeide | Sigma | P6148 | 4% paraformaldeide è stato utilizzato per l'elaborazione immunoistochimica |
| Na2HPO4 | Hengxing Chimico Reagenti | utilizzati per la preparazione di PBS | |
| Mount Coverslipping Medium Polyscience | 18606 | ||
| Urethan | National Institute for Food and Drug Control | 30191228 | 1,5 g/kg, i.p. |
| Capillari in vetro borosilicato | World Precision Instruments | TW150F-4 | 1,5 mm OD, 1,12 mm ID |
| Estrattore per micropipette | Sutter Instrument | P-97 | Utilizzato per la preparazione di micropipette |
| Vibratomo | Leica | VT1000S | |
| Tabella di isolamento dalle vibrazioni | Technical Manufacturing Corporation | 63544 | |
| Telecamera | CCD a infrarossiDage-MIT | IR-1000 | |
| Amplificatore patch-clamp | HEKA | EPC-10 | |
| Micromanipolatore | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Tavolino X-Y | Burleigh | GIBRALTAR XY | |
| Microscopio verticale | Osmometro Olympus | BX51WI | |
| Misuratore | di PH avanzato | FISKE 210 | |
| Mettler Microscopio Confocol Toledo | FE20 | ||
| Zeiss | LSM 700 |
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE
Richiedi permesso