Metodi innovativi per la somministrazione intranasale in anestesia per inalazione per valutare il naso--cervello Drug Delivery

Sommario

Qui, descriviamo due nuovi metodi di somministrazione intranasale stabile sotto anestesia inalazione con minimo sforzo fisico per gli animali da esperimento. Inoltre descriviamo un metodo per la valutazione quantitativa dei livelli di distribuzione di droga nel cervello attraverso la via naso--cervello utilizzando radiomarcato [¹⁴C]-inulina come substrato modello di macromolecole solubile in acqua.

Abstract

La somministrazione intranasale è stata segnalata per essere una potenziale via per la consegna di naso--cervello di agenti terapeutici che aggira la barriera emato - encefalica. Tuttavia, ci sono stati alcuni rapporti riguardanti non solo l'analisi quantitativa, ma anche di somministrazione ottimale e regimi per le indagini del naso--cervello consegna di dosaggio. I limitati progressi nella ricerca sui meccanismi di naso--cervello via utilizzando roditori rappresenta un ostacolo significativo in termini di progettazione di sistemi di consegna di naso--cervello per candidati farmaci.

Per guadagnare qualche progresso in questo senso, abbiamo sviluppato e valutato due nuovi metodi di somministrazione intranasale stabile sotto anestesia inalazione per animali da esperimento. Inoltre descriviamo un metodo per la valutazione dei livelli di distribuzione di droga nel cervello attraverso la via naso--cervello mediante radio-marcato [¹⁴C]-inulina (peso molecolare: 5.000) come substrato modello di macromolecole solubile in acqua.

Inizialmente, abbiamo sviluppato un protocollo di somministrazione intranasale basati su pipetta utilizzando maschere temporaneamente apribile, che ci ha permesso di eseguire l'amministrazione affidabile agli animali sotto anestesia stabile. Usando questo sistema, [¹⁴C]-inulina potrebbe essere consegnata al cervello con piccolo errore sperimentale.

Successivamente abbiamo sviluppato un protocollo di somministrazione intranasale che comportano l'incannulamento inversa dal lato della via aerea attraverso l'esofago, che è stato sviluppato per ridurre al minimo gli effetti della clearance mucociliare (MC). Questa tecnica ha portato a livelli elevati significativamente di [¹⁴C]-inulina, che è stato rilevato quantitativamente nel bulbo olfattivo, del cervello e del midollo allungato, rispetto al metodo della pipetta. Questo sembra essere perché la ritenzione della soluzione farmaco nella cavità nasale è stato sostanzialmente aumentato dalla somministrazione attivo utilizzando una pompa a siringa in direzione opposta la MC nella cavità nasale.

In conclusione, i due metodi di somministrazione intranasale sviluppato in questo studio possono essere dovrebbe essere tecniche estremamente utili per la valutazione farmacocinetica nei roditori. Il metodo di inserimento di una canula inversa, in particolare, potrebbe essere utile per valutare le potenzialità del naso--cervello consegna di candidati farmaci.

Introduzione

Biomedicinali come peptidi, oligonucleotidi e anticorpi sono considerati di avere potenziale applicazione come nuovi agenti terapeutici per i disordini refrattari del sistema nervoso centrale che non hanno attualmente nessuna terapia curativa. Tuttavia, poiché la maggior parte biomedicinali sono macromolecole solubile in acqua, consegna dal sangue al cervello tramite la somministrazione endovenosa o orale è estremamente difficile a causa di impedenza della barriera sangue - cervello (BBB).

Negli ultimi anni, la somministrazione intranasale è stata segnalata per essere una potenziale via per la consegna di naso--cervello di agenti terapeutici che evita il BBB^1,2,3,4,5. Tuttavia, ci sono stati relativamente pochi rapporti per quanto riguarda l'analisi quantitativa del naso--cervello via consegna⁶. Inoltre, non ci sono stati praticamente nessun rapporti sulle condizioni di amministrazione ottimale accertato e regimi di dosaggio, come il volume, volte, periodi di tempo e velocità, per le indagini del naso--cervello consegna. Le carenze di cui sopra sono riconducibili ai seguenti motivi: (i) un metodo ottimale di somministrazione intranasale per topi deve ancora essere stabilito, e (ii) intranasale amministrazione pipettando, che viene generalmente utilizzato, in genere è caratterizzata di variazione interindividuale tra animali a causa della clearance mucociliare (MC), causando quindi spesso sottovalutate le potenzialità di consegna effettiva del naso--cervello di un particolare farmaco.

