Qui presentiamo una tecnica di iniezione intratecale diretto utilizzo 1% lidocaina cloridrato in una soluzione virale per garantire una consegna efficiente virus adeno-associato ai piccoli animali e stabilire un sistema di scoring per predire l'efficienza di trasduzione in zona centrale sistema nervoso secondo il grado della debolezza transitoria indotta da lidocaina.
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Articolo metodologico
Diretto iniezione intratecale di ricombinanti Virus Adeno-associato in topi adulti
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Iniezione intratecale (IT) di virus adeno-associato (AAV) ha attirato notevole interesse nella terapia genica CNS in virtù della sua sicurezza, invasività ed eccellente trasduzione efficacia nello SNC. Precedenti studi hanno dimostrato la potenza terapeutica della terapia genica AAV-consegnato nei disordini neurodegenerative da essa amministrazione. Tuttavia, sono stati segnalati alti tassi di guasto imprevedibile a causa dei limiti tecnici di amministrazione IT nei piccoli animali. Qui, abbiamo stabilito un sistema di scoring per indicare la misura del successo della puntura lombare in piccoli animali con l'aggiunta di 1% lidocaina cloridrato nella soluzione di iniezione. Più ulteriormente indichiamo che l'estensione della debolezza transitoria dopo l'iniezione può prevedere l'efficienza di trasduzione di AAV. Così, questo metodo di iniezione IT può essere utilizzato per ottimizzare le prove terapeutiche in modelli murini di malattie del SNC che affliggono vaste regioni del SNC.
Introduzione
AAV possono mediare l'espressione genica a lungo termine e diffuso nella trasduzione del CNS con pochi effetti collaterali e quindi è diventato uno dei veicoli più promettenti per la terapia genica per il trattamento di malattie del SNC tra cui la sclerosi laterale amiotrofica (ALS), Huntington malattia di s (HD), morbo di Alzheimer (annuncio), malattie da accumulo lisosomiale (LSD), malattia di Gaucher (GD) e Lipofuscinosi ceroido (NCL)1. Attualmente, più di 100 AAV sierotipi sono stati isolati dagli esseri umani e animali. Tra questi, almeno 12 sono stati utilizzati in studi preclinici e clinici, tra cui i più comunemente utilizzati vettori del gene come AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 e rAAVrh.101,2,3,4, 5,6.
Diverse malattie del SNC richiedono diverse strategie di consegna AAV a causa delle varie regioni colpite CNS e tipi di cellule. Le regioni dello SNC e la cella tipi che possono trasdurre AAV varia a seconda del sierotipo così come il metodo di consegna. Ad esempio, rAAVrh10 è stato indicato di trasdurre principalmente astrociti quando consegnato da iniezione sistemica per via endovenosa (IV), considerando che esso trasdotte sia i neuroni e cellule gliali quando consegnato dall'iniezione intratecale4,7. Inoltre, parenchima iniezione ha provocato nella trasduzione del locale alla vicinanza del sito di iniezione, mentre iniezione nel fluido cerebrospinale (CSF) attraverso intraventricolare o iniezione intratecale ha provocato diffuso trasduzione del CNS8 . Gli studi hanno anche dimostrato potenza terapeutica della terapia genica AAV-consegnato nei disordini neurodegenerative da esso amministrazione9,10,11. In malattie che colpiscono vaste aree del SNC quali ALS, iniezione intratecale nel CSF è stato indicato per coprire la maggior parte delle aree che sono afflitti dalla malattia con una dose più bassa, rispetto a un metodo di consegna sistemica4,10. Recenti studi hanno inoltre dimostrato che la puntura lombare può essere usata per iniettare AAV in modelli murini per la SLA, che evita potenziali infortuni connessi con laminectomy e intrathecal cateterizzazione4.
Puntura lombare diretta sperimentale fu usata per trasportare gli agenti, soprattutto anestetici, al midollo spinale per analgesia e anestesia in 188512,13. In questo rapporto, illustriamo la puntura lombare metodo di iniezione di IT in topi adulti con l'ausilio di cloridrato di 1% della lidocaina, un anestetico locale di ammide derivata, della soluzione di iniezione per valutare e monitorare la qualità di iniezione. Iniezioni di successo furono segnate da paralisi transitoria indotta da lidocaina, mentre le iniezioni non riuscite non hanno mostrato questo comportamento. Abbiamo classificato il livello di debolezza transitoria come uno dei cinque gradi per contribuire a predire l'efficacia dell'iniezione. Infine, indichiamo che il livello di trasduzione rAAVrh10 può essere previsto per il grado di paralisi. Pertanto, questo metodo di consegna intrathecal AAV può essere utilizzato per migliorare la consegna del gene AAV-mediata per la terapia sperimentale delle malattie del SNC.
