Un metodo basati su Micro-CT per la caratterizzazione di lesioni e posizionamento elettrodi nel cervello degli animali piccoli

Summary

Questo articolo viene descritto un metodo semplice per preparare piccoli cervelli animali per l'imaging di micro-CT, in quale le lesioni possono essere quantificate ed elettrodi che si trova con alta precisione nel contesto dell'intero cervello.

Abstract

Verifica posizione di lesione e l'elettrodo sono tradizionalmente fatto tramite esame istologico di fettine di cervello macchiato, una procedura che richiede tempo che richiede la valutazione manuale. Qui, descriviamo un metodo semplice e diretto per quantificare le lesioni e l'individuazione di elettrodi nel cervello che è meno faticoso e produce risultati più dettagliati. Cervello intero è macchiati con tetrossido di osmio, incorporata in resina e imaged con uno scanner di micro-CT. Le scansioni si tradurrà in volumi 3D digitale dei cervelli con risoluzioni e spessori virtuale dipende la dimensione del campione (12 – 15 e 5 – 6 µm a voxel per ratto e zebra finch cervelli, rispettivamente). Lesioni superficiali e profonde possono essere caratterizzate e singolo tetrodi, matrici tetrodo, lesioni elettrolitiche, e sonde di silicio possono anche essere localizzati. Software libero e proprietario permette sperimentatori esaminare il volume del campione da qualsiasi aereo e segmento il volume manualmente o automaticamente. Perché questo metodo genera volume intero cervello, lesioni e gli elettrodi possono essere quantificati a un grado molto più alto rispetto a metodi attuali, che vi aiuterà a standardizzare i confronti all'interno e attraverso gli studi.

Introduction

I neuroscienziati hanno contato sulle lesioni per lungo tempo al fine di comprendere la relazione tra funzione e posizione nel cervello. Per esempio, la nostra comprensione dell'ippocampo come essendo indispensabile per l'apprendimento e memoria e della corteccia prefrontale come chiave per il controllo degli impulsi era entrambi i prodotti di serendipitous lesioni in esseri umani^1,2. L'utilizzo di modelli animali, tuttavia, ha permesso neuroscienziati sfruttare la potenza delle lesioni andando oltre serendipity, e la funzione delle innumerevoli zone del cervello è stata delucidata attraverso studi sistematici....

Protocol

Tutte le cure e manipolazione sperimentale di animali erano esaminati e approvati dal comitato di uso e Harvard istituzionale Animal Care. La perfusione descritta qui è specifica per i ratti, ma la procedura è applicabile a tutti gli animali con i cervelli più piccoli o di dimensioni simili.

1. aspersione

1. Preparare 1 x tampone fosfato salino (PBS). Per un ratto (età: 0,5 – 1,5 anni, peso: 250 – 600 g), 800 – 1.000 mL dovrebbe essere sufficiente. Utilizzare 400ml per irrorare l'animale e un ulteriore 400 mL per diluire il fissativo.
2. Preparare il fissativo costituito da 2% (p/v) paraformaldeide (PFA) e glutaraldeide al 2,5....

Results

Tradizionalmente, cervelli sono sezionati e macchiati al fine di quantificare le lesioni e individuare gli elettrodi, ma questo metodo è soggetto a errori, alta intensità di lavoro e in genere richiede la stima dei risultati. Di preparazione intero cervello per micro-CT imaging, la probabilità di danneggiare i campioni è notevolmente ridotta, caratteristiche di interesse possono essere analizzate nel contesto dell'intero cervello e il metodo si presta ad elaborazione parallela di molti ca.......

Discussion

I seguenti sono passaggi critici del protocollo: in primo luogo, l'uso di una combinazione di PFA e GA per irrorare l'animale e successivamente post-fissare il cervello è stato fondamentale per il raggiungimento di penetrazione coerente osmio completo del tessuto. Anche se non abbiamo provato questo in modo esplicito, una spiegazione plausibile è che la fissazione di PFA è reversibile¹⁵, considerando che la fissazione di GA non è reversibile^16,1.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldeide (PFA)	Scienze della microscopia elettronica (EMS)	15710	2% (p/v/) in 1X PBS
Glutaraldeide (GA)	EMS	16220	2,5% (p/v) GA in 1x PBS
OsO4	EMS	19190	Lavoro in cappa aspirante
Etanolo	Decon Labs	Koptec	140, 190, 200 proof
Acetone	EMS	10015
Resina Durcupan ACM	Sigma-Aldrich	44610	componenti A, B, C e D, resina per inclusione
Stampi monouso	Ted Pella	27114	consigliata
(acqua ultrapura)	Millipore Sigma	QGARD00R1 (o purificatore correlato)	Parafilm consigliato
(film di paraffina)	Millipore Sigma	P7793	Film di paraffina consigliato
Scanner Micro-CT	Nikon Metrology Ltd., Tring, Regno Unito	X-Tek HMS ST 225	Utilizzato dagli autori
Software per la visualizzazione e l'analisi delle scansioni micro-CT:
	Volume Graphics	VG Studio Max	Utilizzato dagli autori
	FEI / Thermo Scientific	Avizo	Utilizzato dagli autori
	FEI / Thermo Scientific	Amira	Simile a Avizo
	Mark Sutton & Russell Garwood	Spiers	Free, http://spiers-software.org/
	Pixmeo Sarl	Osirix Lite Free	, https://www.osirix-viewer.com/
	Open Source	FIJI	Free, https://fiji.sc/
	Adobe	Photoshop	Ottimo per analizzare una fetta alla volta