Articolo metodologico

Come quantificare la frazione di proteine fluorescenti di fotoattivazione alla rinfusa e in cellule vive

6.2K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/58588

⸱

7 gennaio 2019

 , 
1Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo che coinvolge fuse spettralmente distinti geneticamente accoppiati e proteine fluorescenti. Queste chimere di proteina fluorescente permettono quantificazione della frazione PA-FP è fotoattivazione di essere fluorescente, cioè, l'efficienza di fotoattivazione. Il protocollo rivela che i diversi modi di fotoattivazione rendimento fotoattivazione diverse efficienze.

Abstract

Fuse e - proteine fluorescenti convertibile (PA-FPs) sono state utilizzate in microscopia a fluorescenza cellule vive per analizzare la dinamica di cellule e proteine Ensemble. Finora, nessun metodo è stato disponibile per quantificare in massa e in vivo le cellule espresso quanti del PA-FPs sono fotoattivazione di fluorescenza.

Qui, presentiamo un protocollo che coinvolge righelli interni, vale a dire, geneticamente accoppiato spettralmente distinta (fuse) proteine fluorescenti, a ratiometrically quantificare la frazione di tutte le PA-FPs espresse in una cellula che sono accesi per essere fluorescente. Usando questo protocollo, mostriamo che diverse modalità di fotoattivazione dato fotoattivazione diverse efficienze. Fotoattivazione breve ad alta potenza con un laser confocale a scansione microscopio (CLSM) ha provocato fino a quattro volte inferiore fotoattivazione efficienza di centinaia di esposizioni a basso livello applicate da CLSM o un breve impulso applicato da widefield illuminazione. Mentre il protocollo è stato esemplificato qui per GFP (PA-) e (PA-) Cherry, può in linea di principio essere applicato a qualsiasi coppia di proteina fluorescente fuse o fotoconvertibile spettralmente distinta e qualsiasi set-up sperimentale.

Introduzione

Nel 2002, il primo ampiamente applicabili fuse (PA-GFP1) e fotoconvertibile (Kaede2) proteine fluorescenti sono stati descritti. Queste proteine fluorescenti ottico evidenziatore modificarne le proprietà spettrali all'irradiazione con luce UV, cioè, essi diventano luminose (proteine fluorescenti fuse, cioè, PA-FPs), o cambiare il loro colore (fotoconvertibile FPs). Fino ad oggi, diversi reversibile e irreversibile fuse e fotoconvertibile proteine fluorescenti sono stati sviluppati3,4. Negli studi ensemble o alla rinfusa, evidenziatori ottici sono stati usati per studiare la dinamica di celle intere o proteine e la connettività dei compartimenti subcellulari. Inoltre, evidenziatori ottico abilitati singola molecola basata superresolution tecniche quali PALM5 e FPALM6di imaging.

Anche se i processichimici foto durante la fotoattivazione o - conversione sono state descritte per molti ottici evidenziatori e strutture cristallografiche anche prima e dopo la fotoattivazione / - conversione sono state apportate disponibili7 , 8, il sottostante meccanismofisico foto di fotoattivazione e - conversione completamente non è capito. Inoltre, finora solo grezza esiste stima dell'efficienza di fotoattivazione e - conversione, vale a dire, la frazione di proteine fluorescenti espresso che è in realtà la photoconverted o la fotoattivazione di essere fluorescente. In vitro studi ensemble sono stati segnalati quantificare lo spostamento in spettri di assorbimento e la quantità di nativo e ha attivato la proteina in un gel9,10,11.

