Articolo metodologico

Recupero di biocitina e ricostruzioni 3D di interneuroni riempito Hippocampal CA2

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DOI:

10.3791/58592

⸱

20 novembre 2018

 ,  , 
1Department of Pharmacology, University College London

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Il protocollo descritto qui descrive l'analisi di immunofluorescenza, biocitina recupero e ricostruzioni di alta qualità di hippocampal CA2 interneuroni seguendo le registrazioni elettrofisiologiche intracellulari in vitro, permettendo un neurone caratterizzazione e infine bene anatomia un neurone per essere studiato.

Abstract

Come attività di rete corticale elabora informazioni sono di importanza per un gran numero di domande scientifiche di base e cliniche. Il protocollo descritto qui identifica i componenti di base di questo circuito. Studi approfonditi di regioni corticali in definitiva fornirà altri scienziati con i componenti del circuito necessaria per la comprensione di come il cervello acquisisce, elabora e memorizza le informazioni e ciò che va storto nella malattia, mentre l'elettrofisiologici e sui dati morfologici sono ampiamente utilizzati dai neuroscienziati computazionali nella costruzione di reti di modello che esplorano l'elaborazione delle informazioni. Il protocollo descritto qui descrive come cellule piene di biocitina registrate nella regione CA2 dell'ippocampo sono recuperate e poi ricostruite in 3D. Inoltre, il protocollo descrive la dimostrazione della proteina obbligatoria del calcio o peptide contenuto in interneuroni registrati.

Introduzione

La corteccia e nell'ippocampo sono strutture di tale complessità che la classificazione di un neurone sottotipi1,2,3,4, mappe delle connessioni tra loro5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 e come questo circuito supporta funzioni cognitive12,13,14,15 sono ancora in fase di intenso studio e oggetto di continuo dibattito. Ad esempio, per capire i dettagli e le complessità dei circuiti e di coordinare i dati ottenuti da diversi studi, è estremamente utile essere in grado di definire e descrivere i componenti, ma rimane una questione di dibattito come molti differenti classi di neuroni esiste, o anche se è possibile definire tutti i neuroni come appartenenti a una classe specifica. Strumenti di calcolo che possono costruire e collaudare i circuiti con diversi gradi di complessità sono essendo sviluppato16,17,18, ma centrale di questi sforzi è la necessità di studi dettagliati dei tipi cellulari e delle proprietà delle connessioni tra loro. Una grande quantità di informazioni sui circuiti locali della neocorteccia dei ratti adulti sono già stati raccolti utilizzando il protocollo descritto qui10,19,20,21, 22. anche se lo "schema elettrico" è lungi dall'essere completo, alcuni chiari schemi o regole sono emerse. Inoltre, anche se alcuni dettagli possono variare, queste regole sono comuni due specie di mammiferi (gatto e topo) e da altra parte parecchie regioni neocorticali, permettendo lo sviluppo di blocchi predefiniti di base che sono suscettibili di essere ugualmente applicabile a neocortex umano. La tecnica qui descritta è utilizzata per estendere la nostra comprensione della mappa funzionale dei circuiti corticali identificando i neuroni presinaptici e postsinaptici coinvolti nelle connessioni nelle regioni che non sono state studiate in dettaglio prima, utilizzando un protocollo che permette di tessuto eccellente conservazione e recupero notevole colorazione nel tessuto del cervello adulto. Dati sulle proprietà neuronali in questo sottocampo e il circuito di locale in CA2 sono stati raccolti con questo metodo combinando le registrazioni elettrofisiologiche intracellulari (registrazioni accoppiate con taglienti microelettrodi) con biocitina riempimento, immunofluorescenza, procedure istologiche e altamente dettagliate ricostruzioni neuronale, permettendo un confronto diretto con le vicine CA regioni23,24,25.

