Method Article

Isolamento dei Glomeruli e In Vivo di etichettatura delle proteine di superficie delle cellule glomerulari

DOI:

10.3791/58542

⸱

January 18th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, Medical Faculty, Heinrich-Heine-University, 2Institute of Cellular and Integrative Physiology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui presentiamo un protocollo per l'etichettatura dei Murina in vivo delle proteine di superficie delle cellule glomerulari con biotina. Questo protocollo contiene informazioni su come irrorare i reni del mouse, isolare i glomeruli ed eseguire immunoprecipitazione endogena della proteina di interesse.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteinuria deriva dalla distruzione del filtro glomerulare che è composto dall'endotelio fenestrato e la membrana basale glomerulare podociti con loro fessura diaframmi. La delicata struttura del filtro glomerulare, soprattutto il diaframma a fessura, si basa sull'interazione di proteine della superficie cellulare diversificata. Lo studio di queste proteine di superficie delle cellule è stato finora limitato a studi in vitro o l'analisi istologica. Qui, presentiamo un biotinylation murino in vivo etichettatura metodo, che consente lo studio delle proteine di superficie delle cellule glomerulari in condizioni fisiologiche e patofisiologiche. Questo protocollo contiene informazioni su come irrorare i reni del mouse, isolare i glomeruli ed eseguire endogeno immunoprecipitazione di una proteina di interesse. Semi-quantificazione dell'abbondanza di superficie delle cellule glomerulari è prontamente disponibile con questo metodo novello e tutte le proteine accessibile alla perfusione di biotina e immunoprecipitazione può essere studiato. Isolamento dei glomeruli con o senza biotinylation consente inoltre ulteriori analisi di glomerulare RNA e proteina così come primario delle cellule glomerulari (culturacioè, Podocita primario delle cellule).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteinuria è un segno distintivo della lesione glomerulare e solitamente accompagna la rottura del filtro glomerulare1. Il filtro glomerulare è composto dell'endotelio fenestrato e la membrana basale glomerulare podociti. La delicata struttura molecolare del filtro glomerulare è altamente dinamico e soggetto a proteina di superficie delle cellule traffico in entrambi i reni sani e malati2,3,4,5,6 . Endocitosi di proteine di superficie delle cellule ha dimostrato di essere essenziale per la sopravvivenza di podociti7. Nefrina e Podocalixina sono proteine transmembrana espresse su podociti. Nefrina è la spina dorsale del diaframma fessura glomerulare, mentre Podocalixina è un sialoglycoprotein rivestimento i processi secondari piede di podociti8,9,10. Endocitico traffico precedentemente è stato indicato per Nefrina e Podocalixina3,11,12,13,14.

Al meglio della nostra conoscenza, endocitosi delle proteine della superficie cellulare ancora non sono stata descritta in cellule endoteliali glomerulari nella letteratura. Tuttavia, le cellule endoteliali esprimono in generale tutte le proteine necessarie per i diversi tipi di endocitosi (cioè, endocitosi clatrina-dipendente, zattera-dipendente)15,16. Pertanto, traffico di superficie delle cellule endoteliali può essere studiato con questo metodo, utilizzando, ad esempio, vascolare endoteliale (VE)-caderina e molecola intracellulare di adesione (ICAM-2) come una cella di superficie proteina marker per cellule endoteliali glomerulari17 .

Purtroppo, non c'è nessun modello preciso in vitro per il filtro glomerulare a tre strati delicato in quale cella può essere studiato il traffico della proteina di superficie. L'obiettivo di questo metodo è così di studiare glomerulare proteine traffico in vivo. Inoltre, questo protocollo contiene informazioni su come isolare i glomeruli, consentendo l'ulteriore analisi di RNA, proteine o cellule glomerulari. Isolamento glomerulare simile tecniche sono state descritte da diversi gruppi di18,19.

In precedenza, noi ed altri abbiamo usato ex vivo etichettatura delle proteine di superficie delle cellule glomerulari di biotinilazione2,3,4,20,21. Tuttavia, in questo metodo ex vivo , glomeruli isolati sono stati esposti a sollecitazioni meccaniche, che possono influenzare il traffico endocitico. In alternativa, immunofluorescenza etichettatura delle proteine di superficie delle cellule glomerulari è stato utilizzato estesamente nella letteratura2,20,22. Con questo metodo, tuttavia, solo un piccolo numero di proteine possa essere analizzato all'interno di una diapositiva, e quantificazione delle immagini di immunofluorescenza è spesso difficile.