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Protocollo
Topi FVB/NJ sono stati allevati nella struttura animali di laboratorio chiave di Hebei neurologia. Tutti gli esperimenti del mouse sono stati approvati dal secondo ospedale di Hebei Medical University comitato etico ed effettuati secondo le norme di gestione degli animali di laboratorio promulgata dal Ministero della scienza e della tecnologia della Repubblica popolare di Cina.
1. preparazione della soluzione di riserva di 20% lidocaina cloridrato
- Pesano 2 g di cloridrato di lidocaina. Aggiungere delicatamente 5 – 6 mL di acqua sterile e vortex. Aumentare il volume per un totale di 10 mL con acqua sterile.
- 1.2 filtrare la soluzione attraverso filtri da 0,2 micron. Aliquota della soluzione di riserva, 1ml per microcentrifuga da 1,5 mL tubo e sigillarla con una pellicola sigillante. Conservare a 4 ° C.
2. Intrathecal AAV recapito diretto in topi svegli
- Pulire l'area di lavoro con garza sterile con etanolo al 70% e preparare i rifornimenti necessari, come indicato nella tabella 1.
- Preparare 100 µ l di AAVrh.10/1% lidocaina cloridrato complesso aggiungendo 95 µ l della soluzione di riserva di rAAVrh10 (5 x 1012 genoma copie/mL) in una microcentrifuga sterile a 200 µ l e aggiungere 5 µ l di soluzione madre di 20% lidocaina cloridrato. Miscelare bene pipettando su e giù. Quindi, conservare la soluzione di virus su ghiaccio (4 ° C).
Nota: verrà utilizzato 8 µ l per mouse4 . -
Preparazione della siringa con la soluzione AAV per iniezione
- Assemblare un 25 µ l Hamilton siringa con un ago 27G e allineare la punta smussata dell'ago con la scala volumetrica sulla siringa.
- Aspirare delicatamente 8 µ l con 4 x 1010 copie del genoma della soluzione virus nella siringa. Assicurarsi di rimuovere le bolle d'aria.
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Preparando il mouse
Nota: topi FVB/NJ maschio o femminili (30 – 70 giorni) sono stati usati in questo studio. Iniezione di IT è stato operato nella cappa.- Sterilizzare la zona di lavoro in un cappuccio con etanolo al 70%. Mettere il mouse sveglio (maschi o femminile, 30 – 70 giorni di età, 13 – 20 g di peso) su un bedpiece in posizione prona nella cappa. Coprire la parte superiore del corpo con garza sterile per calmare il mouse ed evitare di essere morso.
- Difficoltà l'animale afferrandolo saldamente e in modo appropriato sulla sua cintura pelvica con un pollice su un lato e l'indice, medio dito su altro lato. Mantenere la pelle tra bilaterali nelle cinture pelviche tese con il pollice e l'indice. Tenere premuto delicatamente sulla parte superiore del corpo dell'animale con il palmo della mano.
- Radere il pelo sul dorso tra il cingolo pelvico bilaterale, quindi sterilizzare la superficie della pelle con un etanolo di macchia e il 70% basato su ioduro.
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Di iniezione intratecale12
- Sentite lo spazio intervertebrale lungo la linea mediana tra il cingolo pelvico bilaterale con un pollice o l'indice di altra mano e premere un rientro con un'unghia per indicare lo spazio intervertebrale L5-L6 (individuare il sito di iniezione).
- Ruotare la base della coda leggermente e delicatamente per indicare la linea mediana della colonna vertebrale. Regolare la smussatura dell'ago verso la testa dell'animale prima dell'iniezione (menzionato al punto 2.3.1).
- Assicurarsi che gli animali sono fissati saldamente e allineare l'ago lungo la linea mediana della colonna vertebrale.
- Inserire l'ago delicatamente e verticalmente (o inclinare leggermente il 70 – 80°) nell'intersezione di rientro e tenere la siringa in un piano sagittale centrale. Ridurre l'angolo di circa 30° lentamente quando si connette l'osso, poi scivolare l'ago nello spazio intervertebrale.
