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Articolo metodologico

Preparazione delle fette Acute del midollo spinale per la registrazione di cellule intere Patch-clamp in neuroni di sostanza Gelatinosa

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DOI:

10.3791/58479

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18 gennaio 2019

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1Department of Pain, First Affiliated Hospital of Nanchang University, 2Department of Pediatrics, First Affiliated Hospital of Nanchang University, 3Center for Laboratory Medicine, First Affiliated Hospital of Nanchang University

In questo articolo

Sommario

Qui, descriviamo i passi essenziali per le registrazioni di cellule intere patch-clamp fatta da neuroni di sostanza gelatinosa (SG) nella fetta di midollo spinale in vitro . Questo metodo consente la proprietà intrinseca della membrana, la trasmissione sinaptica e la caratterizzazione morfologica dei neuroni di SG per essere studiato.

Abstract

Studi recenti di cellule intere patch-clamp da neuroni di sostanza gelatinosa (SG) hanno fornito un grande corpo di informazioni circa i meccanismi spinali trasmissione sensoriale, regolamento nocicettivo e sviluppo cronico dolore o prurito. Implementazioni di registrazioni elettrofisiologiche insieme a studi morfologici basati sull'utilità delle fette acute del midollo spinale hanno ulteriormente migliorato la nostra comprensione delle proprietà di un neurone e la composizione dei circuiti locali in SG. Qui, presentiamo una guida dettagliata e pratica per la preparazione di fettine di midollo spinale e visualizza rappresentativo della intero-cellula registrazione e risultati morfologici. Questo protocollo permette ideale conservazione neuronale e può imitare le condizioni in vivo in una certa misura. In sintesi, la capacità di ottenere una preparazione in vitro di fettine di midollo spinale permette stabile a corrente e tensione morsetto registrazioni e così potrebbe facilitare le indagini dettagliate nelle proprietà intrinseche della membrana, circuiti locali e struttura di un neurone utilizzando diversi approcci sperimentali.

Introduzione

La sostanza gelatinosa (SG, della lamina II del corno dorsale spinale) è un centro di relè indiscutibilmente importante per la trasmissione e regolazione informazioni sensoriali. Si compone di interneuroni inibitori ed eccitatori, che ricevono gli input dalle fibre afferenti primarie, interneuroni locali e il sistema inibitorio discendente1endogeno. Negli ultimi decenni, lo sviluppo di preparazione fetta acuta del midollo spinale e l'avvento della registrazione della intero-cellula patch-clamp hanno permesso diversi studi sulle proprietà elettrofisiologiche e morfologiche intrinseche di SG neuroni2, 3 , 4 così come gli studi dei circuiti locali in SG5,6. Inoltre, utilizzando la preparazione di fetta del midollo spinale in vitro , i ricercatori in grado di interpretare i cambiamenti in un neurone excitabilities7,8, la funzione dello ione canali9,10, e attività sinaptica11,12 in varie condizioni patologiche. Questi studi hanno approfondito la nostra comprensione del ruolo che i neuroni SG svolgono nello sviluppo e mantenimento del dolore cronico e prurito neuropatico.

Essenzialmente, il presupposto fondamentale per ottenere una chiara visualizzazione di soma neuronale e ideale della intero-cellula patch usando le fette acute del midollo spinale è garantire l'eccellente qualità delle fette così sani e patchable neuroni possono essere ottenuti. Tuttavia, preparando fettine di midollo spinale prevede diversi passaggi, ad esempio eseguendo un laminectomy ventrale e rimuovere la membrana di pia-aracnoide, che può essere ostacoli nell'ottenere fette sani. Sebbene non sia facile da preparare fettine di midollo spinale, esecuzione di registrazioni in vitro su fettine di midollo spinale ha diversi vantaggi. Rispetto alle preparazioni di cultura di cellule, fettine di midollo spinale possono conservare parzialmente inerente connessioni sinaptiche che sono in una condizione fisiologicamente rilevante. Inoltre, cellule intere patch-clamp registrazione con fettine di midollo spinale potrebbe essere combinata con altre tecniche, quali patch doppio morsetto13,14, studi morfologici15,16 e unicellulare RT-PCR 17. Pertanto, questa tecnica fornisce ulteriori informazioni su che caratterizzano le diversità anatomiche e genetiche in una regione specifica e consente di indagine della composizione dei circuiti locali.