La tecnica descritta in questo articolo è stata sviluppata nel corso degli anni per ottenere dettagliata anatomia di un neurone permettendo la corretta classificazione delle cellule e di alta qualità e accurate ricostruzioni di entrambi loro dentritici ed axonal pergole, dati che possono essere correlato con dati elettrofisiologici raccolti da registrazioni accoppiate usando degli elettrodi affilati. Il protocollo istologico è stato ottimizzato per preservare l'ultrastruttura dei neuroni e ottenere eccellente recupero di entrambi (tra cui delle spine dendritiche) e pergole assonale. Ad esempio, il principio della tecnica doppia fissazione in primo luogo immergendo in una soluzione fissante e in secondo luogo post-fissazione in tetrossido di osmio dà un buon contrasto per microscopia chiara26. Una piccola quantità di soluzione di acido picrico e glutaraldeide vengono aggiunti alla soluzione fissante per migliorare la penetrazione dell'anticorpo e preservare l'ultrastruttura delle cellule come suggerito in un precedente studio27. La permeabilizzazione delle fette del cervello utilizzando il metodo di congelamento-scongelamento combinato con cryo-protezione con saccarosio, piuttosto che un detersivo tradizionale, fornisce anche una conservazione ottimale dei tessuti per dettagliate analisi morfologica delle cellule registrate. Inoltre, la visualizzazione in particolare di strutture molto belle è migliorata riducendo la colorazione di fondo, con le incubazioni con perossido di idrogeno (H2O2) e sodio boroidruro (NaBH4). L'aggiunta di cloruro di nichel (Burundi2) per la perossidasi di rafano (HRP) reazione per ottenere un prodotto di reazione di pigmento nero aumenta anche il contrasto.

Il seguente protocollo descrive le procedure per accertare la conservazione dei tessuti eccellenti e altamente dettagliate ricostruzioni 3D neuronale dopo registrazioni intracellulari in vitro. La descrizione della preparazione fetta, intracellulare accoppiate registrazioni utilizzando sharp elettrodi e successive procedure istologiche utilizzate nel nostro laboratorio sono stati precedentemente segnalati28. Sebbene il protocollo si applica alla celle riempite intracellulare con biocitina in fette spesse di 450 – 500 μm, può essere utilizzato lo stesso protocollo seguito cellule intere registrazioni. Tuttavia, l'uso delle fette più sottili si tradurrà in meno complete ricostruzioni delle cellule.

Protocollo

Tutte le procedure usate nel corso di questo studio sono state eseguite secondo le normative del British Home Office per quanto riguarda l'animale scientifico procedure Act del 1986.

1. determinazione del calcio Binding Protein o contenuto proteico di interneuroni e visualizzazione di biocitina seguito registrazioni elettrofisiologiche e riempimento biocitina

Nota: Al termine delle registrazioni elettrofisiologiche, sezioni che contengono le cellule piene di biocitina corretti durante la notte prima delle procedure istologiche. La soluzione fissante verrà sostituita con un singolo cambiamento di tampone fosfato 0,1 M la mattina successiva, se il resto della procedura viene effettuato in un altro giorno, al fine di prevenire danni ai tessuti. La soluzione di fissazione (paraformaldeide al 4%, 0,2% saturi acido picrico soluzione, soluzione di glutaraldeide 0.025% in tampone fosfato 0,1 M (PB)) deve essere fatta fresca il giorno delle registrazioni per ottenere i migliori risultati.