Nota: Un flick evidente coda improvvisa è un segno di successo entrata nello spazio intradural. Una volta che l'ago entra nello spazio intervertebrale, la punta dell'ago si sentirà saldamente fissata. L'ago 27 G utilizzato in questo studio è adatto per la fornitura IT in topi ma non ratti. - Iniettare la soluzione di vettore (indicata nel passaggio 2.2). Avvia il timer e iniettare 8 µ l della soluzione vettoriale ad una velocità di 1 µ l/4 s. Mantieni l'ago circa 1 minuto dopo aver terminato consegna. Ritirare l'ago con una delicata rotazione per evitare perdite.
- Punteggio ottenuto la debolezza transitoria del mouse arti immediatamente dopo il parto per valutare la qualità di iniezione4.
Nota: Lo standard è la seguente4. Punteggio 0: nessuna debolezza; Punteggio 1: minore debolezza degli arti posteriori senza anomalia di andatura; Punteggio 2: moderi la debolezza degli arti posteriori con anomalia di andatura ovvio; Punteggio 3: completare la paralisi degli arti posteriori; Punteggio 4: completa paralisi degli arti posteriori, mancanza di respiro e moderata debolezza degli arti anteriori; e punteggio 5: completa paralisi di tutti e quattro gli arti e la evidente mancanza di respiro. - Spostare il mouse indietro per la gabbia per il recupero da paralisi.
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Pulizia
- Lavare la siringa con 1 mL di acqua sterile. Ordinare le forniture di laboratorio e raccogliere tutti i materiali riutilizzabili per la sterilizzazione in autoclave. Pulire il banco con etanolo al 70%.
3. preparazione per la macchiatura di Immunohistochemical
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Collezione tessuti
- Anestetizzare profondamente topi ad post-iniezione 21 giorni con 3% cloralio idrato (0,1 mL/10g) tramite l'iniezione intraperitoneale.
- Irrorare via con 20 mL di PBS ghiacciata di 0,01 M (NaCl 147 mM; NaH2PO4 1,9 mM; K2HPO4 8,1 mM, pH 7.4) in primo luogo, poi ghiacciata paraformaldeide al 4% (in PBS 0,01 M) con pompa (10 mL/min per 1 min, poi 5 mL/min per 9 min).
Attenzione: Paraformaldeide è cancerogeno e tossico. Gestire solo nella cappa con i guanti.
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Dissezione del midollo spinale e del cervello
- Difficoltà le zampe e la testa di ogni animale in posizione prona su un coperchio di scatola di schiuma con aghi di siringhe, poi striscia e togliere la pelle dalla testa all'osso sacro con le forbici.
- Clip del cranio tra occhi, tagliato lungo l'itinerario centrale del cranio e della linea orizzontale al cervelletto, poi apre il cranio per ogni lato.
- Sollevare l'osso occipital con pinzette e aprire il canale spinale bilateralmente con le forbici oftalmiche. Tagliare le costole su entrambi i lati e togliere delicatamente la metà superiore delle vertebre.
- Sollevare il cervello con le pinzette curve e recidere i nervi della base del cranio, quindi sezionare l'intero cervello e midollo spinale con attenzione. Post-fissare i tessuti in paraformaldeide al 4% per 24 h.
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Preparazione delle fette del tessuto
- Cryoprotect il cervello e midollo spinale cervicale e lombare in soluzione di saccarosio al 30% durante la notte a 4 ° C. Incorpora il tessuto in temperatura di taglio ottimale (OCT) composto e congelare velocemente con azoto liquido.
- Tagliare il tessuto 25 µm utilizzando un criostato e memorizzare le sezioni congelate in PBS 0,01 M a 4 ° C per l'uso.
4. Immunohistochemistry
- Pretrattare digalleggiante sezioni 1% H2O2 per 10 min, poi lavate in PBS per 10 min. Incubare in una soluzione di blocco contenente siero di 5% e 0,3% detergente non ionico in PBS per 1 h.
- Incubare le fette con gli anticorpi primari corrispondenti durante la notte a 4 ° C. Lavare le sezioni in PBST (0,2% Tween 20 in PBS) per 30 min (3 volte per 10 min. ciascuno).
- Incubare le fette con anticorpo di biotina-secondaria corrispondente a temperatura ambiente per 1 h. lavare in PBST per 30 min (3 volte per 10 min. ciascuno).