Questo metodo di romanzo in vivo offre uno strumento affidabile per lo studio delle cellule glomerulari proteina di superficie abbondanza e traffico accurato in sani e malati reni, e può essere utilizzato in aggiunta al test di immunofluorescenza.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Topi sono stati ottenuti come un in-House di razza provenienti dall'impianto di cura degli animali locali o da Janvier Labs in Francia. Le indagini sono state condotte secondo le linee guida descritte nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (US National istituti di salute pubblicazione n. 85-23, rivisto 1996). Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le pertinenti approvazioni istituzionale (dichiari il governo LANUV AZ:84 numero di riferimento-02.04. 2016.A435).

1. preparazione di strumenti, soluzioni e attrezzature

  1. Preparare 1 L di soluzione fisiologica tamponata con fosfato completato con 1 mM di cloruro di magnesio (MgCl2) e 0,1 mM di cloruro di calcio (CaCl2) (PBSCM) e filtrare attraverso un filtro sterile.
  2. Preparare 5 mL di PBSCM sterile per topo per aspersione e posizionarlo sul ghiaccio.
  3. Per ogni mouse, preparare 5 mL di sterile PBSCM completati con biotina di 0,5 mg/mL.
  4. Per ogni mouse, preparare 5 mL di PBSCM sterile e aggiungere 0,8 x 108 biglie magnetiche (ad es., 200 µ l di una soluzione di8 perline/mL 4 x 10, senza pretrattamento) per il embolization dei glomeruli. Preparare questa soluzione sotto la panca di coltura cellulare per mantenere i branelli magnetici nel tubo originale sterile. Posto questa soluzione sul ghiaccio.
  5. Preparare una soluzione tempra aggiungendo glicina di 100 mM per PBSCM (5 mL per topo) e tenerlo sul ghiaccio.
  6. Preparare una soluzione di collagenasi (0.378 U/mL collagenosi A in PBSCM sterile). Per topo, Pipettare 1 mL della soluzione della collagenosi in una provetta da 2 mL e posizionarlo sul ghiaccio.
  7. Per il lavaggio, preparare PBSCM sterile (Vedi punto 1.1) in 50 mL di un tubo e collocarlo sul ghiaccio.
  8. Per aspersione, è possibile utilizzare una pompa a siringa con un flusso di 2,0 mL/min.
  9. Preparare una siringa da 10 mL con ago 21G. Posizionare la punta dell'ago in un catetere lungo 20-30 cm (diametro interno, ID = 0,58 mm). Collegare il catetere (ID 0,58 mm) con un catetere corto di 10 cm (ID 0,28 mm) e tagliare la punta del catetere più piccolo obliquo per un facile inserimento in aorta del mouse.
  10. Per le procedure di legatura durante l'intervento chirurgico, tagliare tre fili di seta 5-7 cm (4-0 6-0) del mouse.
  11. Per la chirurgia, preparare 3 clamp chirurgiche, 2 forbici chirurgiche, 2 pinzette, 2 pinzette bene, 1 forbice fine e tamponi. Preparare l'anestesia (ad es., anestesia intraperitoneale ketamina 100 mg/kg di peso corporeo e xilazina 5 mg/kg di peso corporeo).
  12. Per l'isolamento dei glomeruli dei due reni, utilizzare un colino di cella di 100 µm, due provette da 50 ml e un catcher di magnete.
  13. Preparare CHAPS buffer di lisi: 20 mM 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS); 20 mM Tris (idrossimetil)-aminomethan (Tris) pH 7.5; sodiumchorlide 50 mM (NaCl); sodiumfluoride 50 mM (NaF); 15 mM Na4P2O7; 0,1 mM etilendiamminotetraacetico (EDTA) l'acido a pH 8.0; sodiumorthovanadate di 2 mM; e 2 mM adenosinetriphosphat (ATP).
  14. Centrifughe raffreddare a 4 ° C.

