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Articolo metodologico

Struttura di cristallo del dominio N-terminale del recettore Ryanodine da Plutella xylostella

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DOI:

10.3791/58568

30 novembre 2018

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

In questo articolo, descriviamo i protocolli della determinazione di espressione, purificazione, cristallizzazione e struttura della proteina del dominio N-terminale del recettore rianodinico da diamondback moth (Plutella xylostella).

Abstract

Sviluppo di insetticidi potenti ed efficienti targeting recettori della rianodina insetto (RyRs) è stato di grande interesse nella zona di controllo dei parassiti agricoli. Ad oggi, diversi insetticidi diammide targeting dei parassiti che RyRs sono stati commercializzati, che generano un fatturato annuo di 2 miliardi di dollari. Ma la comprensione del modo di azione degli insetticidi RyR-targeting è limitata dalla mancanza di informazioni strutturali per quanto riguarda insetto RyR. Questo a sua volta limita la comprensione dello sviluppo della resistenza agli insetticidi in parassiti. Il diamondback moth (DBM) è un parassita devastante distruggendo crocifere raccolti in tutto il mondo, che inoltre è stato segnalato per mostrare resistenza agli insetticidi diammide. Pertanto, è di grande importanza pratica per sviluppare nuovi insetticidi il RyR DBM, targeting soprattutto per una regione diversa dal sito di legame tradizionale diammide di targeting. Qui, presentiamo un protocollo per caratterizzare strutturalmente il dominio N-terminale di RyR da DBM. La struttura di cristallo dei raggi x è stato risolto da sostituzione molecolare ad una risoluzione di 2,84 Å, che mostra un motivo di beta-trefoil pieghevole e un accompagnamento alfa elica. Questo protocollo può essere adattato per l'espressione, purificazione e caratterizzazione strutturale di altri domini o proteine in generale.

Introduzione

Recettori della rianodina (RyRs) sono canali ionici specifici, che mediano la permeazione degli ioni Ca2 + attraverso le membrane del reticolo sarcoplasmatico (SR) nelle cellule muscolari. Di conseguenza, giocano un ruolo importante nel processo di accoppiamento eccitazione contrazione. Nella sua forma funzionale, RyR monta come un homo-tetramero con una massa molecolare di > 2 MDa, con ogni unità secondaria che contengono residui dell'amminoacido ~ 5000. Nei mammiferi, ci sono tre isoforme: RyR1 - tipo di muscolo scheletrico, muscolo cardiaco tipo di RyR2 - e RyR3-ubiquitariamente espressa in diversi tessuti1.

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Protocollo

1. clonazione di Gene, l'espressione della proteina e la purificazione

  1. PCR amplificare il DNA corrispondente alla proteina di interesse (residui 1-205 di DBM RyR, Genbank ACC. n. AFW97408) e clone in animali-28a-HMT vettore di clonazione di legatura-indipendente (LIC)25. Questo vettore contiene un tag di istidina, MBP tag e un sito di clivaggio della proteasi TEV al N-terminale15.
    1. Progettazione LIC primer per l'amplificazione del gene bersaglio con LIC-compatibile 5' le estensioni:
      Forward primer LIC:
      5' TACTTCCAATCCAATGCAATGGCGGAAGCGGAAGGGG 3'
      Reverse primer LIC:
      5' TTATC....

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Risultati

Purificazione

Il dominio N-terminale di RyR DBM è stato espresso come proteina di fusione con un tag di hexahistidine, un tag MBP e un sito di clivaggio della proteasi TEV. Abbiamo seguito una strategia di cinque fasi di purificazione per ottenere una proteina altamente pura, adatta a scopo di cristallizzazione. In un primo momento, la proteina di fusione è stata purificata dalla frazione solubile del lysate delle cellule di colonn.......

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Discussione

In questo articolo, descriviamo la procedura per recombinantly esprimere, purificare, cristallizzare e determinare la struttura di DBM RyR NTD. Per cristallizzazione, un requisito fondamentale è quello di ottenere proteine con omogeneità, purezza e solubilità alta. Nel nostro protocollo, abbiamo scelto di utilizzare animali-28a-HMT vettoriale in quanto contiene un tag hexahistidine e MBP, entrambi i quali potrebbero essere utilizzati per la purificazione ottenere una maggiore purezza di piega. Inoltre, gli aiuti di tag M.......

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Finanziamenti per questa ricerca è stata fornita da: nazionali chiave di ricerca e sviluppo programma della Cina (2017YFD0201400, 2017YFD0201403), National Nature Science Foundation of China (31320103922, 31230061) e programma di progetto di ricerca base nazionale (973) di Cina (2015CB856500, 2015CB856504). Siamo grati al personale la beamline BL17U1 a Shanghai Synchrotron Radiation Facility (SSRF).

....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
pET-28a-HMTQuesto vettore pET modificato contiene un tag esaistidina, una proteina di fusione MBP e un sito di scissione della proteasi TEV all'N-terminale (Lobo e Van Petegem, 2009)
E. coli BL21 (DE3) ceppoNovagen69450-3CN
Colonna HisTrapHP (5 mL)GE Healthcare45-000-325
Colonna in resina di amilosioNew England BiolabsE8021S
Colonna ad alte prestazioni Q Sepharose GE Healthcare17-1154-01
Concentratori Amicon (10 kDa MWCO)MilliporeUFC901008
Colonna di filtrazione su gel Superdex 200 26/600GE Healthcare28-9893-36
Sistema robotizzato automatizzato per la manipolazione dei liquidi Art Robbins InstrumentsGryphon
96 Well CrystalQuickGreiner bio-one82050-494
Uni-PuckDimensioni molecolariMD7-601
Montato CryoLoop - 20 micronHampton ResearchHR4-955
CryoWandDimensioni molecolariMD7-411
Puck strumento di caricamento dewarMolecolare DimensioniMD7-607
Nano dropThermo Scientific NanoDropOne
Incubatore a cristalliDimensioni molecolariMD5-605
Diffrattore a raggi XRigakuFRX
Macchina PCREppendorfNexus GX2
Kit di mini-preparazione del plasmideQiagen27104
Estrazione del gel kitQiagen28704
SspI restrizione endonucleasiNEBR0132S
T4 DNA polimerasiNovagen2868713
KanamicinaScientific Chemical25389940
IPTGGenview367931
HEPESGenview7365459
β-mercaptoetanoloGenview60242
CentrifugaThermo ScientificSorvall LYNX 6000 
SonnicatorScientzII-D
Sistema di purificazione delle proteineGE HealthcareAkta Microscopio a luce pura
NikonSMZ745
IzIt colorante a cristalliHampton ResearchHR4-710
Unità di elettroforesiBio-Rad1658005EDU
Incubatore agitatoreZhichengZWYR-D2401
Schermo di cristallo indiceHampton ResearchHR2-144
Struttura schermo di cristalloDimensioni molecolariMD1-01
Schermo di cristallo ProPlexDimensioni molecolariMD1-38
Schermo di cristallo premier PACTDimensioni molecolariMD1-29
Schermo di cristallo JCSG-plusMolecolare DimensioniMD1-37
Vettore

Riferimenti

  1. Giannini, G., Sorrentino, V. Molecular structure and tissue distribution of ryanodine receptors calcium channels. Medicinal Research Reviews. 15 (4), 313-323 (1995).
  2. Takeshima, H., et al. Isola....

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Ristampe e permessi

Tag

Cristallografia a raggi XPurificazione delle proteineSostituzione molecolareResistenza agli insetticidiTinea dorsalisFiltrazione su gelSDS PAGE