Qui, presentiamo un protocollo per congelare e sezione di tessuto cerebrale da più animali come alternativa ad alta produttività per singoli cervelli di elaborazione. Questo riduce la variabilità di colorazione durante immunohistochemistry e imaging e tempo cryosectioning.
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Articolo metodologico
Cryosectioning simultanea di più cervelli roditore
In questo articolo
Sommario
Abstract
Istologia e immunohistochemistry sono metodi di routine di analisi per visualizzare l'anatomia microscopica e localizzare le proteine all'interno dei tessuti biologici. In neuroscienze, così come una pletora di altri campi scientifici, queste tecniche sono utilizzate. Immunohistochemistry può essere fatto su tessuto scivolo montato o sezioni digalleggiante. Preparazione dei campioni montata è un processo intensivo di tempo. Il seguente protocollo per una tecnica, denominata Megabrain, ridotto il tempo necessario al tessuto cerebrale donatrici e Monte fino al 90% combinando più cervelli in un unico blocco congelato. Inoltre, questa tecnica ridotta variabilità visto tra turni, in un grande studio istochimico di colorazione. La tecnica attuale è stata ottimizzata per l'utilizzo di tessuto cerebrale dei roditori nelle analisi immunohistochemical a valle; Tuttavia, può essere applicato a diversi ambiti scientifici che utilizzano cryosectioning.
Introduzione
Qui, presentiamo il protocollo per un metodo novello, che noi chiamiamo Megabrain, sviluppato per donatrici roditore più cervelli contemporaneamente per procedure immunohistochemical a valle. Un Megabrain consente la produzione di singole diapositive che contiene il tessuto da più animali. Questa tecnica è stata ottimizzata per tagliare sezioni coronali da 9 emisferi di ratto adulto, o 5 cervello adulto completo, contemporaneamente. Pertanto, la tecnica è più applicabile in studi immunohistochemical grande o altre analisi fatto sul tessuto cerebrale montata da un grande gruppo degli animali.
Immunohistochemistry implica l'uso di anticorpi s....
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Protocollo
La tecnica di Megabrain è stata ottimizzata usando il cervello intero e hemisected da maschio adulto di topi C57Bl65, ratti Sprague-Dawley giovani e ratti Sprague-Dawley adulti che sono stati via con 1x tamponato fosfato salino (PBS) seguita da 4% paraformaldeide6. Risultati simili possono essere realizzati in altri ceppi di topo e di ratto, in entrambi i sessi e a diverse età. Lo studio per generare dati per questo manoscritto usato ratti Sprague-Dawley giovani ed è stato approvato dal comitato di uso e cura degli animali istituzionali di Università dell'Arizona, e animali da esperimento sono stati curati secondo la gui....
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Risultati
Un risultato positivo a questa procedura è il tessuto che si trova pianamente sulla diapositiva, senza bolle o lacrime, l'orientamento in cui erano congelati. Sezioni di tessuto sono spaziate uniformemente apart e facilmente identificabili a causa di buon piazzamento del cervello nei PTOM e buona notazione come dimostrato nella Figura 1. Supponendo che il tessuto cerebrale è stato raccolto da animali di età simile, e che il tessuto è stato allineato correttam.......
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Discussione
Durante questa procedura dovrebbe essere considerato che la temperatura della Megabrain e i suoi dintorni deve essere costantemente monitorata per evitare lo scongelamento e il ri-congelamento del tessuto. Il cervello può essere rimosso solo dal congelatore a-20 ° C fino a 3 volte come ogni volta che viene toccata e sinistra nel criostato, con una temperatura più calda fluttuante, il tessuto si scongela e si ricongela, causando una gelatina come consistenza e l'integrità di tessuto anormale10. Per.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno alcuna informazioni integrative.
Ringraziamenti
Fondi di sostegno di missione PCH supportato la ricerca riferita in questo manoscritto. Gli autori vorrei ringraziare Daniel Griffiths per scattare le immagini utilizzate nelle figure.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT composto (confezione da 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Thermo Scientific Stampi per inclusione monouso Shandon Peel-A-Way Fisher | Scientific | 18-41 | |
| Fisherbrand Pinzette/pinze a punta forte diritte larghe ad alta precisione | Fisher Scientific | 12-000-128 | |
| Fisherbrand 20 mL Fiale a scintillazione HDPE con Tappo in polipropilene | Fisher Scientific | 03-337-23 | |
| Saccarosio, flacone in polietilene 2,5 kg | Fisher Scientific | S2-212 | È necessario compensare sia il 15% che il 30% di saccarosio. |
| 2-metilbutano (certificato), Fisher Chemical | Fisher Scientific | O3551-4 | |
| PYREX Becher a forma alta | Fisher Scientific | 02-546E | |
| Fisherbrand Termometri a immersione parziale per uso generico liquido in vetro (da -50 a +50 ° C) | Fisher Scientific | 13-201-642 | |
| Fisherbrand Scoopula Spatola | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| STANLEY Lama di rasoio | Grainger | 4A807 | |
| Lame per microtomo Edge-Rite | Fisher Scientific | 14-070-60 | |
| Vetrini per microscopio (1" frost) - bianco | Fisher Scientific | 22-034-979 | |
| Gibco PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) 10x, pH 7,2 | Fisher Scientific | 70-013-032 | Diluire a 1X prima dell'uso |
| 15 pezzi pennelli fini | Amazon | B079J12ZRV | |
| PAP pen | abcam abcam | ab2601 | |
| Mandrino mostrato nella Figura 4 è stato realizzato su misura da un tecnico di laboratorio, tuttavia dimensioni simili sono disponibili per l'ordinazione commerciale da altre aziende. | Scienze della microscopia elettronica | EMS065 |
Riferimenti
- Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).
- Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P.
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Ristampe e permessi