Qui, forniamo una descrizione di base e di dettagliata del nostro metodo per preparare fette acute del midollo spinale e l'acquisizione di registrazioni di cellule intere patch-clamp da neuroni di SG.

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Protocollo

Tutti i protocolli sperimentali descritti sono stati approvati dall'animale etica Comitato di Università di Nanchang (Nanchang, Cina PR, etico No.2017-010). Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo lo stress e il dolore degli animali sperimentali. Le registrazioni elettrofisiologiche eseguite qui sono state effettuate a temperatura ambiente (RT, 22 – 25 ° C).

1. gli animali

  1. Utilizzare ratti Sprague-Dawley (3 – 5 settimane) di entrambi i sessi. Casa gli animali sotto un ciclo luce-buio di 12 h e dare loro accesso ad libitum per acqua e cibo adeguato.

2. preparazione di soluzioni e materiali

  1. Soluzioni
    1. Preparare il liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) (in mM): 117 NaCl, 3.6 KCl, 1,2 NaH2PO4·2H2O, 2,5 CaCl2·2H2O, 1,2 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, 11 D-glucosio, acido ascorbico 0,4 e 2 piruvato di sodio. Vedere tabella 1.
    2. Preparare il saccarosio-ACSF (in mM): 240 saccarosio, 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4·2H2O, 0,5 CaCl2·2H2O, 3,5 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, l'acido ascorbico 0,4 e piruvato di sodio 2. Vedere la tabella 2.
    3. Preparare K+-basato soluzione intracellulare (in mM): 130 K-gluconato, 5 KCl, 10 Na2-fosfocreatina, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP e Li 0,3-GTP. Vedere la tabella 3.
    4. Preparare Cs+-basato soluzione intracellulare (in mM): 92 CsMeSO4, 43 CsCl, 10 Na2-fosfocreatina, 5 tetraetilammonio (TEA) - 0,5 EGTA, Cl, 4 Mg, 10 HEPES - ATP e Li 0,3-GTP. Vedere la tabella 4.
      Nota: Tutte le soluzioni devono essere preparate usando acqua distillata. ACSF e saccarosio-ACSF dovrebbe essere carbogenated (95% O2% e 5% CO2 miscela) prima dell'uso per mantenere un pH ottimale di circa 7,4 e il osmolality di queste due soluzioni deve essere regolato per 300-310 mOsm. Perché l'acido ascorbico potrebbe influenzare i canali del calcio, l'agente deve essere omesso se uno vorrebbe registrare correnti del calcio. L'osmolalità e il pH delle soluzioni intracellulare dovrebbe essere misurate e regolate a 290-300 mOsm e 7.2 – 7.3, rispettivamente. Si consiglia di filtrare le soluzioni intracellulare con 0,2 µm filtri e memorizzare le soluzioni come aliquote di 1 mL a-20 ° C. Cs+ e tè vengono applicate in Cs+-basato soluzione intracellulare al blocco canale del potassio, che è favorevole all'utilizzo dell'amplificatore per tenere la membrana potenziale costante a 0 mV durante la registrazione correnti postsinaptiche inibitorie (IPSCs).