Anestesia per inalazione utilizzando isoflurano (iniziazione: 4%, manutenzione: 2%) con un'inalazione maschera per roditori ha guadagnato uso molto diffuso, con lo scopo di ridurre o eliminare il dolore associato con la chirurgia eseguiti su animali da esperimento. L'uso di maschere rende relativamente semplice eseguire l'amministrazione tipica droga in animali da esperimento sotto anestesia inalazione attraverso le vie sottocutanee, intraperitoneale ed endovenose. Tuttavia, nel caso di somministrazione intranasale, la maschera deve essere temporaneamente rimossi dagli animali per la somministrazione del farmaco. Con manutenzione inferiore al 2% isoflurane, animali in genere risvegliano rapidamente dall'anestesia per inalazione. Quando il volume di amministrazione per ogni dose è grande, questo potrebbe causare la soluzione della droga a fluire dalla cavità nasale nell'esofago, e pertanto una singola grande dose potrebbe essere necessario essere suddiviso in più piccole dosi per la somministrazione intranasale di piccole animali. Come somministrazione intranasale rende necessaria la rimozione della maschera per somministrazione ripetuta e tempo sufficiente per la cavità nasale sostenuta consegna, c'è un'alta probabilità che topi sarebbero risvegliarsi dall'anestesia durante la procedura di somministrazione. Questo rende molto difficile effettuare la somministrazione intranasale sotto uno stabile stato anestetico e probabilmente contribuisce alla variazione interindividuale osservata del naso--cervello consegna fra i roditori.

In questo studio, abbiamo pertanto sviluppato due nuovi metodi di somministrazione intranasale stabile nell'ambito dell'anestesia per inalazione, che impongono il minimo sforzo fisico su animali da esperimento. Per il primo metodo, abbiamo usato una maschera temporaneamente apribile che consente la somministrazione intranasale durante l'anestesia per inalazione. La parte apribile della maschera incorpora un tappo di silicone che può essere utilizzato in conformità con la tempistica di somministrazione per facilitare la somministrazione intranasale stabile utilizzando una pipetta. Per il secondo metodo, una cannula è stata inserita chirurgicamente per passare dall'esofago nella cavità nasale, e una pompa a siringa quindi è stata fissata a questo modo che la soluzione della droga potrebbe essere consegnata direttamente e in modo affidabile nella cavità nasale sotto stabile inalazione anestesia. Questo metodo può migliorare la consegna di farmaci nel cervello per via naso--cervello, perché riducendo sostanzialmente gli effetti della MC, sarebbe migliorato droga rimanenza nella cavità nasale. In più, descriviamo un metodo per valutare quantitativamente i livelli di distribuzione di droga (% per il cervello di dose iniettata/g) nel cervello mediante radio-marcato [¹⁴C]-inulina [peso molecolare (MW): 5.000] come substrato modello di solubile in acqua macromolecole.

Protocollo

Questo studio sugli animali (#AP17P004) è stato eseguito in conformità con le linee guida approvate dal comitato di uso (Tokyo, Giappone) e Nihon University Animal Care. Questo studio (n. 17-0001) è stato approvato dal radioisotopo Center della scuola di farmacia, Università di Nihon.

1. gli animali utilizzati per la somministrazione intranasale in anestesia per inalazione

1. Casa topi sperimentali in gabbie di acciaio sotto un ciclo luce/buio di 12 h (luce accesa 8:00 – 20:00), con una temperatura controllata e mantenuta a 23 ° c ± 1 ° C, umidità 50% ± 10%, e ad libitum accesso a cibo e acqua.
2. Prima della sperimentazione, anestetizzare i topi tramite inalazione di 2% isoflurane, dopo l'inizio ad una concentrazione del 4%. Confermare il livello richiesto di amputate controllando per la scomparsa di raddrizzamento superficiale.

