Articolo metodologico
Qui, presentiamo un protocollo che coinvolge fuse spettralmente distinti geneticamente accoppiati e proteine fluorescenti. Queste chimere di proteina fluorescente permettono quantificazione della frazione PA-FP è fotoattivazione di essere fluorescente, cioè, l'efficienza di fotoattivazione. Il protocollo rivela che i diversi modi di fotoattivazione rendimento fotoattivazione diverse efficienze.
Fuse e - proteine fluorescenti convertibile (PA-FPs) sono state utilizzate in microscopia a fluorescenza cellule vive per analizzare la dinamica di cellule e proteine Ensemble. Finora, nessun metodo è stato disponibile per quantificare in massa e in vivo le cellule espresso quanti del PA-FPs sono fotoattivazione di fluorescenza.
Qui, presentiamo un protocollo che coinvolge righelli interni, vale a dire, geneticamente accoppiato spettralmente distinta (fuse) proteine fluorescenti, a ratiometrically quantificare la frazione di tutte le PA-FPs espresse in una cellula che sono accesi per essere fluorescente. Usando questo protocollo, mostriamo che diverse modalità di fotoattivazione dato fotoattivazione diverse efficienze. Fotoattivazione breve ad alta potenza con un laser confocale a scansione microscopio (CLSM) ha provocato fino a quattro volte inferiore fotoattivazione efficienza di centinaia di esposizioni a basso livello applicate da CLSM o un breve impulso applicato da widefield illuminazione. Mentre il protocollo è stato esemplificato qui per GFP (PA-) e (PA-) Cherry, può in linea di principio essere applicato a qualsiasi coppia di proteina fluorescente fuse o fotoconvertibile spettralmente distinta e qualsiasi set-up sperimentale.
Nel 2002, il primo ampiamente applicabili fuse (PA-GFP1) e fotoconvertibile (Kaede2) proteine fluorescenti sono stati descritti. Queste proteine fluorescenti ottico evidenziatore modificarne le proprietà spettrali all'irradiazione con luce UV, cioè, essi diventano luminose (proteine fluorescenti fuse, cioè, PA-FPs), o cambiare il loro colore (fotoconvertibile FPs). Fino ad oggi, diversi reversibile e irreversibile fuse e fotoconvertibile proteine fluorescenti sono stati sviluppati3,4. Negli studi ensemble o alla rinfusa, evidenziatori ottici son....
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1. plasmide costruzione
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Il protocollo presentato qui indica la quantificazione raziometrici della frazione di proteine fluorescenti che sono fotoattivazione di essere fluorescente (Figura 1). Questa frazione differisce secondo la modalità di fotoattivazione.
Un risultato tipico utilizzo breve tempo fotoattivazione ad alta potenza con un laser confocale a scansione microscopio (CLSM) è mostrato in Figur.......
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Finora, nessun metodo ha esistito per determinare in massa la frazione di PA-FPs espressa in cellule vive che è fotoattivazione di essere fluorescente. Il protocollo presentato può essere utilizzato per qualsiasi coppia di proteina fluorescente spettralmente distinta. Mentre esemplificato qui per l'irreversibile PA PA-FPs-GFP e PA-Cherry, questo approccio è in linea di principio applicabile alle proteine fotoconvertibile pure. La proteina fluorescente spettralmente distinta, tuttavia, dovrà essere selezionata con attenzi.......
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Vorremmo ringraziare il laboratorio Dorigo e il servizio di Imaging di Neuroscienze presso la Stanford University School of Medicine per fornire attrezzature e lo spazio per questo progetto.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| vettore di espressione di cellule di mammifero pEGFP-N1 | Clontech | ||
| DMEM senza rosso fenolo | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| tripsina senza rosso fenolo | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| L-glutammina (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| Camere LabTek a 8 pozzetti #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 |
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