    5. Preparare la soluzione di neurobiotin 488 0.05%. Sciogliere 2 mg di neurobiotin 488 in 4 mL di K+-basato soluzione intracellulare e regolare l'osmolalità di 290-300 mOsm utilizzando acqua distillata o saccarosio se necessario.
      Nota: 1 mM di saccarosio aumenta osmolarità 1 mOsm.
    6. Preparare 3% agar come un blocco per midollo spinale. Sciogliere 7,5 g di agar-agar in 250 mL di acqua purificata in un bicchiere di vetro e quindi utilizzare un forno a microonde per riscaldare fino ad ebollizione e chiaro. La soluzione di turbinio e versare il composto in un 17,5 cm x 10,5 cm x 1,8 cm plastica box solidificazione in seguito. Mantenere l'agar a 4 ° C prima dell'uso.
    7. Preparare 4% paraformaldeide (PFA) per l'elaborazione di immunohistochemical. Mix 40 g di polvere PFA a ~ 800 mL di riscaldata (circa 60 ° C) 1 x soluzione PBS (130 mM NaCl, 7mm Na2HPO4, 3mm NaH2PO4). Regolare lentamente il pH aggiungendo 1 N NaOH gocce fino a PFA polvere sia completamente disciolta. Una volta che la soluzione è diventato chiara, regolare il volume totale a 1 L con PBS 1X. Regolare il pH a 7,2-7,4 utilizzando 1 N HCl, quando necessario, quindi filtrare la soluzione PFA 4% e conservare a-20 ° C fino all'utilizzo.
      Nota: PFA è tossico, quindi è necessario indossare maschere, guanti, nonché occhiali di sicurezza. Condurre il processo di preparazione 4% PFA all'interno di un cappuccio ventilato. Polvere PFA può essere completamente disciolto ad un pH di circa 9 – 10.
  2. Strumenti
    1. Per un tipico sistema elettrofisiologico, utilizzare un microscopio verticale dotato di contrasto differenziale di interferenza a infrarossi (IR-DIC) e un obiettivo a immersione in acqua ad alta risoluzione, una fotocamera CCD/CMOS, un amplificatore di patch-clamp, un titolare di una micropipetta e un micromanipolatore permettendo una regolazione fine della posizione pipetta. Una fase XY è anche necessaria per spostare il microscopio.
    2. Montare tutte le apparecchiatura su una tabella di isolamento delle vibrazioni circondata da una gabbia di Faraday. Collegare un monitor video alla videocamera per osservare i neuroni e visualizzare le micropipette.
  3. Micropipette
    1. Rendere gli elettrodi di registrazione dai vasi capillari di vetro borosilicato con l'estrattore micropipetta. Le gamme di resistenza tipica pipetta da 3-6 MΩ quando riempito con soluzione intracellulare.
  4. Blocco di agar
    1. Preparare un 1,2 cm x 1,5 cm x blocco di agar 2.0 cm. Tagliare il blocco in forme illustrate nella Figura 1 come richiesto.

