Articolo metodologico

Analisi delle dinamiche di Actomyosin su scale cellulari e tissutali locali utilizzando film time-lapse di camere d'uovo di Drosophila coltivate

DOI:

10.3791/58587

⸱

3 giugno 2019

 ,  ,  ,  , 
1Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, 2Center for Systems Biology Dresden

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo fornisce una metodologia fiji-friendly insieme a semplici istruzioni che spiegano come analizzare in modo affidabile il comportamento dell'actomyosina nelle singole cellule e nei tessuti epiteliali curvi. Non sono richieste competenze di programmazione per seguire il tutorial; tutti i passaggi vengono eseguiti in modo semi-interattivo utilizzando l'interfaccia utente grafica delle Fiji e dei plugin associati.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le uova immature della Drosophila sono chiamate camere d'uovo, e la loro struttura assomiglia agli organi primitivi che subiscono cambiamenti morfologici da una forma rotonda a una ellissoide durante lo sviluppo. Questo processo di sviluppo è chiamato oogenesi ed è fondamentale per generare uova mature funzionali per garantire la prossima generazione di mosche. Per questi motivi, le camere d'uovo sono servite come modello ideale e pertinente per comprendere lo sviluppo di organi animali.

Sono stati sviluppati diversi protocolli di coltura in vitro, ma questi protocolli presentano diversi svantaggi. Uno comporta l'applicazione di varie coperture che esercitano una pressione artificiale sulle camere d'uovo foto al fine di immobilizzarle e per aumentare il piano di acquisizione immaginato della superficie circonferenziale delle camere d'uovo analizzate. Tale approccio può influenzare negativamente il comportamento del sottile macchinario di actomiosina che genera il potere di ruotare le camere d'uovo intorno al loro asse più lungo.

Così, per superare questa limitazione, noi cultura Camere d'uovo Drosophila liberamente nei media al fine di analizzare in modo affidabile macchinari di actomyosina lungo la circonferenza delle camere d'uovo. Nella prima parte del protocollo, forniamo un dettaglio manuale su come analizzare il macchinario actomyosina in un piano di acquisizione limitato su scala cellulare locale (fino a 15 celle). Nella seconda parte del protocollo, forniamo agli utenti un nuovo plugin basato sulle Fiji che consente la semplice estrazione di uno strato sottile definito della superficie circonferenzale delle camere d'uovo. Il seguente protocollo descrive quindi come analizzare i segnali di actomiosina su scala tissutale (>50 cellule). Infine, abbiamo individuato i limiti di questi approcci sia per la rete cellulare locale che per i tessuti e discutiamo del suo potenziale sviluppo futuro e delle possibili applicazioni.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il continuo sviluppo di nuove tecnologie di imaging e software con applicazioni nelle scienze della vita ha fornito un enorme impatto sulla comprensione dei principi di base della vita. Una delle sfide principali è la visualizzazione affidabile dei processi di sviluppo in combinazione con la loro imaging dal vivo in vari tessuti. I tessuti sono parti di organi e corpi e, in quanto tali, la maggior parte non sono facilmente accessibili per l'imaging. Pertanto, sono stati sviluppati protocolli che consentono la loro dissezione e la loro coltura in vitro al fine di visualizzare eventi biologici che riflettono sufficientemente la situazione in vivo all'interno di un corpo vivente.

Negli ultimi decenni, la coltura e l'imaging dal vivo delle camere d'uovo della Drosophila, strutture simili acinari e simili a organi primitivi, ha contribuito immensamente alla comprensione dei principi di base dello sviluppo primitivo degli organi1 , 2 Il nome del sistema , 3. Attualmente, ci sono diversi protocolli di coltura disponibili, e il loro utilizzo dipende dal tempo di acquisizione, tipo di cella da imageizzare, e la loro accessibilità (ad esempio, germinainterna e linea somatica esterna)4.

Una caratteristica comune in tutti questi protocolli di coltura è la necessità di immobilizzare le camere d'uovo analizzate che mostrano un'elevata attività contrattile nei supporti liquidi. L'attività contrattile delle camere d'uovo è causata principalmente dal foglio muscolare che copre una lunga serie di camere d'uovo collegate5,6,7. Pertanto, per ottenere una corretta immobilizzazione delle camere d'uovo giovani, sono stati sviluppati vari approcci, che prevedono la copertura delle camere d'uovo con coperchi rivolti6,8,9 o coperte flessibili4, 10 o incorporandoli in agarose a basso punto di fusione3,11. Questi approcci sono popolari in quanto consentono anche l'imaging di un piano visivo più grande a causa del sottile appiattimento della superficie circonferenziale delle camere d'uovo.

Tuttavia, recentemente, è stato dimostrato che le camere delle uova giovani (stadio 1-8) ruotano intorno al loro asse anteriore-posteriore6 e che questo movimento del tessuto è alimentato da una rete di actomiosina fine vicino alla superficie circonferenziale di queste giovani camere d'uovo 12. Pertanto, l'alterazione artificiale della superficie cellulare causata da un sottile appiattimento di questo tessuto può avere un impatto negativo sul comportamento del meccanismo di actomiosina che genera forza. Il contrappunto è che se il tessuto della camera dell'uovo non è appiattito, l'imaging microscopico delle proteine sulla superficie circonferenziale delle camere d'uovo diventa ancora più limitato dalla diminuzione delle dimensioni del piano di acquisizione.