2. preparazione della soluzione di amministrazione

1. Preparare una soluzione di amministrazione di [¹⁴C]-inulina (50 μM, μCi/mL 0,5 per topo) diluendo in tampone fosfato salino e conservare a 4 ° C fino all'utilizzo.

3. intranasale amministrazioni per topi

1. Metodo micropipetta utilizzando una maschera di inalazione temporaneamente apribile (Figura 1)
   Nota: Questa tecnica è una modifica del protocollo di somministrazione intranasale utilizzando una micropipetta stabilita da Frey et al. ³
   1. Difficoltà topi in posizione supina su una bacheca legando loro membra sotto anestesia inalazione con isoflurano 2% (Figura 1A).
   2. Amministrare un volume totale di soluzione di amministrazione 25 μL di ogni mouse a intervalli di 30 s, via le dosi di 1-2 μL in alternativa somministrati nelle narici destra e sinistra, mentre i topi sono fissati nell'ambito dell'anestesia per inalazione (Figura 1B e C).
   3. Nota: Rifiuti gas anestetico viene effettuato lo scavenging di mezzo attivo (fume hood, biosicurezza duro canalizzata mobile, vuoto, ecc.) quando viene aperta la maschera e di mezzi passivi (contenitore dei rifiuti gas anestetico) quando chiuso
2. Inserimento di una canula di invertire m etodo dal lato della via aerea tramite l'esofago (Figura 2)
   Nota: Questa tecnica è una modifica del protocollo assorbimento intranasale per ratti stabilito da Hirai et al. ⁷
   1. Difficoltà topi in posizione supina su una bacheca legando loro membra sotto anestesia inalazione con 2% isoflurane.
   2. Capelli del collo sono rasato e predisposto tramite applicazione clorexidina o betadine, seguito da un risciacquo di alcol.
   3. Esporre la trachea e l'esofago espandendo la pelle sotto la gola con forcipe dopo aver fatto una piccola incisione (1,5 cm) con le forbici.
   4. Fare un'incisione (1 mm) nella trachea con le forbici.
   5. Inserire una cannula (diametro interno: 0,58 mm, diametro esterno: 0,965 mm) per una lunghezza di 1,2 cm e collegare l'altra estremità della cannula all'interno della maschera di inalazione.
   6. Fare un'incisione (1 mm) nell'esofago utilizzando le forbici, inserire una cannula (diametro interno: 0,28 mm, diametro esterno: 0,61 mm) per una lunghezza di 1,4 cm verso la parte posteriore della cavità nasale e legare (Figura 2A e B).
      Nota: Le procedure 3.2.2 a 3.2.4, sono state effettuate con un microscopio stereoscopico a ingrandimento × 10.
   7. Fissare un ago (27 × 1/2) una siringa 1 mL riempita con una soluzione di amministrazione e connettersi a una pompa programmabile di micro-siringa.
   8. Collegare di sopra dell'ago cannula che era stata inserita nell'esofago a 3.2.5 (Figura 2).
   9. Amministrare un volume totale di 25 μL [¹⁴C]-soluzione di inulina ad un tasso costante (5 μL/min) (Figura 2 e 2D).

4. quantitativa esperimento utilizzando Radio-marcato macromolecole solubile in acqua ([¹⁴C]-inulina)

1. Decapitare i topi sperimentali nell'ambito dell'anestesia e aprire loro crani, usando le forbici e dal lato del oblongata del midollo, mentre facendo attenzione a non danneggiare il cervello.
2. Estrarre con attenzione l'intero cervello di scavare con una micro-spatola dal cranio.
3. Posto un filtro di carta inumidito con soluzione salina su una piastra Petri che viene memorizzato sul ghiaccio.
4. Posizionare i cervelli estratti sul filtro di carta inumidito.
5. Pulire il sangue aderente alla superficie del cervello con un batuffolo di cotone inumidito con soluzione fisiologica per eliminare almeno l'influenza di [¹⁴C]-inulina nel sangue sulla superficie del cervello.
6. Sezionare il cervello rapidamente e dividerli in tre parti: il bulbo olfattivo, cervello e midollo allungato (tra cui il pons).
7. Posizionare campioni del cervello in solubilizzante di tessuto a 50 ° C per 1 h.
8. Aggiungere 10 μL del cocktail di scintillazione liquida per i campioni di cervello.
9. Trasferire un'aliquota di 25 μL della soluzione di amministrazione sciolta in scintillazione cocktail per un flaconcino di scintillazione per determinare la radioattività della soluzione applicata.
10. Misurare le disintegrazioni al minuto [¹⁴C] radioattività nel campione del cervello ([¹⁴C] X_cervello) e la soluzione applicata ([¹⁴C] X_{IN dose}) in un contatore a scintillazione liquido dotato di un adeguato correzione di crossover per ³H e ¹⁴C.