Qui, presentiamo un protocollo che coinvolge le chimere di proteina fluorescente per valutare la frazione di proteine fluorescenti di fotoattivazione alla rinfusa e in cellule vive. Ogni volta che lavora con proteine fluorescenti geneticamente codificate, la quantità assoluta di proteina espressa varia da cellula a cellula ed è sconosciuta. Se una cellula che esprime un PA-FP Mostra un segnale luminoso dopo fotoattivazione rispetto a un'altra cella, non può essere differenziato se questo segnale luminoso è dovuto più alta espressione di PA-FP o un più efficiente fotoattivazione di PA-FP. Per standardizzare il livello di espressione in cellule, introduciamo interni governanti di proteine fluorescenti spettralmente distinte geneticamente accoppiate. Accoppiando l'informazione genetica di una proteina fluorescente fuse per un spettralmente distinta sempre su proteine fluorescenti, governanti interne vengono creati che sarà ancora espresso per un importo totale sconosciuto ma in una quantità fissa e nota relativa di 1: 1 questa strategia permette la caratterizzazione quantitativa di diversi schemi di fotoattivazione UV-luce, cioè, la valutazione della quantità relativa di PA-FPs che può essere la fotoattivazione con diverse modalità di fotoattivazione e quindi permette per definire schemi di fotoattivazione che sono più efficaci di altre. Inoltre, questa strategia permette in linea di principio, la valutazione della quantificazione assoluta della frazione fotoattivazione PA-FP. A tal fine, è importante rendersi conto che gli studi presentati ensemble sono basati su intensità che rende l'analisi più complessa, come stabilito nel presente protocollo. Parametri che determinano l'intensità di fluorescenza misurata, cioè, diverse luminosità molecolare, assorbanza e spettri di emissione e FRET effetti, devono essere considerati quando si confrontano le intensità di fluorescenza di diverse proteine fluorescenti.

La quantificazione di basati su intensità di raziometrici presentato di fotoattivazione efficienza è esemplificata per PA-GFP e PA-ciliegia in cellule vive, ma in linea di principio ampiamente applicabile e può essere utilizzata per qualsiasi proteina fluorescente fuse sotto qualsiasi condizione sperimentale.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

1. plasmide costruzione

  1. Generare due colori fusione sonde. Utilizzare un vettore di espressione di cellule di mammifero (Vedi Tabella materiali) nel quale mCherry112 e PA-mCherry113 sono stati inseriti con la restrizione siti AgeI e BsrGI.
  2. Ordine personalizzato oligo-nucleotidi per amplificare le varianti monomeriche di eGFP e PA-eGFP contenente la mutazione A206K, vale a dire, mEGFP e PA-mEGFP14 senza un codone di arresto come un frammento di SalI-BamHI . Utilizzare il primer N-terminale 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' e il C-terminale primer 5'-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC 3' e inserire questo frammento di SalI-BamHI nel polylinker del vettore di espressione. Questo creerà il linker cinque aminoacido RNPPV tra la proteina fluorescente verde e rosso. Ci riferiremo a chimare il fluoroforo come GFP — Cherry, PA-GFP — Cherry e GFP — PA-Cherry per il resto di questo articolo.
    Nota: L'accoppiamento di fluorofori e creazione dei governanti interne per valutare l'efficienza di fotoattivazione può essere fatto con qualsiasi coppia di fluoroforo spettralmente distinti, ad esempio superfolder PA-GFP 15/ PA-TagRFP 16, ecc. Molte delle proteine fluorescenti fuse sono derivati da GFP. Quindi, la sequenza più superelegante fornita sopra utilizzabile per molte proteine fluorescenti per costruire una chimera fluoroforo in un vettore di espressione di cellule di mammifero.

2. cultura e transfezione delle cellule

  1. Utilizzare qualsiasi qualsiasi linea standard cellulare come HeLa, NRK, Cos-7 o una linea cellulare specifico per essere utilizzato per esperimenti di fotoattivazione specifici. Utilizzare DMEM (supplementato con 10% siero bovino fetale e la glutamina 2mm) e tripsina senza rosso fenolo (Vedi Tabella materiali) per ridurre la fluorescenza di fondo.
  2. Staccare le cellule di una cultura confluente con tripsina, contare il numero di cellule in sospensione cellulare utilizzando una camera di Neubauer e seme 5.000 – 10.000 cellule per pozzetto. In alternativa, usare 1 goccia da una pipetta di 2 mL di sospensione cellulare 10 mL da una coltura di cellule confluenti cresciuta in un matraccio di cultura 25-cellula di T o 3 gocce da una sospensione di cellule di 5 mL da una coltura confluente coltivata in un matraccio di cultura 12,5-cellula di T.
  3. Crescere le cellule in alloggiamenti di 8 pozzetti con coperchio #1.0 (Vedi Tabella materiali) di vetro per la microscopia di fluorescenza cellule vive.
  4. Transfect cellule 24 h dopo il placcaggio utilizzando reagenti commerciali (Vedi Tabella materiali) secondo il protocollo del distributore con la GFP — Cherry, PA-GFP — Cherry e GFP — chimere PA-Cherry.
  5. Celle di immagine dopo un totale di 20 h post transfezione per consentire l'espressione della proteina, la piegatura e la maturazione.