Pertanto, abbiamo combinato protocolli da Prasad et al.9 e il laboratorio di Berg Celeste4,10 e ulteriormente modificato in modo che nessun coverslip / coperta flessibile / agarose viene utilizzato nel metodo sviluppato. Le camere delle uova di Drosophila sono liberamente coltivate nei media e il protocollo qui presentato si applica solo microscopia invertita. Ci sono due parti del protocollo. La prima parte è focalizzata sull'analisi dei segnali di actomiosina su scala cellulare locale (fino a 15 celle) all'interno delle camere d'uovo. Nella seconda parte, ci concentriamo sul superamento dei limiti associati a un piccolo piano di acquisizione causato dalla libera coltura delle camere d'uovo. A questo proposito, abbiamo sviluppato un nuovo metodo computazionale basato sulle Fiji con un'interfaccia utente grafica semi-interattiva che estrae e dispiega selettivamente strati definiti di una superficie del tessuto circonferenzale. Questo è seguito da un protocollo che descrive come analizzare l'actomiosina su scala tissutale (cioè, >50 cellule). Poiché l'estrazione selettiva di un sottile strato definito di tessuti epiteliali curvi non è stata facilmente possibile utilizzando una proiezione classica dello z-stack (Figura 1), questo metodo facile da usare funge da prerequisito importante per comprendere in modo completo il comportamento di una sottile rete di actomyosina (<1 m) su scala tissutale nelle camere d'uovo della Drosophila.

Inoltre, per facilitare il protocollo, forniamo esempi di filmati time-lapse (TLM) e file di esempio del comportamento di Myosin aI convenzionale con tag fluorescenti (vedere File supplementare 3). Myosin II è una proteina motoria e rappresenta la parte contrattile attiva del meccanismo di actomyosin. Per immaginare Myosin II, utilizziamo linee transgeniche della Drosophila che contengono una catena di luce regolatoria modificata di Myosin II chiamata MRLC::GFP (vedi Tabella dei Materiali per i dettagli)12,13. Per visualizzare le membrane cellulari, il protocollo si basa su coloranti commerciali (cfr. Tabella deimateriali). Questo protocollo è adatto non solo per l'analisi dei piccoli segnali mrLC subcellulari::GFP12, ma anche per particelle subcellulari di dimensioni simili intorno a 300 m, come quelle osservate con Life-Act::GFP12,14.

Anche se entrambi questi protocolli sono presentati utilizzando camere d'uovo di Drosophila coltivate in vitro, l'acquisizione di segnali di actomiosina può essere eseguita anche utilizzando altri tessuti sull'ottimizzazione dei supporti di coltura e a seconda della disponibilità di proteine con etichettaflue fluorescenti con coloranti commerciali corrispondenti o, ad esempio, microiniezioni di mRNA per ottenere profili di espressione genica transitoria. Allo stesso modo, il protocollo basato su Fiji per l'estrazione di uno strato sottile da una superficie circonferenziale può essere applicato più in generale ai tessuti ellissoidi e simili ad organi.

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Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Il seguente protocollo fornisce istruzioni su come analizzare l'actomiosina al cellulare locale e la scala del tessuto nelle camere d'uovo della Drosophila. L'approccio su scala locale consente agli utenti di analizzare il comportamento dettagliato della actomiosina in un massimo di 15 celle per camera d'uovo e richiede l'acquisizione di TLM per un breve periodo di tempo (5-10 min) utilizzando immagini ad alta velocità e un microscopio confocale invertito. Al contrario, la scala tissutale fornisce agli utenti informazioni sulla actomiosina in 50-100 cellule e richiede l'acquisizione di TLM per un lungo periodo di tempo (30 min) utilizzando l'imaging a bassa velocità e un microscopio a disco rotante invertito (vedi Figura 2 e parametri consigliati per ogni scala nella tabella 1). La decisione su quale scala analizzare i segnali actomyosin dipende interamente dalla questione scientifica dell'utente. I TLM di prova accompagnati dovrebbero aiutare a prendere questa decisione.

1. Scala cellulare locale (LCS)

NOT: Per sezionare e immagine in vitro coltivate camere d'uovo Drosophila, seguire il protocollo descritto in File supplementare 1. Per analizzare i TLM acquisiti, continuare con il protocollo seguente. I collegamenti ai file di prova di accompagnamento dei TLM sono riportati nel file supplementare 3.