  1. Alla fine della registrazione elettrofisiologica, attentamente prendere la fetta contenente le celle registrate con un pennello e metterlo in una pentola contenente liquido spinale cerebrale artificiale (ACSF).
    Nota: Dettagli del protocollo utilizzato per la preparazione di fetta e registrazioni intracellulari usando degli elettrodi affilati sono stati descritti precedentemente28.
  2. In una cappa, attentamente prendere la fetta di cervello con un pennello e stenderla su un piccolo pezzo di carta da filtro qualità fine. Inserire un altro pezzo di carta da filtro inumidito sulla fetta e inserire i due pezzi di carta da filtro bagnato in un piccolo pot di plastica contenente 5-10 mL di soluzione fissante e conservare in frigorifero durante la notte a 4 ° C.
  3. Preparare una soluzione di gelatina in acqua distillata. Mettere 20 mL di acqua distillata in un becher su un piatto caldo e riscaldare fino a 60 ° C. Aggiungere progressivamente 2,4 g di gelatina in acqua, attendere fino a completa dissoluzione e lasciarla raffreddare a 35 – 40 ° C prima dell'uso per evitare danni ai tessuti.
  4. Sostituire la soluzione fissante con 2 mL di PB 0,1 M. Posizionare la fetta in una capsula di Petri e tagliare qualsiasi tessuto in eccesso con un bisturi. Posizionare il tessuto tagliato in una capsula Petri (diametro di 9 cm, altezza di 1,4 cm), garantendo che giace piatto senza pieghe o grinze e rimuovere il tampone in eccesso con un pennello asciutto.
  5. Coprire il tessuto con la soluzione di gelatina calda e la piastra di Petri su un blocco congelato rapidamente raffreddare la soluzione.
  6. Utilizzando una lampada di angolo-portamento per fornire contrasto, guardare attraverso il lato del piatto e mantenere la fetta piatta esercitando una leggera pressione da un pennello fine fino a quando la gelatina inizia a fissarsi.
    Nota: La gelatina può essere ri-fusa se il tessuto non giace piatto. Eventuali imperfezioni sulla superficie della gelatina ha causata dalla rimozione del pennello come si solidifica possono essere rimosso dalla fusione dello strato superficiale delicatamente spostando il bulbo della lampada vicino alla superficie per pochi secondi.
  7. Spostare il piatto di gelatina di impostazione in frigo e lasciare a 4 ° C per 30-60 min.
  8. In una cappa, ritagliare un piccolo blocco (~ 1 x 1 cm) contenenti il gelatina-incastonati del tessuto del piatto usando un bisturi, sollevare il blocco con una piccola spatola e attentamente posizionarlo nella soluzione fissante stessa ma fresca utilizzata per fissare le fette per almeno 30 min a 4 ° C .
  9. Lavare il blocco di gelatina in 5 mL di 0,1 M PB tre volte, asciugarlo con un pezzo di fazzoletto di carta e bastone lato blocco up (cioè, con il tessuto nella parte superiore) su un vibratome chuck utilizzando colla a presa rapida.
  10. Togliere la colla in eccesso con un pezzo di carta da filtro e utilizzare un bisturi per tagliare gli angoli del blocco, lasciando una forma di diamante.
  11. Sezione la fetta a 50 µm spessore utilizzando un vibratomo e posizionare attentamente ogni sezione in un flaconcino di vetro contenente 10% di saccarosio.
  12. Attentamente prendere una sezione dal flaconcino, posizionarla piatta in un coperchio di scatola di Petri. Utilizzando un microscopio da dissezione e un bisturi fresco, rimuovere la gelatina da intorno alla sezione e tornare alla sezione un flaconcino contenente 2 mL di saccarosio al 10% fresco
    Nota: È fondamentale rimuovere quanto più gelatina come possibile in questa fase per ridurre il restringimento del tessuto durante la fase di disidratazione (passo 1,37).
  13. Cryo-proteggere le sezioni di soluzione 0,1 M PB-base saccarosio-glicerolo a temperatura di incubarle per 10 minuti nella soluzione di saccarosio al 10%, 20 min in soluzione 20% saccarosio - 6% glicerolo due volte e infine 30 min in soluzione al 30% saccarosio - 12% glicerolo due volte sotto agitazione costante.
  14. Inserire le sezioni su un piccolo rettangolo di carta stagnola con un pennello. Rimuovere il liquido in eccesso dalle sezioni e piegare con cura la carta stagnola in un pacco.
  15. Tenere il pacco vicino alla superficie dell'azoto liquido senza toccare la superficie per 30 s e quindi consentire le sezioni scongelare completamente per circa 30 s. Ripeti il gelo-disgelo altre due volte.
  16. Rimuovere tutte le sezioni con un pennello e metterli in un flaconcino di vetro contenente 2 mL di PB 0,1 M sotto costante agitazione per lavare via l'eccesso saccarosio.
  17. Rimuovere il PB con una pipetta Pasteur e incubare le sezioni in 2 mL di 1% acquosa H2O2 per 30 min. lavare le sezioni in 2 mL di PB 0,1 M 3 x 5 min.
  18. Rimuovere il PB 0,1 M con una pipetta Pasteur e aggiungere 1% sodio boroidruro (NaBH4) in PB 0,1 M.