3. imaging e fotoattivazione

  1. Celle di immagine in una camera climatica umidificata e riscaldata a 37 gradi centigradi. Il media delle cellule del buffer a pH fisiologico ed eseguirne il rendering CO2-indipendente, aggiungere 20 mM HEPES, o utilizzare impostato su 5% flusso di gas di CO2 .
  2. Immagine in primo luogo, le cellule che esprimono la GFP — costrutto di ciliegia. Impostare i parametri che definiscono l'intensità del laser integrato a tempo al pixel in un'immagine confocale, vale a dire, tempo di permanenza del pixel in microsecondi, filtro tunable acusto-ottico (AOTF) trasmissione in per cento e lo zoom digitale.
    Nota: Utilizzando un obiettivo 60 x e uno zoom digitale di 3 x permette di formazione immagine di una cellula nella sua interezza, fornendo sufficiente ingrandimento. Impostare tempo di permanenza di pixel per 2-4 μs e trasmissione AOTF per il laser di 488 nm e 561 nm tale che le immagini mostrano un buon rapporto segnale-rumore senza alcun candeggio e nessun pixel che indica la saturazione di intensità di fluorescenza.
  3. L'immagine, utilizza la potenza laser set, trasmissione AOTF, tempo di permanenza di pixel e zoom digitale, 15-20 cellule che esprimono GFP — Cherry.
  4. Quindi, l'immagine con la stessa potenza del laser set, tempo di permanenza di pixel, trasmissione AOTF e zoom digitale cellule che esprimono GFP — PA-Cherry e PA-GFP — Cherry. Ricerca per esprimere cellule nel canale verde o canale rosso, rispettivamente. Evitare l'esposizione lunga delle cellule durante la ricerca di cellule che esprimono al fine di non candeggiare le proteine fluorescenti.
  5. Impostare una serie di mini-tempo con un'immagine di pre-attivazione e tre immagini di post-attivazione. Le immagini di post-attivazione aiuterà a identificare potenziali stati temporanei scuri a causa dell'esposizione alla luce UV.
    Nota: Nelle nostre mani, cambiamenti nell'intensità di fluorescenza rilevati a causa di stati temporanei scuri erano < 1% e potrebbe essere trascurato, ma quegli stati scuri dovrebbero essere valutati per ogni set-up sperimentale.
  6. Per determinare l'efficienza di fotoattivazione, cioè, la frazione di PA-FPs che è acceso per essere fluorescente, negli esperimenti fotoattivazione specifici che sono già stati stabiliti, applicare le stesse impostazioni di fotoattivazione per 15-20 cellule che stanno esprimendo i governanti interni introdotti qui e procedere con l'analisi di immagine (sezione 4). Se all'inizio impostare esperimenti di fotoattivazione, trovare qui alcune impostazioni differenti basate sulla nostra esperienza sperimentale con PA-GFP e PA-ciliegia; modificare come necessario.
    1. Per fotoattivazione istantanea di PA-GFP e PA-ciliegia utilizzando un laser confocale a scansione microscopio (CLSM), applicare μW 90 di 405 nm laser luce nelle iterazioni di 3 o 5, rispettivamente.
      Nota: Con il nostro set-up al microscopio, utilizzando una trasmissione AOTM 38% e un tempo di permanenza del pixel 2 μs, abbiamo misurato questo potere laser 405 nm in modalità di scansione lineare alla lente dell'obiettivo. Con queste impostazioni, circa l'8% e 16% del PA-GFP e PA-Cherry espresso può essere fotoattivazione di essere fluorescente. La serie intera titolazione utilizzando CLSM per fotoattivazione istantaneo è stato precedentemente pubblicato17.
    2. Se un' più alta frazione di fotoattivazione PA-GFP e PA-Cherry fluorofori è vantaggioso per esempio per raggiungere un più alto rapporto segnale-rumore e fotoattivazione non deve essere immediato, applicare μW 40 di 405 nm laser luce con un tempo di permanenza di μs pixel 2 e il 6% Trasmissione di AOTF per 450 iterazioni. Quindi, fotoattivazione vi porterà fino a 4 min invece di solo 1-2 secondi, ma l'efficienza di fotoattivazione per PA-GFP sarà 29% invece di 8%, consentendo un più alto rapporto segnale-rumore.
  7. Se è disponibile un sistema di illuminazione digitale di mosaico contenente le matrici di micro specchio in un modulatore di luce spaziale, luce 405 nm laser può essere utilizzato per widefield-fotoattivazione. Questo consente per fotoattivazione efficiente in pochi millisecondi.
    Nota: Con 1,6 mW laser di potenza misurata alla lente dell'obiettivo e un tempo di esposizione di 250 ms, 29% di PA-GFP può essere fotoattivazione di essere fluorescente.
  8. Immagine con tutti i parametri di fotoattivazione set 15-20 cellule esprimenti PA-GFP — Cherry e GFP — PA-Cherry, rispettivamente.
  9. Poiché pH, specie reattive dell'ossigeno e altri fattori ambientali possono influenzare l'efficienza di fotoattivazione, può essere importante valutare le efficienze di fotoattivazione del PA-FPs nei rispettivi micromilieu subcellulari dove la proteina di interesse è si trova. Accoppiando le chimere fluoroforo alla proteina di interesse, come gli autori hanno fatto con la membrana plasmatica della proteina VSVG 18, fotoattivazione efficienza può essere valutata nel compartimento subcellulare specifico di interesse.