  1. Trattamento dei dati dei TLM su scala cellulare locale (LCS)
    1. Correzione sbiancata dei TLM per compensare il decadimento dell'intensità delle etichette fluorescenti
      1. Assicurarsi che nel computer in uso sia installata un'applicazione Fiji aggiornata seguendo le seguenti istruzioni: Fiji > Apri un TLM (ad esempio, TestMovie1.tif dal file supplementare 3).
      2. Dividere i canali di colore facendo clic su Immagine > Colore > Dividi canali.
      3. Eseguite una correzione della candeggina su entrambi i canali utilizzando Immagine > Regola > Correzione sbiancamento > Rapporto semplice > Intensità sfondo 0.0.
        NOT: Se si ottengono risultati insoddisfacenti, esplorare quali metodi di correzione in questo plugin si adatta meglio (ad esempio, utilizzare Istogramma Matching invece di un rapporto semplice).
    2. Segmentazione delle celle per generare una maschera di cella per i TLM
      1. Se Fiji non è già aperta, riaprirla (e assicurarsi che sia aggiornata) seguendo Aiuto > Aggiornamento > Applica modifiche > OK.
      2. Se questo non è già stato fatto, scaricare la macro TissueCellSegmentMovie.ijm (da http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm). Trascina e rilascia questo script in Fiji.
      3. Aprire il file TLM .tiff corretto per la candeggina (vedere la sezione 1.1.1). Dividere i canali del file corretto mediante la funzione di correzione utilizzando Immagine > Colore > Dividi canali.
      4. Eseguire lo script caricato sul canale di membrana cellulare attivo del TLM selezionato premendo l'icona Esegui nello script aperto. Impostate la sfocatura gaussiana su 2.500 e la sensibilità di rilevamento delle celle su -1 e fate clic su OK. Al fine di ottenere una bella maschera di cella, non modificare questi parametri di cui sopra. Impostare la tolleranza del rumore stimata tra 10-20 per i TLM acquisiti con l'obiettivo 63x e fare clic su OK.
        NOT: Per altri obiettivi, possono essere richiesti parametri diversi. Più pulito è lo sfondo in un TLM, è richiesta una tolleranza del rumore stimata inferiore.
      5. Una maschera di cella generata viene visualizzata nel TLM analizzato e anche in una nuova finestra denominata ParticleStack (G)e, inoltre, viene visualizzata una piccola finestra denominata Action Required. Dalla maschera cellulare sul TLM, concentrarsi solo sulle celle al centro del TLM e selezionare quelli che possono fornire contorni completi e ben definiti in tutto il TLM.
      6. Se le celle selezionate contengono contorni di celle artificiali/extra, utilizzare la finestra dello strumento di unione denominata Azione richiesta nel TLM. Per quest'ultimo, seguire le istruzioni nella finestra.
        NOT: Assicurarsi che i contorni delle cellule siano ben definiti e corrispondano a membrane cellulari reali in un TLM, poiché qualsiasi imprecisione può influire sulle analisi successive. Ulteriori modifiche e modifiche, come la rimozione di celle indesiderate, possono essere apportate in un secondo momento utilizzando lo strumento Gestione superficie (descritto nella sezione 1.1.3).
      7. Quando le celle selezionate al centro corrispondono bene alle membrane cellulari reali, salvate ParticleStack come file .tiff seguendo File > Salva con nome > Tiff.
    3. Caricamento della maschera cella generata in Surface Manager
      1. Installare Surface Manager Plugin15 nella configurazione di Fiji utilizzata. Seguire le istruzioni di Viktorinova et al.16.
      2. Apri Surface Manager utilizzando Plugins > Segmentazione > Gestione superfici (3D).
        NOT: Nella finestra di Gestione superficie vengono visualizzati diversi pulsanti di azione a destra e una finestra vuota a sinistra. Per visualizzare tutti i pulsanti di azione, potrebbe essere necessario allungare la finestra nella sua altezza / larghezza. Si noti che gli intervalli di tempo verranno visualizzati come sezioni z.
      3. Aprite il file .tiff ParticleStack corrispondente in Surface Manager facendo clic su File > Apri e selezionate l'immagine da aprire (ad esempio, ParticlesStack1.tif).
      4. In Surface Manager, fare clic sul pulsante Leggi immagine contorno e impostare l'indice Jacquard su 60%.
        NOT: Il caricamento del file ParticlesStack1.tif può richiedere alcuni minuti, a seconda della potenza di elaborazione del computer.
      5. Una volta caricata, ogni cella verrà assegnata con un numero S e verrà visualizzata nella parte sinistra della finestra di Surface Manager.
        NOT: Per visualizzare i contorni e i nomi delle celle, seleziona le caselle di controllo Mostra tutto e Mostra etichette nella parte inferiore della finestra gestione superficie. Si consiglia di utilizzare questa funzione una volta che i numeri di cella sono stati controllati per la loro correttezza.
      6. Fare clic sul primo numero S; il contorno della cella importata da ParticlesStack1.tif viene visualizzato sul TLM. Controllare ogni numero S importato per la qualità del contorno delle celle in tutto il TLM e rimuovere le celle indesiderate che visualizzano contorni di cella non corretti. A tale scopo, evidenziare il contorno della cella e fare clic sul pulsante Elimina.
        NOT: È anche possibile correggere i contorni delle celle imprecise e aggiungere nuovi contorni di celle. Questo è descritto nella sezione di discussione.
      7. Salvare tutte le celle corrette come file RoiSet.zip premendo il pulsante Salva su disco.
        NOT: Se la sessione deve essere interrotta, è possibile caricare il file RoiSet in Surface Manager in un secondo momento: aprire un TLM in Fiji (File > Apri) e selezionare un TLM. Aprire Gestione superficie tramite Plugin > Segmentazione > Gestione superfici(3D). Caricare il file RoiSet.zip corrispondente facendo clic sul pulsante Carica da disco e scegliendo il file RoiSet.zip appropriato. Verificare che le maschere di cella caricate corrispondano al TLM caricato.
    4. Correzione della deriva tissutale nei TLM
      NOT: Durante il tempo di acquisizione dei TLM, gli effetti di deriva possono essere osservati a causa della rotazione epiteliale o di un movimento indesiderato. In entrambi i casi, si consiglia di correggere per qualsiasi deriva al fine di semplificare l'analisi manuale dell'atomiosina in un secondo momento. La correzione della deriva è necessaria solo per l'analisi manuale dell'actomyosina. Questa esercitazione richiede un software Fiji aggiornato con il plug-in MultiStackReg (https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#multistackreg) installato.
      1. Aprire il TLM corretto candeggina in Fiji tramite File > Apri e selezionare il file corretto candeggina creato utilizzando il tutorial di cui sopra.
      2. Dividere i canali e selezionare quello che identifica le membrane cellulari tramite Immagine > Colore > Canalidivisi .
      3. Utilizzare il seguente protocollo quando i contorni delle celle non sono visibilmente uniformi: Elabora > Filtri > Sfocatura gaussiana. Impostarlo su 1–2 per un obiettivo 63x e fare clic su OK e quindi su Sì. Fare clic su Elabora > Binario > Converti in maschera utilizzando le impostazioni predefinite; quindi, fare clic su OK.
      4. Caricare il plug-in MultiStackReg seguendo i plug-in > Registrazione > MultiStackReg.
      5. Assicurarsi che Stack 1 sia impostato sul canale della membrana della cella, azione 1 sia impostato su Allinea e Trasformazione sia impostato su Traslazione. Selezionare la casella di controllo Salva file di trasformazione e quindi fare clic su OK.