2. chirurgia sotto il microscopio

  1. Anestetizzare il mouse (per esempio, con chetamina/xilazina intraperitonealmente, vedi punto 1.11). Eseguire il test toe-pizzico per confermare l'anestesia adeguata.
  2. Disinfettare il lato ventrale del mouse con 70% di isopropanolo.
  3. Eseguire un taglio mediano attraverso la pelle dal bacino allo sterno e togliere la pelle dalla fascia addominale con una pinzetta. Tagliare la pelle su entrambi i lati al centro dell'addome con forbici chirurgiche.
  4. Cambiare strumenti chirurgici. Applica un taglio mediano da xifoideo alla vescica attraverso lo strato del muscolo addominale e dividerli in quattro quadranti utilizzando pinzette e forbici chirurgiche. Fissare la parte superiore due con morsetti verso il collo del mouse con due pinze chirurgiche.
    Nota: L'addome è ora aperto.
  5. Mettere da parte con un tampone sterile negli organi viscerali e tagliare il legamento epatico-frenico con forbice.
  6. Preparare una legatura (con un filo di seta 4-0 6-0) intorno all'aorta prossimale delle arterie renali all'altezza della ghiandola surrenale con due pinzette bene. Stringere la legatura aortica prossimale per abolire il flusso sanguigno con una pinzetta.
  7. Gratis l'aorta distale da gronda, grasso e altri tessuti e preparare una legatura intorno all'arteria epatica/mesenterica craniale delle arterie renali con pinzette chirurgiche bene.
  8. Preparare una legatura (con un filo di seta 4-0 6-0) intorno all'aorta distale delle arterie renali e bloccare la vena cava e aorta all'altezza della biforcazione.
  9. Tagliare un piccolo foro nell'aorta distale per le arterie renali affinché il foro è metà del diametro dell'aorta. Mettere il catetere in aorta e fissarlo con la legatura preparata.
    Attenzione: Evitare le bolle nel sistema di perfusione per prevenire emboli d'aria.
  10. Iniziare la perfusione con la gelida PBSCM ad una portata di 2 mL/min.
  11. Praticare un foro nella vena renale a livello delle arterie renali con forbici chirurgiche bene e stringere la legatura intorno le arterie epatiche e mesenteriche.
    Nota: Dopo aver avviato la perfusione reni devono impallidire.

3. in Vivo biotinilazione

  1. Cambiamento della siringa priva di bolle per PBSCM ghiacciata integrati con biotina di 0,5 mg/mL per l'etichettatura di superficie e irrorare i reni con 5 mL ad una portata di 2 mL/min.
    Nota: Mescolare le soluzioni PBSCM (ad es., ruotando le provette da 50 mL) delicatamente per evitare la formazione di bollicine all'interno della soluzione. Dopo l'aspirazione della soluzione all'interno della siringa, evacuare eventuali bolle o l'aria dalla siringa. Utilizzare una cannula supplementare (21G) sulla siringa per riempire lo spazio nella cannula che è collegato al sistema di catetere. Infine, attaccare la siringa nella cannula con il catetere senza bolle.
  2. Modificare la siringa priva di bolle ghiacciate PBSCM completati con glicina 100mm per placare i glomeruli e irrorare con 5 mL a un flusso di 2 mL/min.
  3. Cambiamento della siringa priva di bolle per PBSCM ghiacciata completati con 200 μL magnetico perline/mL e irrorare i reni a 2 mL/min.
    Nota: Sulla superficie del rene, il embolization dei glomeruli con biglie magnetiche marrone sarà visibile.

4. isolamento dei Glomeruli da due reni

  1. Rimuovere i reni all'ILO e la capsula. Mettere i reni sul ghiaccio in 15 mL di PBSCM in una piastra di coltura delle cellule di 10 cm. Eutanasia il mouse con dislocazione cervicale in anestesia dopo la raccolta i reni. Le procedure di chirurgia e perfusione durano circa 20-22 min.
  2. Tagliare i reni in pezzi più piccoli possibile con una nuova lama a doppio taglio. Spostare il tessuto in una provetta da 2 mL con 1 mL di collagenasi A (Vedi punto 1.6) e digest a 37 ° C per 30 min. Prima e dopo la digestione, mescolare delicatamente con un 1000 μL tagliare pipetta.
  3. Sciacquare il tessuto digerito attraverso un colino di cella μm 100 utilizzando PBSCM ghiacciata. Utilizzare delicatamente il cella-raschietto per tritare il trogolo di tessuto restante del filtro cella e sciacquarlo con gelida PBSCM in seguito ad un volume totale di 50 mL.
  4. Centrifugare la sospensione a 4 ° C 500 x g per 5 min. eliminare il surnatante e risospendere il sedimento con poco meno di 1,5 mL di PBSCM ghiacciata mentre nel Vortex il pellet. In seguito, mettere la sospensione glomerulare in una nuova provetta da 2 mL.