    Nota: Non tappo del flaconcino, come NaBH4 soluzione emana gas idrogeno.
  19. Rimuovere il boroidruro di sodio con una pipetta Pasteur e lavare le sezioni completamente in 2 mL di PB 0,1 M 5 x 5 min.
  20. Sostituire il PB 0,1 M con 10% siero di capra normale (NGS) in PB 0,1 M per 30 min.
  21. Rimuovere il siero di capra e incubare le sezioni durante la notte a 4 ° C in una miscela di mouse monoclonale e anticorpi policlonali di coniglio costituiti in soluzione di ABC.
    Nota: Viene visualizzato un elenco di anticorpi primari utilizzati negli studi precedenti nella tabella 1 in casinista et al. (2014) 29.
  22. Incubare le sezioni per 2 h al buio in una miscela di anticorpi secondari fluorescente etichettati (Tabella materiali).
  23. Montare i profili sui vetrini in mezzo di montaggio e coprire con un vetrino coprioggetti.
  24. Prendere le immagini di fluorescenza etichettatura all'ingrandimento 40x (Figura 1Bb).
  25. Dopo la fluorescenza di imaging, porre il vetrino in una piastra di Petri di vetro contenente PBS e rimuovere delicatamente il vetrino coprioggetti. Poi lavare le sezioni dal vetrino usando gli impulsi delicati di PBS da una pipetta Pasteur. Inserire le sezioni in un flaconcino di vetro pulito contenente PBS.
  26. Eseguire la reazione di avidina-HRP incubando in primo luogo le sezioni in ABC per almeno 2 h per amplificare il prodotto di reazione di HRP.
  27. Preparare la soluzione di 3,5 diaminobenzidina (DAB) con l'aggiunta di una compressa a 5 mL di acqua distillata.
  28. Lavare le sezioni con PBS tre volte per 10 minuti e poi rimuovere il tampone Tris dopo l'ultimo lavaggio con tampone Tris due volte per 10 min.
  29. Rapidamente, aggiungere una goccia di soluzione di2 del Burundi di 8% per la soluzione DAB, dispensare la soluzione dentro e fuori per mescolare e rapidamente aggiungere 1 mL di questa soluzione sopra le sezioni. Incubare le sezioni nella soluzione2 DAB/Burundi per 15 min.
  30. Aggiungere 10 µ l di 1% H2O2 alla soluzione DAB. Consentire la reazione procedere al buio sotto costante agitazione per circa 1 o 2 min e monitorare l'etichettatura delle celle riempite con un microscopio per dissezione.
  31. Fermare la reazione rimuovendo la DAB/Burundi2/h2O2 soluzione e lavare le sezioni con tampone Tris due volte per 5 min.
  32. In una cappa, inserire un piccolo cerchio di carta da filtro in una capsula di Petri e frenarla con PB 0,1 M. Sollevare le sezioni uno alla volta dal vetro fiala utilizzando un pennello e metterli attentamente piatto su carta.
  33. Coprire le sezioni con un altro cerchio inumidito di carta da filtro e rimuovere il tampone in eccesso toccando delicatamente la carta velina alla superficie.
  34. Applicare 8 – 9 gocce di tetrossido di osmio 1% in 0.1 M PB per la carta superiore, Incoperchiare il recipiente e conservare nella cappa fumi per almeno 30 min, ma non più di 1 h.
  35. Aprire la capsula di Petri e sollevare la carta superiore del filtro. Sollevare con cura le sezioni uno alla volta con un pennello, metterli in un flaconcino di vetro e sciacquarli in acqua distillata due volte.
  36. Smaltire i rifiuti tetrossido di osmio in modo appropriato. Sciacquare tutte le attrezzature monouso e metterli in appositi contenitori.
  37. Inserire ogni sezione piatta su un vetrino e il coprioggetto le sezioni. Trasferire la diapositiva in una capsula di Petri, posizionare una fiala di vetro vuota sopra il vetrino coprioggetto di conservarlo in luogo e coprire con alcool al 50%. Dopo 15 min, rimuovere il vetrino dalla soluzione e rimuovere le sezioni dal vetrino. Posto le sezioni indietro sulla diapositiva e quindi porre il vetrino in alcool al 70% per un minimo di 15 ripetere lo stesso processo con 95% e, infine, soluzione di alcool 100%.
  38. Dopo la fase di disidratazione, trasferire le sezioni di un flaconcino di vetro contenente 100% alcool su un agitatore in una cappa aspirante. Sostituire la soluzione di alcool con ossido di propilene (C3H6O) e lavare tre volte per 5 min. Dopo l'ultimo lavaggio, mantenere ~ 2 mL di ossido di propilene nel flaconcino e aggiungere la resina (rapporto 1:1). Assicurarsi che la resina è dissolto e mantenere le sezioni sotto costante agitazione per 30 min.
  39. Posizionare ogni sezione in un planchette di alluminio contenente resina epossidica utilizzando un bastone di legno e incubare per una notte.
    Nota: Non lasciare le sezioni nella resina più di 24 ore per evitare il rischio di danneggiare le sezioni.
  40. Posto la planchette sopra una piastra calda per circa 10 min. Pick up ogni sezione con un bastone di legno e metterli su un vetrino pulito. Mantenere l'orientamento di ogni sezione coerente utilizzando un microscopio per dissezione. Posto un vetrino coprioggetto sopra le sezioni. Porre il vetrino in forno per 48 h a 56 ° C per la polimerizzazione.