3. acuta del midollo spinale fetta preparazione

Nota: Fettine di midollo spinale trasversale o parasagittal sono preparati come in precedenza descritto18,19,20.

  1. Prima dell'estrazione del midollo spinale e perfusione perfusione, preparare ~ 500 mL saccarosio-ACSF equilibrate con 95% O2 e 5% CO2 e raffreddare la soluzione a ghiacciata (0 – 4 ° C).
  2. Raffreddare con tutti gli strumenti di dissezione (ad es., forbici, forbici iris, forcipe dentato, una pinzetta, curvo forcipe di dissezione) sul ghiaccio. Lo schema della preparazione della fetta acuta del midollo spinale è indicato nella Figura 1.
  3. Aspersione di perfusione
    1. Dopo una singola iniezione (intraperitoneale, i.p.) dell'uretano (1,5 g/kg), attendere 2 – 3 min e valutare la profondità di anestesia dei ratti testando le risposte di pizzico di punta o coda. Una volta che un aereo chirurgico di anestesia è mantenuto, mettere il ratto sul ghiaccio tritato in posizione supina.
      Nota: Per la produzione di anestesia profonda sufficiente per la non percezione del dolore durante il thoracotomy, seguire il vostro locale linee guida IACUC.
    2. Fare un'incisione (3 – 4 cm) attraverso la pelle dal processo xifoideo fino alla clavicola e poi fare un'incisione trasversale sotto il livello del processo xifoideo.
    3. Afferrare e sollevare il processo xifoideo con un paio di pinzetta per esporre completamente il diaframma. Fare un'incisione trasversale attraverso il diaframma e poi tagliare attraverso la gabbia toracica tra sterno e costole bilateralmente per aprire la cavità toracica. Utilizzare il forcipe curvo per cogliere il processo xifoideo così la gabbia toracica è fisso, e il cuore è sufficientemente esposti.
    4. Tenere il cuore con un altro forcipe curvo delicatamente e quindi inserire un ago 22G attraverso il ventricolo sinistro alla base dell'arco aortico.
    5. Tagliare l'atrio destro con forbice immediatamente e quindi avviare la perfusione di saccarosio-ACSF ghiacciata, ossigenato attraverso un sistema di gravità.
      Nota: Rapida e sufficiente perfusione perfusione con saccarosio-ACSF ghiacciata può facilitare il raffreddamento rapido del midollo spinale, mentre la bassa concentrazione di sodio e di calcio può contribuire ad alleviare la tossicità eccitatoria e proteggere la funzione di un neurone. Inoltre, cellule di anima rosse di compensazione sarebbe vantaggioso per ridurre la colorazione di fondo di biocitina quando si esegue uno studio morfologico. La perfusione è considerata sufficiente e soddisfatti, purché il fluido esce l'atrio di destra è chiaro e il colore del fegato del ratto e le zampe è pallido. La punta dell'ago 22 G deve essere smussata per evitare la rottura del cuore e dell'arco aortico.
  4. Dissezione del midollo spinale e affettare
    1. Praticare un'incisione longitudinale (5 cm) sulla pelle posteriore da caudale alla rostrale, quindi tagliata attraverso la gabbia toracica tra la colonna vertebrale e le costole su entrambi i lati dello stato di perfusione.
    2. Fare un taglio all'estremità caudale della spina dorsale, usare le forbici per tagliare i tessuti circostanti e isolare rapidamente il segmento lombosacrale della spina dorsale.
    3. Trasferire il segmento lombosacrale a un piatto di vetro contenente ghiacciata ACSF base di saccarosio. Con il lato ventrale verso l'alto, è possibile utilizzare forbice per tagliare attraverso il pedicle vertebrale bilateralmente ed esporre il midollo spinale con attenzione. Isolare un midollo spinale lungo 2 cm con l'ingrandimento lombosacrale (L1 – S3) e trasferire la sezione spinale in un altro piatto di vetro riempito con saccarosio-ACSF freddo.
    4. Rimuovere le meningi e la membrana aracnoide pia sotto un microscopio per dissezione. Tagliare tutte le ventrali e le radici dorsali via più velocemente possibile.
    5. Posizionare il midollo spinale su un blocco di agar precedentemente tagliati. Per preparare in sezioni trasversali, allegare il lato ventrale del midollo spinale per l'agar e lasciate sul lato dorsale verso la lama. Per preparare fette parasagittal, allegare il lato ventrale con supercolla per l'agar in senso verticale come mostrato nella Figura 1. Quindi, montare il blocco di agar per una piattaforma di un vibratome con supercolla. Preparare 300 – 500 µm trasversale o parasagittal fette con una velocità di avanzamento di 0.025 mm/s e una frequenza di vibrazione di 80 Hz.
    6. Utilizzare una pipetta di plastica-tagliati per trasferire le fette sulla maglia di nylon in una camera di deposito contenente ACSF continuamente ossigenato a 32 ° C per almeno 30 min prima della registrazione.
      Nota: fare attenzione per evitare lesioni al midollo spinale, soprattutto il corno dorsale, quando si rimuovono le meningi e le radici spinali. Il midollo spinale dovrebbe essere affettato dorsale-ventralmente. Per ottenere risultati ottimali, le fette dovrebbero essere preparate rapidamente (entro 15-20 min). Lo spessore di una fetta spinale dovrebbe essere non più di 600 µm per soddisfare la visibilità delle cellule. Inoltre, la tecnica sopra descritta potrebbe essere utilizzata per ottenere fette orizzontali spinale.