5. lavaggio

  1. Utilizzare il catcher di magnete per tirare i glomeruli di lato. Attendere 1 minuto prima glomeruli sono spostati verso il magnete.
  2. Rimuovere il surnatante con una pipetta di 1000 μL mentre il tubo 2ml rimane nel catcher di magnete. Durante il lavaggio primo e la secondo procedura (Vedi punto 5.3), 250 μL del surnatante rimane nel tubo per evitare la perdita dei glomeruli. Eseguire questa procedura rapidamente per evitare le infiltrazioni di strutture tubolari sul fondo del tubo.
    Nota: La procedura di lavaggio durerà più a lungo in caso contrario.
  3. Rimuovere la provetta da 2 mL da catcher magnete e aggiungere 1 mL di PBSCM, pipetta su e giù (molto importante), poi vortice.
  4. Rimettere il tubo il catcher di magnete e ricominciare dal punto 5.2.
  5. Ripetere i passaggi di lavaggio finché la purezza dei glomeruli ha raggiunto il 90%. Per questo, è necessario esaminare un'aliquota rappresentativa del surnatante sotto un microscopio (40-100 X).
    Nota: Glomeruli apparirà come rotonde strutture contenenti marrone biglie magnetiche. Strutture allungate sono frammenti tubolare e gratuiti biglie magnetiche vengono visualizzati come punti rotondi marrone. Detriti cellulari potrebbero apparire come strutture ingombranti.
  6. Se viene raggiunta la purezza, stimare il numero dei glomeruli sciogliendo i glomeruli in 1 mL di PBSCM. Dopo la miscelazione, prendere un'aliquota di 10 μL e contare i glomeruli sotto il microscopio. Calcolare il numero di glomeruli con la seguente equazione: numero finale dei glomeruli = numero dei glomeruli in 10 μL aliquota x 100.
  7. Successo isolamento dei glomeruli conduce ad una gamma di 10.000-40.000 glomeruli.

6. proteina estrazione e immunoprecipitazione (IP)

  1. Glomeruli Raccogli mediante centrifugazione a 4 ° C a 6800 x g per 5 min. eliminare il surnatante mentre usando un catcher di magnete e risospendere il pellet in tampone di lisi ghiacciata (ad es., 30.000 glomeruli in 300 μL; SCREPOLATURE, vedi punto 1.11). I campioni di omogeneizzare con un omogeneizzatore del tessuto alla massima velocità per 30 s e li lisare in ghiaccio per 30 min.
  2. Rimuovere il materiale insolubile mediante centrifugazione a 15.000 x g per 30 min a 4 ° C. Dispensare il surnatante che include la cella lysata in una nuova provetta da 1,5 mL. Scartare il pellet.
  3. Misurare la concentrazione di proteina del surnatante utilizzando un bicinconinico (BCA)-basato su metodo seguendo le istruzioni del produttore. Una riuscita lisi dei 30.000 glomeruli produce una quantità di proteine glomerulare di 700-1.000 µ g/mL. Adattarsi alla quantità di proteina uguale con tampone di lisi.
  4. Prendere un'aliquota del 10% del volume totale per glomerulare lisato e aggiungere 2 x Laemmli + dithiothreithol (DTT) prima dell'incubazione per 5 min a 95 ° C.
  5. Per IP, incubare il resto del lisato con streptavidina agarosio perle durante la notte a 4 ° C su agitatore overhead.
  6. Centrifuga dell'agarosi branelli a 1000 x g per 3 min a 4 ° C, eliminare il surnatante e aggiungere 800 μL di tampone di lisi per lavare le perle per legame con le proteine aspecifiche.
  7. Ripetere il lavaggio 3 volte e rimuovere il surnatante completamente.
  8. Aggiungere 30 μL di 2x Laemmli + DTT e incubare a 95 ° C per 5 min.
  9. Caricare il lisato e sonde IP su un 10% SDS del gel ed eseguire il gel di SDS a 70 V per 30 min, poi al 20 mA al gel per 1,5 h. in seguito, asciugare il gel per 2 h a 200 mA su una membrana di nitrocellulosa.
  10. Bloccare la membrana di nitrocellulosa durante la notte a 4 ° C con 5% albumina di siero bovino (BSA) in tampone di lavaggio.
  11. Incubare la membrana con l'anticorpo di interesse durante la notte a 4 ° C. Lavare con buffer 3 volte per 5 minuti su un agitatore di lavaggio e incubare la membrana con l'anticorpo secondario HRP-etichetta per 1 h a temperatura ambiente. Ripetere la fase di lavaggio.
  12. Visualizzare il lisato e immunoprecipitazione sonde sulla membrana utilizzando un agente chemiluminescente di Super-risoluzione con una camera CCD.

