Qui presentiamo un protocollo per l'etichettatura dei Murina in vivo delle proteine di superficie delle cellule glomerulari con biotina. Questo protocollo contiene informazioni su come irrorare i reni del mouse, isolare i glomeruli ed eseguire immunoprecipitazione endogena della proteina di interesse.
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Articolo metodologico
Isolamento dei Glomeruli e In Vivo di etichettatura delle proteine di superficie delle cellule glomerulari
In questo articolo
Sommario
Abstract
Proteinuria deriva dalla distruzione del filtro glomerulare che è composto dall'endotelio fenestrato e la membrana basale glomerulare podociti con loro fessura diaframmi. La delicata struttura del filtro glomerulare, soprattutto il diaframma a fessura, si basa sull'interazione di proteine della superficie cellulare diversificata. Lo studio di queste proteine di superficie delle cellule è stato finora limitato a studi in vitro o l'analisi istologica. Qui, presentiamo un biotinylation murino in vivo etichettatura metodo, che consente lo studio delle proteine di superficie delle cellule glomerulari in condizioni fisiologiche e patofisiologiche. Questo protocollo contiene informazioni su come irrorare i reni del mouse, isolare i glomeruli ed eseguire endogeno immunoprecipitazione di una proteina di interesse. Semi-quantificazione dell'abbondanza di superficie delle cellule glomerulari è prontamente disponibile con questo metodo novello e tutte le proteine accessibile alla perfusione di biotina e immunoprecipitazione può essere studiato. Isolamento dei glomeruli con o senza biotinylation consente inoltre ulteriori analisi di glomerulare RNA e proteina così come primario delle cellule glomerulari (culturacioè, Podocita primario delle cellule).
Introduzione
Proteinuria è un segno distintivo della lesione glomerulare e solitamente accompagna la rottura del filtro glomerulare1. Il filtro glomerulare è composto dell'endotelio fenestrato e la membrana basale glomerulare podociti. La delicata struttura molecolare del filtro glomerulare è altamente dinamico e soggetto a proteina di superficie delle cellule traffico in entrambi i reni sani e malati2,3,4,5,6 . Endocitosi di proteine di superficie delle cellule ha dimostrato di essere essenziale....
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Protocollo
Topi sono stati ottenuti come un in-House di razza provenienti dall'impianto di cura degli animali locali o da Janvier Labs in Francia. Le indagini sono state condotte secondo le linee guida descritte nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (US National istituti di salute pubblicazione n. 85-23, rivisto 1996). Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le pertinenti approvazioni istituzionale (dichiari il governo LANUV AZ:84 numero di riferimento-02.04. 2016.A435).
1. preparazione di strumenti, soluzioni e attrezzature
- Preparare 1 L di soluzione fisiologica tamponata con fosfato com....
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Risultati
Per isolare i glomeruli con precisione, è necessario irrorare murini reni con PBSCM prima. Aspersione con PBSCM trasforma reni pallidi (Figura 1A). Il embolization di glomeruli con biglie magnetiche saranno visibile come puntini marroni sulla superficie del rene (Figura 1B). Isolamento dei glomeruli con il catcher magnete può mostrare la contaminazione con tubuli renali (Figu.......
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Discussione
Il metodo proposto permette di successo isolamento dei glomeruli di indagare glomerulare RNA o proteine. Inoltre, colture primarie di cellule glomerulari possono essere eseguite da glomeruli isolati. Se biotina viene applicata prima di isolamento glomerulare, etichettatura delle proteine di superficie delle cellule glomerulari può essere eseguita. Con questo metodo, in vivo delle cellule glomerulari traffico della proteina di superficie possa essere studiato e semi-quantificazione dell'abbondanza di proteine è p.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Blanka Duvnjak per la sua assistenza tecnica eccezionale. Questo lavoro è stato supportato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1 a M.W. e QU280/3-1 a I.Q. Il finanziatore non aveva alcun ruolo nel disegno di studio, raccolta dati, analisi dei dati, decisione di pubblicare e preparazione del manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Motic SMZ168 BL | Motic | microscopio SMZ168BL | per chirurgia del topo |
| KL1500LCD | Pulch e Lorenz microscopia | 150500 | luce per chirurgia del topo |
| Rompun (Xilazina) 2% | Bayer | PZN:01320422 | anestesia |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | forbici fini, per taglio nell'aorta |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | per taglio addominale |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | per chirurgia fino all'apertura dell'addome |
| parierklemme | Aesculap | BJ008R | per chirurgia |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | filo di seta |
| Ketamina 10% | Anestesia | Medistar | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Anestesia | Bayer | |
| Tubo in polietilene a foro fine ID 0,28 mm OD 0,61 mm | Portex | 800/100/100 | Catetere |
| Tubo in polietilene a foro fine ID 0,58 mm OD 0,96 mm | Catetere | Portex | 800/100/200 |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | pompa a siringa |
| EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | biotina |
| Dynabeads Untouched Mouse T-cells | Invitrogen | 11413D | per embolizzare i glomeruli |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | per digerire il tessuto renale |
| DynaMag-2 | Invitrogen | 123.21D | Fermamagneti |
| 100µ coloratore di cellule m | Greiner-bio | 542000 | per isolamento glomerulare |
| Axiovert 40 CFL | Zeiss | non disponibile | per confermare la purezza glomerulare |
| TissueRuptor | Quiagen | 9002755 Omogeneizzatore tissutale | |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | per tampone di lisi |
| Tris-HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | per tampone |
| NaCl | VWR prodotti chimici | 27810295 | per tampone di lisi |
| NaF | Sigma-Aldrich | 201154 | per tampone di lisi |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | per tampone di lisi |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | per tampone di lisi |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | le istruzioni del produttore |
| anticorpo nefrinico | Progen | GP-N2 | per westernblot |
| Anticorpo policlonale di capra anti-podocalyxin | R& D Systems | AF15556-SP | per westernblot |
| Resina di agarosio di streptavidina | Thermo Scientific | 20347 | per immunoprecipitazione |
| Proteina A sefarosio CL-4B | GE Healthcare | 17096303 | per immunoprecipitazione |
| policlonale di coniglio anticorpo anti-p57 | SCBT | sc-8298 | per immunoistochimica |
| monoclonale di topo anti-beta actina anticorpo, clone AC-74 | Sigma-Aldrich | A2228 | Western blot controllo del carico |
| di coniglio anti-p44/42 | segnalazione cellulare | 4695 | per westernblot |
| Pierce Streptavidina-HRP ad alta sensibilità Thermo | Scientific | 21130 | per western blot |
| policlonale di topo ICAM-2 anticorpo R | & D Systems | AF774 | per topo policlonale westernblot |
| anti-VE-caderina | R& D Systems | AF1002 | per westernblot |
Riferimenti
- Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. Podocyte biology for the bedside. American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).
- Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin en....
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Ristampe e permessi