      6. Riaprire il TLM selezionato, il plug-in MultiStackReg e il file di trasformazione salvato utilizzando File > Apri e selezionare un TLM. Dividere i canali di colore utilizzando Immagine > Colore > Dividi canali.
      7. Caricare il plug-in MultiStackReg facendo clic su Plugin > Registrazione > MultiStackReg. Selezionare Carica file di trasformazione come Azione 1.Select Load Transformation File as Action 1.
      8. Lasciare Trasformazione come Corpo rigido e fare clic su OK. Selezionare il file di trasformazione salvato in precedenza e fare di nuovo clic su OK.
      9. Unire i canali immagine e salvare il TLM registrato come file .tiff dopo Immagine > Colore > Unisci canali. Salvare il file facendo clic su File > Salva con nome > Tiff.
        NOT: Ci sono modi alternativi per correggere per una deriva di tessuto in Fiji, vale a dire tramite Plugins > Registrazione > StackReg/ Correggi deriva 3D.
  2. Analisi degli impulsi di actomiosina in Surface Manager presso LCS
    NOT: Questo passo del protocollo consente agli scienziati di identificare se gli impulsi di actomiosina sono presenti nel tessuto analizzato e di comprendere il comportamento dettagliato e la direzionalità dei segnali di actomyosina.
    1. Apri Figi e assicurati che un TLM e la maschera di cella corrispondente siano aperti in Gestione superficie.
      NOT: Assicurati che Fiji sia installato e aggiornato e che sia installato il plug-in di Surface Manager (passaggio 1.1.3.1).
    2. Aprite un TLM con File > Apri e selezionate un TLM da aprire (ad esempio, TestMovie1_bleach.tif). Caricare il plug-in di Gestione superficie tramite plugin > Segmentazione > Gestione superficie(3D). Caricare la maschera di cella salvata creata nell'esercitazione qui (ad esempio, ParticlesStack1.tif) tramite File > Apri e selezionare una maschera di cella (ad esempio, ParticlesStack1.tif). Caricare l'area di interesse corrispondente (ROI, ad esempio TestMovie1_RoiSet.zip). Vedere la figura 3A.
    3. Passare al canale di interesse nel TLM selezionato.
      NOT: Per distinguere i canali, seguire il codice colore indicato intorno al TLM.
    4. In Gestione superficie, fare clic sul pulsante Statistiche per ottenere la finestra denominata Valore grigio medio Slice per porzione (Figura 3B). Si noti che verranno visualizzati i valori di intensità media/mediana dei segnali di actomiosina in un determinato canale analizzato all'interno dei contorni delle celle definite nel tempo, nonché altri parametri relativi all'area della cella e alla forma della cella.
      NOT: I valori di intensità sono in unità di arbitraggio (A.U.); l'area della cella è in pixel e deve essere convertita in micrometri quadrati.
    5. Salvare i valori ottenuti come file di foglio di calcolo. Fare clic sulla finestra Statistiche, File > Salva con nome.
      NOT: È possibile verificare i valori statistici ottenuti in un secondo momento come segue: aprire il TLM corretto per la candeggina nelle Figi e aprire Gestione superfici. Caricare il file RoiSet.zip corrispondente su TLM premendo il pulsante Carica da disco e aprire il file. La maschera salvata con i contorni delle celle verrà caricata e i nomi delle celle verranno visualizzati nella finestra sinistra di Surface Manager. Fare clic sul pulsante Statistiche per i valori statistici.
  3. Analisi manuale dei singoli segnali di actomyosina subcellulare a LCS
    NOT: Questo protocollo richiede la massima concentrazione e richiede molto tempo. In generale, un TLM acquisito può essere analizzato comodamente entro 1 giorno. Questo non include il tempo per la preparazione del volo prima della loro dissezione, la dissezione stessa e l'acquisizione di immagini.
    1. Aprire un TLM selezionato, corretto e registrato (corretto alla deriva) in un'applicazione Fiji aggiornata. Utilizzare un TLM corretto e corretto dalla deriva (ad esempio, TestMovie1_bleach_reg.tif) come esempio di test.
    2. Regolare la luminosità e il contrasto per visualizzare i singoli segnali actomyosin utilizzando Immagine > Regola > Luminosità/Contrasto.
    3. Allineare i TLM nella stessa direzione rispetto all'asse del tessuto/corpo. Nel caso delle camere d'uovo, allineare il lato anteriore delle camere d'uovo sempre a sinistra dell'immagine/sottofilm/TLM prima dell'analisi.
    4. Dividi il filmato selezionato in brevi sottofilm da 30 s e proietta ciascuno di essi. Salvare i sottofilm non proiettati nel tempo e proiettati nel tempo con i nomi corrispondenti. Mantenere la fonte originale.
      NOT: I sottofilm possono essere creati da TLM originali eliminando prima i fotogrammi indesiderati tramite Immagine > Stack > Slice Remover. Definire le sezioni da rimuovere e impostare Incremento. Trasformate in RGB prima di utilizzare la rimozione della sezione quando Incremento è uguale a 1. Per proiettare un sottofilm a 30 s, fate clic su Immagine > Stack > Progetto z > Intensità massima per i fotogrammi (sezioni) definiti, quindi fate clic su OK. Saltare ogni secondo 30 s sottofilm al fine di evitare di contare i segnali di actamiosina 2x in due successivi 30 s submovies.
    5. Posizionare un'immagine proiettata nel tempo accanto al sottofilmacorrispondente di 30 s (Figura 4A,B). Identificare la linea del segnale sul sottofilm proiettato nel tempo. Identificare la direzione del movimento del segnale di actomiosina (da 0 a 360 gradi) lungo questa linea nel sottofilmato originale riproducendo manualmente il sottofilmato. Utilizzare lo strumento Angolo (nella barra delle Figi) per misurare manualmente la direzione del movimento del segnale rispetto all'asse dei tessuti definito o a uno strumento disponibile simile.
      NOT: Fiji funziona solo su una scala da 0 a 180 gradi (Figura4C) ed è necessario un ricalcolo dei valori ottenuti su una scala da 0 a 360 gradi. Una linea di segnale corrisponde alla traiettoria di un movimento del segnale actomyosin nel tempo.
    6. Per evitare la duplicazione nell'analisi dei segnali di actomyosina, contrassegnare le linee di segnale analizzate all'interno delle celle nel sottofilm proiettato nel tempo (Figura 4B,D).
    7. Analizza tutte le celle selezionate nel sottofilmato 30 s e salva gli angoli ottenuti.
      NOT: Analizzare solo i segnali di actomiosina citoplasmatica subcellulare nelle cellule con contorni cellulari ben definiti in tutto un TLM. Escludere singole celle con meno di 15-20 segnali rilevati nell'intero TLM. Ignorare i segnali di actomyosin che si spostano tra le cellule a causa della loro origine sconosciuta. Un esempio di conteggi dei segnali per una cella analizzata nel sottofilm a 30 s è illustrato nella Figura 4D.
    8. Continuare fino a quando vengono analizzati tutti i 30 sottofilm lunghi s di un TLM e salvare tutti gli angoli misurati dei segnali di actomyosin di un TLM in un file di foglio di calcolo.
    9. Sommare tutti gli angoli misurati sul numero rilevante di TLM (a seconda dell'esperimento). Tracciare la percentuale della direzione dei segnali di actomiosina analizzati, ad esempio, come un diagramma di rosa con un intervallo compreso tra 0 e 360 gradi con un software preferito.
      NOT: Per ottenere risultati statisticamente significativi, si raccomanda di analizzare da cinque a dieci camere d'uovo indipendenti di qualsiasi stadio della camera d'uovo.