2. 3D ricostruzioni neuronale

Nota: Il software Neurolucida viene utilizzato. Istruzioni fornite di seguito si applicano solo a un sistema di ricostruzione del neurone specifico (Tabella materiali). Le sezioni ottenute dal taglio sono abbinate prima le ricostruzioni utilizzando un microscopio.

  1. Inserire una diapositiva sul palco e fissarlo con la fascetta di fase e aprire il software di ricostruzione del neurone. Fare clic sulla scheda Acquisisci e selezionare l'immagine dal vivo.
  2. Misurare lo spessore di ogni sezione utilizzando 100 X obiettivo di olio. Prendere nota del valore z-Meter nella parte superiore e inferiore di ciascuna sezione e calcolare lo spessore di sezione come la differenza dei due valori.
  3. Utilizzare un basso ingrandimento obiettivo per concentrarsi sulla sezione Home contenente il corpo della cella. Quindi utilizzare un obiettivo 100x, concentrarsi sul corpo cellulare e fare clic al centro per segnare il punto di riferimento.
  4. Dalla scheda traccia , selezionare Serial sezione Manager. Quindi selezionare Crea nuova sezione (+ icona) nella finestra del Gestore della sezione di serie . Immettere il numero di sezioni. Nome ogni sezione nell'ordine Z corretto e immettere lo spessore di taglio misurato nel punto 2.2.
  5. Per tracciare il soma in 3D utilizzando obiettivo 100x, selezionare il contorno da scheda traccia e selezionare il contorno del corpo cellulare . Utilizzare il joystick per spostare lo stato attivo alla parte superiore del corpo cellulare. Posizionare i punti facendo intorno al perimetro della parte che è attualmente a fuoco. Pulsante destro del mouse e selezionare Close Contour per finire questo primo abbozzo. Ripetere questo processo alle posizioni differenti z fino a raggiungere il fondo del corpo delle cellule (Figura 2).
    Nota: Selezionare 3D visualizzare nella scheda traccia per visualizzare il corpo cellulare in 3D.
  6. Per tracciare il corpo cellulare in 2D utilizzando obiettivo 100x, selezionare corpo cellulare dal menu neurone nella scheda traccia Focus su metà del corpo cellulare. Posizionare i punti facendo intorno al perimetro del corpo cellulare. Per completare il corpo cellulare, pulsante destro del mouse e selezionare finitura corpo cellulare.
  7. Per tracciare l'arbor dendritiche, selezionare Dendrite o Dendrite apicale nel menu neurone . Prima di tracciare un segmento breve, iniziale per ogni dendrite utilizzando la rotellina del mouse per regolare il diametro del cursore per corrispondere al diametro del dendrite. Risalire lungo ogni dendriti utilizzando il joystick per spostare tutta la sezione e la rotellina del mouse per regolare il diametro del ricalco.
  8. Controllare l'allineamento del ricalco con l'immagine al microscopio dal vivo e regolare se necessario, soprattutto dopo lo spostamento utilizzando il joystick. Nella scheda traccia , selezionare Allinea l'analisi, fare clic sul tracciato e quindi fare clic su nella posizione corretta.
  9. Quando viene raggiunto un nodo nell'albero, fare clic destro e selezionare Nodo biforcante o Trifurcating dal menu a discesa.