5. analisi dei dati

1. Calcolare i livelli di distribuzione del farmaco (%) per la dose iniettata (ID %) utilizzando la seguente equazione:
   Cervello di ⁄g % ID = ([¹⁴C] X_cervello/ [¹⁴C] X_dose) × 100,
   dove X_cervello (cervello dpm/g) è la quantità di [¹⁴C] - inulina misurati nel tessuto cerebrale e X_{IN dose} (dpm/25 μL di soluzione) è la concentrazione del [¹⁴C] - inulina nella soluzione usata per somministrazione intranasale.

Risultati

La figura 3 Mostra il [¹⁴C]-livelli di inulina (ID % ⁄g cervello) nel bulbo olfattivo (A), cervello (B) e oblongata del midollo (C) ottenute utilizzando i due tipi di somministrazione intranasale valutati nello studio presente. La somministrazione intranasale mediante la consegna di metodo attivato pipetta [¹⁴C]-inulina nel cervello utilizzando le maschere di inalazione apribile (Figura 1). Nell'ambito dell'...

Discussione

La consegna del naso--cervello di farmaci è prevista per avere un effetto pronunciato su disturbi del sistema nervoso centrale perché questa via rappresenta un percorso di trasporto diretto che bypassa la BBB. Tre differenti vie di naso--cervello sono state segnalate a data⁸. Il primo è la via del nervo olfattivo, che passa dal mucosa olfattivo nella mucosa nasale al proencefalo tramite il nervo olfattivo. La seconda è la via del nervo trigemino, che passa dalla mucosa respiratoria nella mucosa na...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
ddY mouse	Giappone SLC, Inc.		Maschio, 4-6 settimane, 20-30 g
Isoflurano	Pfizer	v002139
Isoflurano configurazione	SHINANO manufacturing CO. LTD.	SN-487-OTAir, SN-489-4
Maschera isoflurano	SHINANO manufacturing CO. LTD.		Per piccoli roditori Maschera
all'isoflurano (tipo apribile)	SHINANO manufacturing CO. LTD.		Ordini speciali
Scatola per anestesia	SHINANO manufacturing CO. LTD.	SN-487-85-02
Forbici per esperimenti animali-1	NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.	B-27H
Forbici per esperimenti sugli animali-2	NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.	Pinzette B-13H-1
	STRUMENTI DI SCIENZA FINE Inc.	11272-30	Dumont #7 Dumoxel
Pinzette-2	NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.	A-12-1
Tubo cannula (PE-50)	Becton, Dickinson and Company.	5069773	D.I.: 0,58 mm, D.E.: 0,965 mm
Tubo cannula (SP-10)	NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.	KN-392	D.I.: 0,28 mm, D.E.: 0,61 mm
Rasoio a pelo	d.C.: MARUKAN, LTD.	DC-381
Microscopio stereoscopico	Olympus Corporation	SZ61
Ago 27G 1/2 in 13 mm	TERUMO CORPORATION	NN-2738R
Siringa da 1 ml	TERUMO CORPORATION	SS-01T
Pompa a siringa	Neuro science	NE-1000
Membrana di cellulosa	Toyo Roshi Kaisya, Ltd.
Micro spatola	Shimizu Akira Inc.	91-0088
Micropipetta (0,5-10 uL)	Eppendorf AG	Z368083
Chip per pipette	Eppendorf AG	0030 000.811
Tape	TimeMed Labeling System, Inc.	T-534-R	Per il fissaggio del mouse
[14C]-Inulina	American Radiolabeled Chemicals Inc.	ARC0124A	0,1 mCi/mL
EtOH	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	054-00461
Contatore a scintillazione liquida	Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Inc	Tri-Carb 4810TR