4. cellule intere Patch-clamp registrazioni

  1. Per condurre le registrazioni di cellule intere patch-clamp da neuroni di SG, utilizzare K+-basato soluzione intracellulare per la maggior parte dei casi di registrazione, mentre l'applicazione Cs+-basato soluzione solo per la registrazione delle correnti postsinaptiche inibitorie.
  2. Spostare delicatamente una fetta del midollo spinale per la camera di registrazione e quindi mantenere esso con un filo di platino a forma di U connesso con fili di nylon con fermezza per fetta ottimale stabilità. Costantemente irrorare la fetta con ACSF propagati a RT attraverso un sistema di gravità e impostare la velocità di perfusione a 2 – 4 mL/min per raggiungere l'ossigenazione sufficiente.
  3. Identificare l'area di SG (una band traslucida) utilizzando una lente del microscopio a bassa risoluzione, scegliere un neurone sano usando l'obiettivo ad alta risoluzione come la cella di destinazione e regolarlo al centro dello schermo del monitor video.
  4. Riempire una micropipetta con un volume adeguato di K+-basato o Cs+-basato soluzione intracellulare come necessario, inserire la micropipetta nella pinza porta elettrodo e accertarsi che la soluzione intracellulare sia a contatto con il filo d'argento all'interno del titolare.
  5. Mettere a fuoco la micropipetta e immergerlo in ACSF utilizzando un micromanipolatore e quindi applicare una lieve pressione positiva (~ 1 psi quando misurata con un manometro) per forzare la micropipetta lontano da sporcizia o detriti.
  6. Spostare gradualmente la micropipetta verso il neurone mirato. Una volta che la pipetta si avvicina il neurone e si forma una piccola fossetta sulla membrana di un neurone per formare un gigaseal, rilasciare la pressione positiva.
  7. Alterare la detenzione potenziale a -70 mV, che è vicino il fisiologico riposo potenziale di membrana (RMP) di una cella. Quindi, applicare un'aspirazione delicata e transitoria per la micropipetta a rottura della membrana e creare una buona configurazione di cellule intere.
    Nota: Dopo aver trasferito la fetta nella camera di registrazione, assicurarsi di aspersione costante per almeno 5 min eliminare i detriti sulla superficie fetta. Vale la pena notare che la capacità di distinguere tra i neuroni sani e non sani/morti è di fondamentale importanza per la buona tenuta e registrazione stabile. Un neurone malsano/morti ha un aspetto gonfio o rimpicciolito, insieme con un grande nucleo visibile, mentre un neurone sano è caratterizzato da una forma 3-dimensionale (3D) con una membrana liscia e brillante, e il suo nucleo è invisibile. Per ottenere una configurazione di cellule intere, è essenziale per compensare capacità veloce o lento passo passo quando necessario. A RT, la giunzione liquida potenziale è calcolata per essere 15,1 – 15,2 mV e 4.3 – 4.4 mV in K+-basato e Cs+-basato soluzione intracellulare, rispettivamente. Nei nostri studi, i dati registrati non sono stati corretti per il potenziale di giunzione liquida.
  8. Registrazioni di proprietà intrinseche della membrana
    1. Registrare la proprietà passiva intrinseca della membrana: Record RMP immediatamente (entro 20 s) dopo pausa in. Determinare la resistenza di ingresso neuronale misurando la risposta in tensione per una corrente di depolarizzazione (10 pA, 500 ms) al RMP in modalità corrente-morsetto.
    2. Record di proprietà di infornamento: testare il modello di infornamento di ogni neurone in corrente-morsetto con una serie di 1 s depolarizzanti impulsi di corrente (25 – 150 pA con incremento di 25 pA) presso RMP. Misurare la soglia, l'ampiezza e la mezza-larghezza di un singolo potenziale di azione non in linea.
    3. Registrare la corrente di sottosoglia: per valutare le correnti di sottosoglia somatiche, tenere la membrana potenziale a -50 mV in modalità tensione-morsetto. Quindi, applicare una serie di hyperpolarizing impulsi di tensione di 1 s durata da -60 mV a -120 mV, con un decremento di 10 mV.
    4. Registrare correnti postsinaptiche eccitatorie (EPSC): Record EPSC con K+-basato soluzione intracellulare in modalità tensione-morsetto a un potenziale di holding di -70 mV.
    5. IPSCs record: Applicare Cs+-basato soluzione intracellulare per registrazione IPSCs. Una volta stabilita la configurazione di cellule intere, tenere la membrana potenziale a -70 mV per ~ 5 min e quindi modificare l'azienda potenziale a 0 mV gradualmente. Attendere alcuni minuti per la stabilizzazione e poi iniziare a registrare gli eventi IPSC.
      Nota: Solo i neuroni con un RMP inferiore a-50 mV e visualizzando superamento devono essere selezionati per ulteriore studio. Le resistenze di serie nel nostro studio sono in genere 10-30 MΩ, e una registrazione dovrebbe escludersi una volta che la resistenza di serie cambia di più del 20%. EPSC potrebbe essere confermata con un'applicazione di vasca di 50 µM APV e 20 µM CNQX, mentre IPSCs potrebbe essere confermata con 10 µM bicucullina e stricnina 1 µM.