  10. Quando viene raggiunta la fine di un ramo, è possibile selezionare un finale dal menu a discesa del menu del neurone . Selezionare il tipo di finale corretto, vale a dire., alta fine, fine normale o low fine per facilitare la corrispondenza più sezioni.
  11. Ridurre l'ingrandimento sul microscopio una volta tutti i dendriti nella sezione corrente sono stati rintracciati, selezionare la scheda Joy Free e spostare in una sezione che corrisponde immediatamente sopra o sotto la sezione completata.
  12. Per identificare i punti corrispondenti tra i dendriti in una sezione che corrisponde alla sezione completata, fare clic sulla scheda spostare e selezionare Match Point. Selezionare il numero di punti necessari per essere abbinati (tre o più punti è comodo) e quindi premere OK. Fare clic sul finale di un ramo completato e quindi fare clic sul ramo. Ripetere questa operazione per ogni punto di fiammifero. Ripetere questo processo a 100 ingrandimenti per garantire la corrispondenza esatta.
  13. Aggiungere rami corrispondenti alla sezione precedente direttamente facendo clic su fine. Selezionare Aggiungi alla fine quando il ramo si allinea con il ramo tracciato completato e traccia come descritto in precedenza.
  14. Una volta che tutti i dendriti di ogni sezione sono stati rintracciati, tracciare l'assone utilizzando lo stesso processo selezionando Axon dal menu neurone .
  15. Vai alla sezione Home , ri-allineare la ricostruzione con l'immagine al microscopio dal vivo e selezionare contorni da scheda traccia e selezionare un bordo di confine/regione di contorno/strato pre-definito e fare clic su da tracciare lungo un contorno. Selezionare fine contorno aperto. Tracciare tutti i livelli desiderati e contorni di regione.
  16. Utilizzare 3D visualizzare nella scheda traccia per visualizzare le ricostruzioni in 3D.
  17. Per registrare video di ricostruzioni 3D (Video 1), aprire la ricostruzione 3D e Crea film. Impostare un file di destinazione e la velocità di rotazione desiderata. Si consiglia di impostare la rotazione a 270°. Selezionare Avvia la registrazione, record per pochi secondi, quindi fare clic su rotazione automatica. Selezionare interrompere la registrazione quando richiesto. Modificare il video con un software di video editing (Tabella materiali).
  18. Per esportare i file in file Tiff o JPEG, selezionare File | Esportare | L'analisi di esportazione come immagine. Scegliere un rapporto di µm/pixel e selezionare adatta. Selezionare un colore di sfondo e selezionare il File. Nome del file, selezionare Tiff o JPEG e premere Salva. Per esportare i file in file vettoriali, selezionare File | Esportare | L'analisi di esportazione come file vettoriali.
  19. Utilizzare un software di analisi di ricostruzione del neurone per eseguire le analisi morfometriche.
    1. Per analizzare alberi dendritiche e ottenere un dendrogramma, aprire il file in Neurolucida Explorer. Seleziona analizza | Struttura e selezionare dendrogramma dal menu a discesa (Figura 3).
    2. Per eseguire un'analisi morfometrica completa delle ricostruzioni 3D (ramo complessità, volumi di rami ed i somas, superficie), è possibile aprire il file nel software. Nella scheda visualizzazione , fare clic su Seleziona tutto. Selezionare la scheda analizza . Quindi selezionare struttura e Analisi della struttura di Branch.