2. Scala dei tessuti

NOT: Per sezionare e immagine in vitro coltivate camere d'uovo Drosophila, seguire il protocollo in Supplementary File 2. Per analizzare i TLM acquisiti, continuare con il seguente protocollo riportato di seguito. I file di prova accompagnati di TLM sono inseriti nel File supplementare 3.

  1. Estrazione selettiva della superficie dei tessuti epiteliali curvi
    nota:Questo protocollo consente agli utenti di estrarre selettivamente un sottile strato di actomyosina in un tessuto epiteliale curvo nel tempo. Questa fase del protocollo è facile da usare e basata su un'interfaccia grafica intuitiva. È possibile analizzare comodamente (estrarre superficie) diversi TLMs. Utilizzare TestMovie2.czi (dalFile supplementare 3) come esempio TLM di prova.
    1. Aprire un'applicazione Fiji aggiornata (Figi > Guida > Aggiorna > Applica modifiche > OK).
    2. Assicurarsi che il plug-in di proiezione di superficie ellissoide15 sia installato. Seguire Viktorinova et al. 16.
    3. Aprire un TLM ed esportarlo come file XML/HDF5 facendo clic su Plugin > BigDataViewer > Esporta immagine corrente come file XML/HDF5.
      NOT: È necessario definire un percorso di esportazione. Il risparmio stesso può richiedere diversi minuti e dipende dalla lunghezza TLM.
    4. Aprire il file esportato in Proiezione superficie ellissoide facendo clic su Plug-in > BigDataViewer > Proiezione superficie ellissoide > Seleziona file XML.
      NOT: Apparirà una nuova finestra con viste sagittali della camera delle uova e una finestra di dialogo per guidare l'utente attraverso la lavorazione. I dettagli su come spostarsi nella vista sezioni sono disponibili in https://imagej.net/BigDataViewer.
    5. La finestra di dialogo denominata Proiezione ovaia ha diverse schede. Nella prima scheda della finestra di dialogo chiamata Riquadro di delimitazione, definire i bordi x e y di una camera d'uovo nel TLM insieme alla larghezza z del riquadro di delimitazione (ad esempio, la profondità di una camera z-stack/uovo) e premere set (Figura 5A).
    6. Per definire i bordi, trascinare i pulsanti accanto a x, y e z o definire le coordinate del numero nelle caselle x, y e z. Assicurarsi che i bordi siano abbastanza generosi da far entrare la parte della camera d'uovo di interesse nell'estrazione della superficie. Le parti selezionate della camera delle uova sono evidenziate in rosa.
    7. Passare alla scheda denominata Trova BLOB nella finestra Ovais Projection. Definire il sigma e il valore di picco minimo; quindi, premere compute per identificare i segnali di actomyosin (Figura 5B), che verranno visualizzati come blob verdi. Riprovare questo passaggio con parametri diversi fino a quando non vengono trovati punti sufficienti (circa 100).
      NOT: Sigma 1-u20123 con un valore di picco minimo 20-u2012100 funziona al meglio per identificare i segnali di actomiosina delle camere da-6 a -8 gradini d'uovo. Identificare i segnali di actomiosina è un passo cruciale e dipende dalla qualità del segnale e dalle sue dimensioni. È importante verificare le dimensioni corrette dei BLOB esistenti. Nessuna macchia/blob verde visibile nell'immagine indica che il passaggio successivo non funzionerà. Sfogliare i piani z selezionati per visualizzare i BLOB.
    8. Per progettare l'ellissoide, continuare con la scheda denominata Adatta ellipsoide. Impostare Campioni casuali su 10.000, Distanza di taglio esterno/interno su 1,u201210, quindi fare clic su Calcola (Figura 5C).
      NOT: Più bassa è la distanza di taglio, più precisa sarà l'ellissoide desiderata. Dopo questo, la scheda chiamata Proiezione si aprirà automaticamente e permetterà la definizione dell'estrazione della superficie. Le impostazioni devono essere ottimizzate.
    9. Continuare con la scheda denominata Proiezione (Figura 5D). Impostare una distanza di proiezione minima e massima (cioè la larghezza dell'ellissoide desiderato). È necessario impostare una distanza di proiezione minima e massima in modo che la regione ellipsoide definita in rosa includa l'intero strato esterno della camera d'uovo. Definire la distanza della sezione (1 è consigliato).
      NOT: Esempi di adattamento dell'ellissoide non corretto e ottimale, con conseguente parametri di proiezione non corretti e ottimali sono illustrati nella figura 6A,C. Il sottile strato circonferenziale dell'interesse può essere definito in un secondo momento. Assicurarsi che la regione rosa dell'ellissoide con la larghezza definita sulla camera dell'uovo sia visibile prima di premere il calcolo. È importante che l'ellissoide desiderata (linea singola rosa) si adatti perfettamente alla superficie ellissoide di una camera d'uovo per ottenere i migliori risultati. Se l'adattamento dell'ellissoide non è buono, disporre impostazioni diverse fino a ottenere l'estrazione della superficie desiderata.
      1. Impostare la larghezza dell'output (800 USD) e l'altezza dell'ellissoide. Impostare da quale punto temporale deve essere creata l'estrazione della superficie (ad esempio, definire la lunghezza dell'estrazione TLM). Scegliere una proiezione sferica o cilindrica. Capovolgere e allineare Y se necessario.
      2. Premere calcolo per ottenere un'estrazione della superficie per entrambi i canali nelle nuove finestre denominate Immagine. Regolare la luminosità e il contrasto delle finestre dell'immagine ottenute per visualizzare i segnali di actomyosin proiettati, facendo clic su Immagine > Regola > Luminosità/Contrasto.
        NOT: Un esempio di confronto di una proiezione risultante da una vestibilità ellissoide non corretta e ottimale è illustrato nella Figura 6B,D.