5. studio morfologico

  1. Per gli esperimenti morfologici, utilizzare un K+-basato soluzione intracellulare contenente 0.05% neurobiotin 488.
  2. Dopo mantenere una stabile elettrofisiologici registrazione per almeno 20 minuti, rimuovere la micropipetta lentamente verso l'alto per consentire la membrana cellulare per sigillare e trasferire la fetta del midollo spinale in un contenitore riempito con 4% PFA. Difficoltà le fette in 4% PFA a RT per 1 h e poi a 4° C durante la notte.
  3. Sciacquare le fette in PBS e poi immergerli in etanolo al 50% per 30 min. Dopo un altro tre lavaggi in PBS, montare le fette nel loro spessore originale sui vetrini con un mezzo di montaggio.
  4. Utilizzare un microscopio confocale (Vedi Tabella materiali) per acquisizione di immagini e la ricostruzione 3D di un neurone. Scansione di neuroni attraverso una lente X 20 con uno z-stack di 1,5 µm.

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Risultati

Fette di acuta del midollo spinale sono stati preparati secondo lo schema indicato nella Figura 1. Dopo affettamento e il recupero, una fetta di midollo spinale è stata trasferita alla camera di registrazione. I neuroni sani sono stati identificati sulla base di aspetto soma usando la microscopia IR-DIC. Successivamente, i potenziali di azione dei neuroni SG sono stati tratti da una serie di depolarizzanti impulsi di corrente (1 s durata) quando i neuroni son...

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Discussione

Questo protocollo dettagli i passaggi per la preparazione di fettine di midollo spinale, che abbiamo utilizzato con successo durante gli esperimenti di cellule intere patch-clamp su SG neuroni18,19,20,21. Mediante l'implementazione di questo metodo, abbiamo recentemente riportato che la minociclina, una seconda generazione di tetraciclina, marcatamente potrebbe migliorare la trasmissione sinapt...

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Natural Science Foundation of China (No. 81560198, 31660289).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
NaClSigmaS7653Utilizzato per la preparazione di ACSF e PBS
KClSigma60130Utilizzato per la preparazione di ACSF, saccarosio-ACSF e soluzione intracellulare a base di K+
NaH2PO4· 2H2OSigma71500Utilizzato per la preparazione di ACSF, saccarosio-ACSF e PBS
CaCl2· 2H2OSigmaC5080Utilizzato per la preparazione di ACSF e saccarosio-ACSF
MgCl2· 6H2OSigmaM2670Utilizzato per la preparazione di ACSF e saccarosio-ACSF
NaHCO3SigmaS5761Utilizzato per la preparazione di ACSF e saccarosio-ACSF
D-GlucosioSigmaG7021Utilizzato per la preparazione di ACSF
Acido ascorbicoSigmaP5280Utilizzato per la preparazione di ACSF e saccarosio-ACSF
Piruvato di sodioSigmaA7631Utilizzato per la preparazione di ACSF e saccarosio-ACSF
SaccarosioSigmaS7903Utilizzato per la preparazione di saccarosio-ACSF
K-gluconatoWako169-11835Utilizzato per la preparazione di soluzione intracellulare a base di K+
Na2-FosfocreatinaSigmaP1937Utilizzato per la preparazione della soluzione intracellulare
EGTASigmaE3889Utilizzato per la preparazione della soluzione intracellulare
HEPESSigmaH4034Utilizzato per la preparazione della soluzione intracellulare
Mg-ATPSigmaA9187Utilizzato per la preparazione della soluzione intracellulare
Li-GTPSigmaG5884Utilizzato per la preparazione di soluzione intracellulare
CsMeSO4SigmaC1426Utilizzato per la preparazione di soluzioni intracellulari a base di Cs+
CsClSigmaC3011Utilizzato per la preparazione di soluzioni intracellulari a base di Cs+
TEA-ClSigmaT2265Utilizzato per la preparazione di soluzioni intracellulari a base di Cs+ soluzione
Neurobiotina 488VettoreSP-11450,05% neurobiotina 488 potrebbe essere utilizzato per studi morfologici
AgarSigmaA70023% blocco agar è stato utilizzato nel nostro protocollo
ParaformaldeideSigmaP61484% paraformaldeide è stato utilizzato per l'elaborazione immunoistochimica
Na2HPO4Hengxing Chimico Reagentiutilizzati per la preparazione di PBS
Mount Coverslipping Medium Polyscience18606
UrethanNational Institute for Food and Drug Control301912281,5 g/kg, i.p.
Capillari in vetro borosilicatoWorld Precision InstrumentsTW150F-41,5 mm OD, 1,12 mm ID
Estrattore per micropipetteSutter InstrumentP-97Utilizzato per la preparazione di micropipette
VibratomoLeicaVT1000S
Tabella di isolamento dalle vibrazioniTechnical Manufacturing Corporation63544
TelecameraCCD a infrarossiDage-MITIR-1000
Amplificatore patch-clampHEKAEPC-10
MicromanipolatoreSutter InstrumentMP-285
Tavolino X-YBurleighGIBRALTAR XY
Microscopio verticaleOsmometro OlympusBX51WI
Misuratoredi PH avanzatoFISKE 210
Mettler Microscopio Confocol ToledoFE20
ZeissLSM 700