4. analisi dell'immagine e algoritmo per raziometrici quantificazione basata su intensità di fotoattivazione efficienza

  1. Analisi delle immagini può essere fatto con piattaforme ImageJ o Fiji di elaborazione delle immagini di fonte aperta. Determinare l'intensità di fluorescenza di fondo in cellule trasfettate con non nel verde (B1) e rosso (B2) canale. Evitare perinucleare o eventuali aree che mostrano una maggiore auto-fluorescenza.
  2. Per determinare l'intensità di fluorescenza in una cella transfettata, delineare il corpo della cella con lo strumento selezione a mano libera. Ancora una volta, evitare perinucleare o qualsiasi altre aree che mostrano auto-fluorescenza.
  3. Sottrarre il background dell'intensità di fluorescenza misurata in ciascun canale.
    G = hoGreen_measured – B1
    R = IRed_measured – B2
  4. Utilizzare la GFP — costrutto ciliegia per calcolare il rapporto di rosso e verde (RtoGr) e correggere per donatore-tempra a causa del trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET). L'efficienza FRET E è stata determinata per essere 0,3 in precedenti esperimenti per la GFP — costrutto ciliegia utilizzando il linker dell'amminoacido stesso tra i due fluorofori18.
    RtoGr = (hoRed_measured – B2) / (hoGreen_measured – B1)
    RtoGrcorr = RtoGr * (1 – E)
    Nota: In questo intensità-base di approccio, donatore tempra per mEGFP e PA-EGFP potrebbe essere diverso dato possibili proprietà spettrali distinti che non sono stati caratterizzati. Il tasso di FRET (kET) e la distanza di Foerster (R0) dipende il rendimento quantico del donatore che non è stato determinato per mEGFP e PA-EGFP.
  5. Utilizzare la GFP — costrutto PA-Cherry per valutare la frazione di fotoattivazione PA-Cherry. Determinare l'intensità di fluorescenza previsto di PA-Cherry moltiplicando l'intensità di fluorescenza verde inappagata misurato della GFP — PA-Cherry costruire preventiva di fotoattivazione con il corretto rosso-verde-rapporto-(RtoGrcorr ).
    HoRed_expected (IGreen_measured – B1) = * RtoGrcorr
    Nota: Come indicato sopra, la luminosità molecolare il sempre-su FP e fuse FP può essere diversa. Per ulteriori informazioni su come rendere conto di queste differenze, vedere discussione.
  6. Calcolare l'efficienza di fotoattivazione di PA-Cherry come una frazione della fotoattivazione di intensità misurata fluorescenza rossa dopo e l'intensità di fluorescenza previsto nel canale del rosso.
    (FPA-Cherry) = (hoRed_measured – B2) / hoRed_expected
  7. Utilizzare la PA-GFP — costrutto ciliegia per valutare la frazione di fotoattivazione PA-GFP. Determinare l'intensità di fluorescenza previsto di PA-GFP dividendo l'intensità di fluorescenza rossa misurato della PA-GFP — Cherry costruire preventiva di fotoattivazione del rosso-verde-rapporto-(RtoGr). Qui, il RtoGr non deve necessariamente essere corretto per donatore tempra, perché GFP e PA-GFP sono soggetti a tempra per la stessa quantità di donatore.
    HoGreen_expected = (hoRed_measured – B2) / RtoGr
  8. Calcolare l'efficienza di fotoattivazione di PA-GFP come una frazione della fotoattivazione di dopo intensità di fluorescenza verde misurato e l'intensità di fluorescenza previsto nel verde del canale.
    (FPA-GFP) = (hoGreen_measured – B1) / hoGreen_expected