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Results

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Per isolare i glomeruli con precisione, è necessario irrorare murini reni con PBSCM prima. Aspersione con PBSCM trasforma reni pallidi (Figura 1A). Il embolization di glomeruli con biglie magnetiche saranno visibile come puntini marroni sulla superficie del rene (Figura 1B). Isolamento dei glomeruli con il catcher magnete può mostrare la contaminazione con tubuli renali (Figu...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il metodo proposto permette di successo isolamento dei glomeruli di indagare glomerulare RNA o proteine. Inoltre, colture primarie di cellule glomerulari possono essere eseguite da glomeruli isolati. Se biotina viene applicata prima di isolamento glomerulare, etichettatura delle proteine di superficie delle cellule glomerulari può essere eseguita. Con questo metodo, in vivo delle cellule glomerulari traffico della proteina di superficie possa essere studiato e semi-quantificazione dell'abbondanza di proteine è p...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori ringraziano Blanka Duvnjak per la sua assistenza tecnica eccezionale. Questo lavoro è stato supportato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1 a M.W. e QU280/3-1 a I.Q. Il finanziatore non aveva alcun ruolo nel disegno di studio, raccolta dati, analisi dei dati, decisione di pubblicare e preparazione del manoscritto.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Motic SMZ168 BLMoticmicroscopio SMZ168BLper chirurgia del topo
KL1500LCDPulch e Lorenz microscopia150500luce per chirurgia del topo
Rompun (Xilazina) 2%BayerPZN:01320422anestesia
MicrofederschereBraun, AesculapFD100Rforbici fini, per taglio nell'aorta
Durotip Feine ScherenBraun, AesculapBC210Rper taglio addominale
Anatomische PinzetteBraun, AesculapBD215Rper chirurgia fino all'apertura dell'addome
parierklemmeAesculapBJ008Rper chirurgia 
SeraflexSerag WiessnerIC108000filo di seta
Ketamina 10%AnestesiaMedistar
Rompun (Xylazin) 2%AnestesiaBayer
Tubo in polietilene a foro fine ID 0,28 mm OD 0,61 mmPortex800/100/100Catetere
Tubo in polietilene a foro fine ID 0,58 mm OD 0,96 mmCateterePortex800/100/200
Harvard apparatus 11 PlusHarvard Apparatus70-2209pompa a siringa
EZ-link Sulfo-NHC-LC-BiotinThermo Scientific21335biotina
Dynabeads Untouched Mouse T-cellsInvitrogen11413Dper embolizzare i glomeruli
Collagenase ARoche10103578001per digerire il tessuto renale
DynaMag-2Invitrogen123.21DFermamagneti
100µ coloratore di cellule mGreiner-bio542000per isolamento glomerulare
Axiovert 40 CFLZeissnon disponibileper confermare la purezza glomerulare
TissueRuptorQuiagen9002755 Omogeneizzatore tissutale
CHAPSSigma-AldrichC3023per tampone di lisi
Tris-HCLSigma-AldrichT5941per tampone
NaClVWR prodotti chimici27810295per tampone di lisi
NaFSigma-Aldrich201154per tampone di lisi
EDTASigma-AldrichE5134per tampone di lisi
ATPSigma-Aldrich34369-07-8per tampone di lisi
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225le istruzioni del produttore
anticorpo nefrinicoProgenGP-N2per westernblot
Anticorpo policlonale di capra anti-podocalyxinR& D SystemsAF15556-SPper westernblot
Resina di agarosio di streptavidinaThermo Scientific20347per immunoprecipitazione
Proteina A sefarosio CL-4BGE Healthcare17096303per immunoprecipitazione
policlonale di coniglio anticorpo anti-p57SCBTsc-8298per immunoistochimica
monoclonale di topo anti-beta actina anticorpo, clone AC-74Sigma-AldrichA2228Western blot controllo del carico
di coniglio anti-p44/42segnalazione cellulare4695per westernblot
Pierce Streptavidina-HRP ad alta sensibilità ThermoScientific21130per western blot
policlonale di topo ICAM-2 anticorpo R& D SystemsAF774per topo policlonale westernblot
anti-VE-caderinaR& D SystemsAF1002per westernblot
di lisi Segui

References

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Glomerular IsolationIn Vivo BiotinylationCell Surface Protein LabelingKidney PerfusionMagnetic Bead PurificationGlomerular Cell Surface ProteinsNephrin Podocalyxin AnalysisImmunoprecipitation MethodProtein Trafficking StudyPrimary Podocyte Culture

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