3. ricerca guasti

  1. Modificare le impostazioni della fotocamera. Per risultati ottimali, impostare il tempo di esposizione a meno di 100 ms e guadagno e offset più vicino a 0 come possibile.
  2. Se il software di ricostruzione di neurone non vengono visualizzati automaticamente i contorni tracciati come un corpo cellulare 3D in 3D visualizzare nella scheda traccia , selezionare selezionare oggetti nella scheda traccia , tenere premuto il tasto Ctrl sulla tastiera e fare clic su tutti i contorni disegnati, tasto destro del mouse e poi selezionare Set corpo cellulare dal menu a discesa.
  3. Per regolare i parametri z di un ramo specifico, selezionare l'albero (selezionare oggetti nella traccia scheda) e impostare la z-regolazione di tutti i punti tramite il menu di scelta rapida menu a discesa. Selezionare modifica posizione z, quindi selezionare valore z Maiusc e immettere il valore desiderato.
  4. Riallineare le ricostruzioni utilizzando 'Vai a' nella scheda ' spostare' quando è necessario spostare una grande distanza sopra il tracciato.
  5. Aggiungere altri nodi in qualsiasi punto durante il processo di ricostruzione. Selezionare il ramo dove il nodo deve essere messo in (Seleziona oggetto nella scheda traccia e fare clic sul ramo), tasto destro del mouse e selezionare Inserisci nodo nella struttura ad albero selezionato. Scegliere la posizione giusta sul ramo.
  6. Quando ricostruire un complesso singolo neurone, traccia corrispondenti rami individualmente e successivamente di giuntura per facilitare l'identificazione dei rami. Tracciare i rami nella nuova sezione singolarmente e quindi allegare questi rami rami corrispondenti su sezione precedente si libra sopra il finale del ramo per essere impiombato, pulsante destro del mouse e selezionare Splice, quindi si libra sopra il finale che il ramo è quello di essere impiombato a e fare clic su.
  7. Se un ramo è tracciato sotto il tipo di albero sbagliato, selezionare l'albero, pulsante destro del mouse e selezionare Cambia tipo di alberoe selezionare il tipo di albero corretto.
  8. Se un punto è posizionato in modo non corretto, eseguire Ctrl + Zoppure fare clic sul pulsante Annulla nel menu traccia per rimuovere l'ultimo punto. Tuttavia, questa procedura non funzionerà se il joystick è utilizzato per spostare tutta la sezione prima di tentare di rimuovere un punto. In questo caso, il punto può essere rimosso quando il ramo si è concluso. Selezionare il ramo (premere Seleziona oggetto e clicca sul ramo), passa il mouse sopra il punto per essere rimosso, pulsante destro del mouse e selezionare Rimuovi punto.
  9. Se non siete sicuri che se due rami sono abbinati, 1) utilizzare Visualize 3D nella scheda traccia per controllare se i rami corrispondono nel piano z, o 2) utilizzano la funzionalità di Mostrare che fiancheggiano il Serial sezione Manager per visualizzare sezioni immediatamente sopra e sotto la sezione corrente in grigio.
  10. Se una sezione è capovolto, vai a strumenti nella scheda traccia Selezionare Regola XY ridimensionamento e modificare l'asse x a -1. Quindi selezionare corretto Z-restringimento e cambiare asse z a -1. Quindi tracciare rami come al solito. Ricordarsi di invertire questi cambiamenti quando si passa a una sezione che aveva l'orientamento originale. Cambiando l'asse x e z - non cambierà ramo termina le etichette, quindi fate attenzione quando splicing che le terminazioni corrette vengono utilizzate.
  11. Z-restringimento corretta può essere corretto, se c'è una differenza significativa tra la sezione di spessore di taglio e lo spessore montato misurato. Nella scheda analisi , selezionare strumenti, quindi correggere Z-restringimentoe immettere il fattore di ritiro per l'asse z come una rappresentazione decimale dello spessore taglio diviso per lo spessore montato.

Risultati

Neuroni hippocampal CA2 erano pieni di biocitina seguito registrazioni elettrofisiologiche (figure 1Ac, annuncio e 1Bc, Bd). Le fette sono state fissate a seguito durante la notte le registrazioni e la neurochimica e caratterizzazione morfologica dei neuroni sono stati rivelati seguendo il protocollo descritto qui.

La proteina obbligatoria del calcio o il contenuto proteico di interneuroni riempiti è stata determinata incubando le fette prima con gli anticorpi primari e poi con gli anticorpi secondari coniugati fluorescente. Le caratteristiche di cottura di interneuroni durante le registrazioni a dettare la scelta di anticorpi primari utilizzati. Avidina-AMCA è stato usato per prevedere l'interneurone biocitina-riempito e anti-topo isotiocianato di fluoresceina (FITC) e capra anti-coniglio Texas Red (TR) era usate per caratterizzare la neurochimica interneuronale (Figura 1 BB).