    10. Se l'estrazione della superficie ha un aspetto ottimale, salvare le immagini (entrambi i canali separatamente) come .tiff. Inoltre, salvare il file della finestra di registro per riferimento futuro su come è stata estratta la superficie di questa particolare camera d'uovo.
      NOT: Si tratta di informazioni particolarmente importanti se lo strato sottile estratto deve essere restituito alla sua forma originale spiegata (solo per gli sviluppatori).
    11. Unisci i canali con un codice colore preferito in Fiji.
      NOT: Se necessario, proiettare i livelli z-stack selezionati con segnali actomyosin. La proiezione dei livelli z-stack selezionati è necessaria quando lo stato attivo di acquisizione cambia leggermente nel tempo in un TLM. Per ottenere risultati ottimali, proiettate al massimo da uno a due strati z-stack.
    12. Salvare i risultati come file con estensione tiff.
      NOT: Esempi rappresentativi di strati sottili (superficie basale selettiva e apicale) che rappresentano il segnale Myosin II (MRLC::GFP) dall'epitelio follicolo del controllo e delle camere d'uovo mutanti fat2 sono disponibili nella Figura 8.
  2. Trattamento dei dati di una superficie tissutale estratta in modo selettivo
    1. Correggere le TLM per compensare il decadimento dell'intensità delle etichette fluorescenti.
      1. Apri Fiji. Aprire un TLM (ad esempio, TestMovie2_extraction.tif dal file supplementare 3) utilizzando File > Apri. Selezionare l'immagine per aprirla.
      2. Dividere i canali di colore e convertirli in immagini a 16 bit, se necessario, facendo clic su Immagine > Colore > Dividi canali. Convertire i canali in immagini a 16 bit (da immagini a 32 bit) utilizzando Immagine > Testo > 16 bit.
      3. Eseguite una correzione della candeggina su entrambi i canali utilizzando Immagine > Regola > Correzione sbiancamento > Rapporto semplice > Intensità sfondo 0.0.
        NOT: Se si ottengono risultati insoddisfacenti, è necessario esplorare quali metodi di correzione in questo plugin si adattano meglio (ad esempio, utilizzare Istogramma Matching invece di un rapporto semplice).
      4. Unire i canali delle due immagini corrette dalla gradivia facendo clic su Immagine > Colore > Unisci canali. Salvare l'immagine unita come file .tiff facendo clic su File > Salva con nome > Tiff.
        NOT: Regolare il contrasto e la luminosità per i canali, se necessario.
    2. Segmentazione delle celle per generare una maschera di cella per i TLM
      1. Se Fiji non è già aperto, riaprirlo (e assicurarsi che sia aggiornato facendo clic su Guida > Aggiorna > Applica modifiche > OK).
      2. Se questa operazione non è già stata eseguita, scaricare la macro TissueCellSegmentMovie.ijm (http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm).
      3. Trascina e rilascia questo script in Fiji. Aprire il file corretto per la candeggina (ad esempio, TestMovie2_bleach.tif dal File supplementare 3, vedere anche 2.2.1).
      4. Dividere i canali del file corretto da gradicazione facendo clic su Immagine > Colore > Dividi canali. Regolare il canale della membrana per garantire contorni chiari delle celle facendo clic su Immagine > Regola > Luminosità/Contrasto.
      5. Eseguire lo script caricato sul canale di membrana cellulare attivo del TLM selezionato premendo l'icona Esegui nello script aperto. Impostare Sfocatura gaussiana su 1.500. Impostare la sensibilità di rilevamento delle celle su -1 e fare clic su OK. Impostare Tolleranza rumore stimata su 8 per i TLM acquisiti con l'obiettivo 40x e fare clic su OK.
        NOT: Al fine di ottenere una bella maschera di cella, non modificare questi parametri di cui sopra. Per altri obiettivi, possono essere richiesti parametri diversi. Più pulito è lo sfondo in un TLM, è richiesta una tolleranza del rumore stimata inferiore.
      6. Una maschera di cella generata viene visualizzata nel TLM analizzato e anche in una nuova finestra denominata ParticleStack (G). Inoltre, viene visualizzata una piccola finestra denominata Azione richiesta. Dalla maschera cellulare sul TLM, concentrarsi solo sulle celle al centro del TLM e selezionare quelli che possono fornire contorni completi e ben definiti in tutto il TLM.
      7. Se le celle selezionate contengono contorni di celle artificiali/extra, utilizzare la finestra dello strumento di unione denominata Azione richiesta in TLM. Per quest'ultimo, seguire le istruzioni nella finestra.
        NOT: Assicurarsi che i contorni delle cellule siano ben definiti e corrispondano a membrane cellulari reali in un TLM, poiché qualsiasi imprecisione può influire sulle analisi successive. Ulteriori modifiche e modifiche, come la rimozione di celle indesiderate, possono essere eseguite in un secondo momento utilizzando lo strumento Surface Manager (delineato nell'esercitazione seguente).
      8. Quando le celle selezionate al centro corrispondono bene alle membrane cellulari reali, salvate ParticellStack come file .tiff seguendo File > Salva con nome > Tiff. Procedere per eseguire il caricamento della maschera cellulare generata e l'analisi della actomiosina in Surface Manager come precedentemente eseguita nelle sezioni 1.1.3 e 1.2 (descritte in dettaglio nelle sezioni 2.2.3 e 2.3).
    3. Caricamento della maschera cella generata in Surface Manager
      1. Se il plug-in di Surface Manager è già installato nella configurazione di Fiji utilizzata, procedere al passaggio 2. In caso contrario, seguire Viktorinova et al.16. Per gli sviluppatori, solo il codice sorgente è disponibile anche15.