Riferimenti

  1. Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).
  2. Yoshimura, M., Nishi, S. Blind patch-clamp recordings from substantia gelatinosa neurons in adult rat spinal cord slices: pharmacological properties of synaptic currents. Neuroscience. 53 (2), 519-526 (1993).
  3. Maxwell, D. J., Belle, M. D., Cheunsuang, O., Stewart, A., Morris, R. Morphology of inhibitory and excitatory interneurons in superficial laminae of the rat dorsal horn. The Journal of Physiology. 584 (Pt. 2, 521-533 (2007).
  4. Grudt, T. J., Perl, E. R. Correlations between neuronal morphology and electrophysiological features in the rodent superficial dorsal horn. The Journal of Physiology. 540 (Pt 1), 189-207 (2002).
  5. Lu, Y., et al. A feed-forward spinal cord glycinergic neural circuit gates mechanical allodynia. Journal of Clinical Investigation. 123 (9), 4050-4062 (2013).
  6. Zheng, J., Lu, Y., Perl, E. R. Inhibitory neurones of the spinal substantia gelatinosa mediate interaction of signals from primary afferents. The Journal of Physiology. 588 (Pt 12), 2065-2075 (2010).
  7. Balasubramanyan, S., Stemkowski, P. L., Stebbing, M. J., Smith, P. A. Sciatic chronic constriction injury produces cell-type-specific changes in the electrophysiological properties of rat substantia gelatinosa neurons. Journal of Neurophysiology. 96 (2), 579-590 (2006).
  8. Zhang, L., et al. Extracellular signal-regulated kinase (ERK) activation is required for itch sensation in the spinal cord. Molecular Brain. 7, 25(2014).
  9. Kopach, O., et al. Inflammation alters trafficking of extrasynaptic AMPA receptors in tonically firing lamina II neurons of the rat spinal dorsal horn. Pain. 152 (4), 912-923 (2011).
  10. Takasu, K., Ono, H., Tanabe, M. Spinal hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channels at primary afferent terminals contribute to chronic pain. Pain. 151 (1), 87-96 (2010).
  11. Iura, A., Takahashi, A., Hakata, S., Mashimo, T., Fujino, Y. Reductions in tonic GABAergic current in substantia gelatinosa neurons and GABAA receptor delta subunit expression after chronic constriction injury of the sciatic nerve in mice. European Journal of Pain. 20 (10), 1678-1688 (2016).
  12. Alles, S. R., et al. Peripheral nerve injury increases contribution of L-type calcium channels to synaptic transmission in spinal lamina II: Role of alpha2delta-1 subunits. Molecular Pain. 14, 1-12 (2018).
  13. Santos, S. F., Rebelo, S., Derkach, V. A., Safronov, B. V. Excitatory interneurons dominate sensory processing in the spinal substantia gelatinosa of rat. The Journal of Physiology. 581 (Pt 1), 241-254 (2007).
  14. Lu, Y., Perl, E. R. Modular organization of excitatory circuits between neurons of the spinal superficial dorsal horn (laminae I and II). The Journal of Neuroscience. 25 (15), 3900-3907 (2005).
  15. Hantman, A. W., van den Pol, A. N., Perl, E. R. Morphological and physiological features of a set of spinal substantia gelatinosa neurons defined by green fluorescent protein expression. The Journal of Neuroscience. 24 (4), 836-842 (2004).
  16. Yasaka, T., Tiong, S. Y., Hughes, D. I., Riddell, J. S., Todd, A. J. Populations of inhibitory and excitatory interneurons in lamina II of the adult rat spinal dorsal horn revealed by a combined electrophysiological and anatomical approach. Pain. 151 (2), 475-488 (2010).