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Il protocollo presentato qui indica la quantificazione raziometrici della frazione di proteine fluorescenti che sono fotoattivazione di essere fluorescente (Figura 1). Questa frazione differisce secondo la modalità di fotoattivazione.

Un risultato tipico utilizzo breve tempo fotoattivazione ad alta potenza con un laser confocale a scansione microscopio (CLSM) è mostrato in Figur...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Finora, nessun metodo ha esistito per determinare in massa la frazione di PA-FPs espressa in cellule vive che è fotoattivazione di essere fluorescente. Il protocollo presentato può essere utilizzato per qualsiasi coppia di proteina fluorescente spettralmente distinta. Mentre esemplificato qui per l'irreversibile PA PA-FPs-GFP e PA-Cherry, questo approccio è in linea di principio applicabile alle proteine fotoconvertibile pure. La proteina fluorescente spettralmente distinta, tuttavia, dovrà essere selezionata con attenzi...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare il laboratorio Dorigo e il servizio di Imaging di Neuroscienze presso la Stanford University School of Medicine per fornire attrezzature e lo spazio per questo progetto.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
vettore di espressione di cellule di mammifero pEGFP-N1Clontech
DMEM senza rosso fenoloThermo Fisher Scientific11054020
tripsina senza rosso fenoloThermo Fisher Scientific15400054
L-glutammina (200 mM)Thermo Fisher Scientific25030081
HEPESThermo Fisher Scientific15630080
Camere LabTek a 8 pozzetti #1.0Thermo Fisher Scientific12565470
Fugene 6PromegaE2691

Riferimenti

  1. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
  2. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).
  3. Renz, M., Lippincott-Schwartz, J. Ch. 9. The Fluorescent Protein Revolution Series in Cellular and Clinical Imaging. Day, R. N., Davidson, M. W. , CRC Press. 201-228 (2014).
  4. Shcherbakova, D. M., Sengupta, P., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Photocontrollable fluorescent proteins for superresolution imaging. Annual Review of Biophysics. , 303-329 (2014).
  5. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  6. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  7. Henderson, J. N., et al. Structure and mechanism of the photoactivatable green fluorescent protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (12), 4176-4177 (2009).
  8. Subach, F. V., et al. Photoactivation mechanism of PAmCherry based on crystal structures of the protein in the dark and fluorescent states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21097-21102 (2009).
  9. Wiedenmann, J., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (45), 15905-15910 (2004).
  10. Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3 (12), e3944(2008).
  11. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
  12. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  13. Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature Methods. 6 (2), 153-159 (2009).
  14. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  15. Slocum, J. D., Webb, L. J. A Double Decarboxylation in Superfolder Green Fluorescent Protein Leads to High Contrast Photoactivation. Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (13), 2862-2868 (2017).
  16. Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6481-6491 (2010).
  17. Renz, M., Wunder, C. Internal rulers to assess fluorescent protein photoactivation efficiency. Cytometry A. , (2017).
  18. Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), E2989-E2997 (2012).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Proteine fluorescenti fotoattivabiliquantificazione delle proteine fluorescentimicroscopia confocale a scansione laserilluminazione a campo largoaccoppiamento geneticorighelli interniefficienza di fotoattivazioneimaging di cellule vivemicroscopia a fluorescenzaproteine spettralmente distinte

Articoli correlati