      2. Aprire Surface Manager facendo clic su Plugin > Segmentazione > Gestione superfici (3D).
        NOT: Nella finestra di Gestione superficie vengono visualizzati diversi pulsanti di azione a destra e una finestra vuota a sinistra. Per visualizzare tutti i pulsanti di azione, potrebbe essere necessario allungare la finestra nella sua altezza / larghezza. Si noti che gli intervalli di tempo verranno visualizzati come sezioni z.
      3. Aprite il file ParticleStack.tif corrispondente in Surface Manager tramite File > Apri e selezionate l'immagine da aprire (ad esempio, ParticleStack2.tif dal file supplementare3).
      4. In Surface Manager, fare clic sul pulsante Leggi immagine contorno e impostare l'indice Jacquard su 60%.
        NOT: Il caricamento di un file ParticleStack.tif può richiedere alcuni minuti, a seconda dell'alimentazione del computer.
      5. Una volta caricata, ogni cella verrà assegnata con un numero S e verrà visualizzata nella parte sinistra della finestra di Surface Manager (Figura7A).
        NOT: Per visualizzare i contorni e i nomi delle celle, seleziona le caselle di controllo Mostra tutto e Mostra etichette nella parte inferiore della finestra gestione superficie. Si consiglia di utilizzare questa funzione una volta che i numeri di cella sono stati controllati per la loro correttezza.
      6. Fare clic sul primo numero S; il contorno della cella importata da ParticleStack.tif viene visualizzato sul TLM. Controllare ogni numero S importato per la qualità del contorno delle celle in tutto il TLM e rimuovere le celle indesiderate che visualizzano contorni di cella non corretti. A tale scopo, evidenziare il contorno della cella e fare clic sul pulsante Elimina.
        NOT: È anche possibile correggere i contorni delle celle imprecise e aggiungere nuovi contorni di celle. Questo è descritto nella sezione di discussione.
      7. Salvare tutte le celle corrette come file RoiSet.zip premendo il pulsante Salva su disco.
        NOT: Se la sessione deve essere interrotta, è possibile caricare il file RoiSet.zip in Surface Manager in un secondo momento: aprire un TLM in Fiji tramite File > Apri e selezionare un TLM. Apri Gestione superfici come segue: Plugin > Segmentazione > Gestione superfici(3D). Caricare il file RoiSet.zip corrispondente facendo clic sul pulsante Carica da disco e scegliendo il file RoiSet.zip appropriato (ad esempio, TestMovie2_RoiSet.zip). Verificare che le maschere di cella caricate corrispondano al TLM caricato.
  3. Analisi degli impulsi di actomiosina in Surface Manager
    NOT: Apri Figi e assicurati che un TLM e la maschera di cella corrispondente siano aperti in Gestione superficie. Assicurati che Fiji sia installato e aggiornato e che sia installato il plug-in di Surface Manager (https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager).
    1. Aprite un TLM con File > Apri e selezionate un TLM da aprire (ad esempio, TestMovie2_bleach.tif). Caricare il plug-in di Surface Manager tramite Plugin > Segmentazione > Gestione superfici(3D). Caricare la maschera di cella salvata creata nell'esercitazione qui (ad esempio, ParticlesStack2.tif) tramite File > Apri e selezionare una maschera di cella (ad esempio, ParticlesStack2.tif). Caricare il ROI corrispondente (ad esempio, TestMovie2_RoiSet.zip).
    2. Passare al canale di interesse nel TLM selezionato.
      NOT: Per distinguere tra i canali, seguire il codice colore indicato intorno al TLM.
    3. In Gestione superficie, fare clic sul pulsante Statistiche per ottenere la finestra denominata Valore grigio medio Slice per slice ( Figura7B). Si noti che verranno visualizzati i valori di intensità media/mediana dei segnali di actomiosina in un determinato canale analizzato all'interno dei contorni delle celle definite nel tempo, nonché altri parametri relativi all'area della cella e alla forma della cella.
      NOT: I valori di intensità sono in A.U.; l'area della cella è in pixel e deve essere convertita in micrometri quadrati.
    4. Salvare i valori ottenuti come file di foglio di calcolo: fare clic sulla finestra Statistiche, File > Salva con nome.
      NOT: È possibile verificare i valori statistici ottenuti in un secondo momento, come indicato di seguito. Aprire il TLM corretto per la candeggina in Fiji. Aprire Gestione superficie. Caricare il file RoiSet.zip corrispondente su TLM premendo il pulsante Carica da disco e aprire il file. La maschera salvata con i contorni delle celle verrà caricata e i nomi delle celle verranno visualizzati nella finestra sinistra di Surface Manager. Fare clic sul pulsante Statistiche per i valori statistici.
      NOT: Per quanto riguarda un'analisi manuale dei singoli segnali di actomyosina subcellulare, non è possibile eseguire un'analisi manuale dei segnali di actomyosina subcellulare su scala tissutale. L'ottimizzazione è necessaria per l'analisi dei singoli segnali di actomiosina su scala semi-tessuto, come evidenziato nella sezione di discussione.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo consente agli scienziati di studiare il comportamento delle reti di actomyosina nei tessuti epiteliali. Ciò è possibile solo quando un'analisi dettagliata del comportamento dell'actomiosina su scala cellulare locale (alcune cellule) è combinata con un'analisi simile su scala tissutale (molte cellule). Tuttavia, i tessuti epiteliali sono spesso curvi e l'estrazione di uno strato sottile di questi tessuti in precedenza non era facilmente possibile, come mostrato nelle came...