  17. Yin, H., Park, S. A., Han, S. K., Park, S. J. Effects of 5-hydroxytryptamine on substantia gelatinosa neurons of the trigeminal subnucleus caudalis in immature mice. Brain Research. 1368, 91-101 (2011).
  18. Hu, T., et al. Lidocaine Inhibits HCN Currents in Rat Spinal Substantia Gelatinosa Neurons. Anesthesia and Analgesia. 122 (4), 1048-1059 (2016).
  19. Peng, H. Z., Ma, L. X., Lv, M. H., Hu, T., Liu, T. Minocycline enhances inhibitory transmission to substantia gelatinosa neurons of the rat spinal dorsal horn. Neuroscience. 319, 183-193 (2016).
  20. Peng, S. C., et al. Contribution of presynaptic HCN channels to excitatory inputs of spinal substantia gelatinosa neurons. Neuroscience. 358, 146-157 (2017).
  21. Liu, N., Zhang, D., Zhu, M., Luo, S., Liu, T. Minocycline inhibits hyperpolarization-activated currents in rat substantia gelatinosa neurons. Neuropharmacology. 95, 110-120 (2015).
  22. Brown, T. H. Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats. Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).
  23. Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. The Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).
  24. Rice, M. E. Use of ascorbate in the preparation and maintenance of brain slices. Methods. 18 (2), 144-149 (1999).
  25. Takasu, K., Ogawa, K., Minami, K., Shinohara, S., Kato, A. Injury-specific functional alteration of N-type voltage-gated calcium channels in synaptic transmission of primary afferent C-fibers in the rat spinal superficial dorsal horn. European Journal of Pharmacology. 772, 11-21 (2016).
  26. Tian, L., et al. Excitatory synaptic transmission in the spinal substantia gelatinosa is under an inhibitory tone of endogenous adenosine. Neuroscience Letters. 477 (1), 28-32 (2010).
  27. Funai, Y., et al. Systemic dexmedetomidine augments inhibitory synaptic transmission in the superficial dorsal horn through activation of descending noradrenergic control: an in vivo patch-clamp analysis of analgesic mechanisms. Pain. 155 (3), 617-628 (2014).
  28. Yamasaki, H., Funai, Y., Funao, T., Mori, T., Nishikawa, K. Effects of tramadol on substantia gelatinosa neurons in the rat spinal cord: an in vivo patch-clamp analysis. PLoS One. 10 (5), e0125147(2015).
  29. Furue, H., Narikawa, K., Kumamoto, E., Yoshimura, M. Responsiveness of rat substantia gelatinosa neurones to mechanical but not thermal stimuli revealed by in vivo patch-clamp recording. The Journal of Physiology. 521 (Pt 2), 529-535 (1999).
  30. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
  31. Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visualized Experiments. (132), e53825(2018).
  32. Li, J., Baccei, M. L. Neonatal Tissue Damage Promotes Spike Timing-Dependent Synaptic Long-Term Potentiation in Adult Spinal Projection Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (19), 5405-5416 (2016).
  33. Ford, N. C., Ren, D., Baccei, M. L. NALCN channels enhance the intrinsic excitability of spinal projection neurons. Pain. , (2018).
  34. Cui, L., et al. Modulation of synaptic transmission from primary afferents to spinal substantia gelatinosa neurons by group III mGluRs in GAD65-EGFP transgenic mice. Journal of Neurophysiology. 105 (3), 1102-1111 (2011).
  35. Yang, K., Ma, R., Wang, Q., Jiang, P., Li, Y. Q. Optoactivation of parvalbumin neurons in the spinal dorsal horn evokes GABA release that is regulated by presynaptic GABAB receptors. Neuroscience Letters. , 55-59 (2015).

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