- Incubare le sezioni con affinità biotina perossidasi complessi per 40 min e macchia con agente achromogenic. Montare i profili sui vetrini e asciugare bene.
- Immergere i vetrini in etanolo anidro per 5 min e xilene per 10 min, quindi sigillare i vetrini con un mezzo di montaggio. Infine, immagine i vetrini con un microscopio equipaggiato con un charge coupled device (CCD) x 100, x 200 e 400 ingrandimenti di x.
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Risultati
Topi hanno mostrato diversi gradi di debolezza transitoria subito dopo l'iniezione di soluzione AAV in 1% lidocaina cloridrato a causa di varie qualità di iniezione intratecale. Secondo il sistema Punteggio semi-quantitativa di 5-grado abbiamo stabilito, abbiamo testato i modelli di trasduzione di AAV in topi con diversi gradi di debolezza agli arti indotta da lidocaina (Punteggio 0, n = 2; Punteggio 1, n = 1; Punteggio 4, n = 4; Punteggio 5, n = 3). EGFP immunostaining dei midolli spinal...
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Discussione
Tecnicamente, ci sono diversi passaggi critici durante l'iniezione di IT in topi svegli. In primo luogo, adeguato controllo gesto e studio dei topi in tutta l'intera operazione è un prerequisito per il recapito corretto. In secondo luogo, il punto più difficile è sentimento lo spazio intervertebrale con la punta dell'ago, come è necessario non inserire troppo profondamente senza resistenza o inserire forzatamente sotto forte resistenza nel caso di ferire gli animali o piegare la punta dell'ago. In terzo luogo, anche se l...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Quest'opera è stata finanziata da una sovvenzione da HEBEI Provinciale Dipartimento delle risorse umane e della previdenza sociale (CY201605) e una sovvenzione dalla Fondazione di Hebei Provincia di scienze naturali (H2017206101), e siamo molto grati al Dr. per Guangping Gao, che hanno fornito l'AAV per Questo studio.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Topi FVB / NJ | Charles River Laboratories Cina | ||
| Lidocaina cloridrato monoidrato | HEOWNS | 73-78-9 | |
| AAV | Viral Vector Core del Centro di terapia genica presso la University of Massachusetts Medical School | ||
| 25 & micro; L Siringa Hamilton/ago da 27-30 G | GASTIGHT | 1702 | |
| O.C.T compond | SAKURA | 4583 | |
| H 2O 2 | SHUI HUAN PAI | ||
| Siero di capra | Solarbio | S9070 | |
| Triton X-100 | LIFE SCIENCES | T8200 | |
| Coniglio anti-GFP | Life tech | G10362 | Diluizione 1:333 |
| Il secondo anticorpo (capra-anti coniglio) | Jackson Immuno Research | 111-005-144 | Diluizione 1:1.000 |
| REAGENTE ABC VECTASTAIN | Vector Lab | PK-6100 | |
| ImmPACT DAB Kit substrato perossidasi | Vector Lab | SK-4105 | |
| Terreno di montaggio per fluorescenza con DAPI | Vectorshield | H-1200 | |
| NaCl | Yong Da Chemical | ||
| NaH2PO4· 2H2O | Yong Da Chemical | ||
| Na2HPO4· 12H2O | Yong Da Paraformaldeide chimica | ||
| Yong Da Vetrini | 307699 | ||
| CITOGLAS | 17083 | 25 mm x 75 mm | |
| SUPER-SLIP MICRO-GLAS | Microscopia Microscopia Siences | 72236-60 | 24 mm x 60 mm |
| 15 mL Provetta da centrifuga | CORNING | 430790 | |
| 96 pozzetti cluster per colture cellulari | Coster | 3599 | |
| cluster per colture cellulari a 24 pozzetti | Coster | 3524 | |
| 70% Etanolo | WEN ZHI | ||
| Garza | Wei AN | 05171112 | 8 cm x 10 cm x 12 cm |
| Siringa da 1 mL | |||
| eppendorf | |||
| Peppet tips | Rainin | ||
| Centirifuge | eppendorf | 5427R | |
| Regerator | Haier | BCD-539WT | |
| Filtro | MILLEX GP | R4PA42342 | |
| Pump | LongerPump | BT-100-2J/YZ1515X | |
| Microscopio | Olympus | BX53 | |
| Microtomo di congelamento | Leica | CM1520 |
Riferimenti
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