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Discussione

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Passaggi critici e risoluzione dei problemi per la dissezione e la coltura delle camere d'uovo

Se troppe mosche vengono poste in una piccola fiala, il cibo a mosca può diventare fangoso dopo 2-3 giorni a causa di ampie quantità di larve di alimentazione e mosche adulte intrappolate nel cibo a mosca. In tal caso, capovolgere il resto di queste mosche in una nuova fiala con cibo fresco e ridimensionare il loro numero. In particolare, escludere le femmine che erano bloccate nel c...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori sono molto grati a Miriam Osterfield per aver condiviso i suoi consigli sull'imaging in vitro delle camere d'uovo utilizzando un approccio adottato dal laboratorio Celeste Berg4 . Ringraziamo anche Sebastian Tosi per lo script Fiji che consente la segmentazione cellulare.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Schneider MediumGibco21720-024[+]-Glutammina
Penicillina/StreptomicinaGibco15140-122 [ +] 10.000 Unità/mL Penicillina [+] 10.000 µ g/mL Streptomicina
Fetale Siero Bovino Sigma  F135inattivata a caldo
Sigma umano I9278
Provette Falcon da 50 mLFiltrosterile
MilliporeSLGV033NSPiastre
per micropozzetti con fondo in vetroMatTek CorporationP35G-1.5-14-CPiastra Petri da 35 mm, Microwell da 14 mm, vetro di copertura n. 1.5
PinzeA. Dumont & Fils #55
CellMask Deep Red (colorante per membrana cellulare)InvitrogenC10046
FM4-64 (colorante per membrana cellulare)ThermoFisher/InvitrogenT13320
Vetrino per dissezione a depressioneFisher Scientific12-560B
Microscopic equipment
Steromicroscopead es. ZeissStemi SV 6
Microscopio confocale invertito, ad es. Zeiss/Olympus
Microscopio a disco rotantead es. Zeiss/Andor
Microscopic glass/cover glass, ad es. Thermo Scientific/Menzel Glas
Cactus tool
Wironit needle holderHammacher9160020
Cactus spineEchinocactus grusonii/barrel cactus
Drosophila ceppi utilizzati nel manoscritto
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFPPer i dettagli si veda Rauzi et al.: I flussi contrattili planari polarizzati di actomiosina controllano il rimodellamento della giunzione epiteliale. Natura 2010, vol. 468, pp. 1110-1115.
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat2103CPer i dettagli vedi Viktorinova et al.: La rotazione epiteliale è preceduta dalla rottura della simmetria planare dell'actomiosina e protegge il tessuto epiteliale dalle deformazioni cellulari. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Numero 11, pag. e1007107.
Soluzione di insulina Millex-GV Eppendorf da 33 mm ,

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  12. Viktorinova, I., Henry, I., Tomancak, P. Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLOS Genetics. 13, e1007107(2017).
  13. Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling. Nature. 468, 1110-1114 (2010).
  14. Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 393, 209-226 (2014).
  15. Haase, R. Surface manager. , Available from: https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager (2018).
  16. Viktorinova, I., Haase, R., Pietzsch, T., Henry, I., Tomancak, P. Actomyosin dynamics: Required Software and dependencies. , Available from: https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins (2018).
  17. Pietzsch, T. BigDataViewer. , Available from: https://imagej.net/BigDataViewer (2017).
  18. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
  19. Turner, C. M., Adler, P. N. Distinct roles for the actin and microtubule cytoskeletons in the morphogenesis of epidermal hairs during wing development in Drosophila. Mechanisms of Development. 70, 181-192 (1998).
  20. Heemskerk, I., Streichan, S. J. Tissue cartography: compressing bio-image data by dimensional reduction. Nature Methods. 12, 1139-1142 (2015).
  21. Chen, D. Y., Lipari, K. R., Dehghan, Y., Streichan, S. J., Bilder, D. Symmetry Breaking in an Edgeless Epithelium by Fat2-Regulated Microtubule Polarity. Cell Reports. 15, 1125-1133 (2016).
  22. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).

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