Dopo la visualizzazione di fluorescenza, un protocollo HRP è stato usato per rivelare la biocitina (Figura 1Ab). Anatomia dettagliata bene di interneuroni CA2 quindi è stato disegnato in 3D utilizzando un software di ricostruzione del neurone (Figura 2 e Figura 3a). Un video di una ricostruzione 3D di una cellula di cesto registrata e riempito in CA2 viene visualizzato a Video. Ricostruzioni di un neurone sono stati considerati come completa se entrambe le pergole dentritici ed axonal furono confinati all'interno della profondità della fetta 450-500 μm. Povero arbor axonal macchiatura è stata valutata la presenza di rami troncati con finali aperti nella parte superiore o parte inferiore della sezione o da una colorazione che è stata limitata al segmento iniziale dell'assone e rami molto prossimale. Figura 4 rappresenta gli esempi di una buona e una povera HRP colorazione seguente visualizzazione biocitina.

L'analisi morfometrica di ricostruzioni 3D (Figura 3) possono essere effettuata per dimostrare la complessità di ramo, soma superficie e la superficie e il volume delle pergole dentritici ed axonal.

figure-results-1
Figura 1 : Un neurone ricostruzioni di due tipi di cellule del cestino registrata e riempito nella regione hippocampal CA2 e correlato dati elettrofisiologici ottenuti seguendo le registrazioni intracellulari in vitro. Questa figura è stata modificata da precedenti studi23,24. COSÌ Stratum Oriens, SP Stratum Pyramidale, SR strato radiato, SLM Stratum Lacunosum molecolare. (A), Aa: ricostruzione di una cella di cesto CA2 con limitato arbor dentritici ed axonal, utilizzando un tubo di disegno (1000 X). I dendriti sono in nero, e l'assone è in rosso. AB: Immagine della cella cesto pieno di biocitina seguendo il protocollo di avidina-HRP descritto qui. AC: Rappresentanza traccia delle risposte di tensione a hyperpolarizing e depolarizzando iniezione corrente di una cella di cesto CA2 con limitato arbor dentritici ed axonal. Annuncio: Esempio di una piramide di CA2 per restringere le connessioni arbor canestro cella registrato utilizzando degli elettrodi affilati. Composito potenziale post-sinaptico eccitatorio (EPSP) medie mostrano treno breve depressione apparente durante le risposte ai treni di tre punte. (B) Ba: ricostruzione 2D di una cella di cesto CA2 con ampia dentritici ed axonal pergole utilizzando un tubo di disegno (1000 X). L'albero dendritico di questa cella cesto (in nero) esteso radialmente attraverso tutti gli strati della regione CA2 e orizzontalmente in SO e SP delle regioni CA2 e CA3. Un dendrite orizzontale raggiunto anche la regione CA1. L'assone (in rosso) esteso alle regioni CA3 e CA1. BB: La piena di biocitina (AMCA macchiatura) canestro cella era PV-immunopositive (FITC colorazione) e CB-immunonegative (colorazione rosso-Texas). BC: Rappresentanza traccia delle risposte di tensione a hyperpolarizing e depolarizzando iniezione corrente di una cella di cesto CA2 con ampia dentritici ed axonal arbor. BD: Composito EPSP medie mostrano breve treno facilitazione apparente durante le risposte ai treni di tre punte. Esempi di altri tipi di interneuroni registrate in CA2 possono essere trovati in precedenti studi25,30. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

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Figura 2 : Ricostruzione 3D delle cellule del corpo. (A) l'analisi 3D del corpo cellulare. Vista dei contorni diversi tracciati a posizioni diverse z mentre messa a fuoco attraverso il corpo cellulare. (B) vista 3D dei contorni diversi. (C) vista 3D del corpo delle cellule ad un angolo differente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

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Figura 3 : Analisi di morfometria di ricostruzioni 3D di un neurone. (A) ricostruzione 3D di una cellula di cesto stretto arbor CA2. Ogni ramo dendritica è rappresentato da un colore (verde, blu, rosso e rosa) e dell'assone è in azzurro. (B) dendrogramma della cella cesto che rappresenta il numero delle ramificazioni dendritiche e la lunghezza di ogni segmento contenuta all'interno di sfere concentriche con il soma e a 100 μm intervalli dal soma. I colori il dendrogramma corrispondono a quelle di dendriti in a. (C) esempio di analisi morfometrica eseguita su cellule piramidali CA2 (adattate da un precedente studio23). Il numero delle ramificazioni dendritiche era tramato contro la distanza dal soma delle cellule piramidali CA2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

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Figura 4 : Esempi di buona (A) e poveri (B) HRP macchiatura. (A) biocitina recupero ha rivelato un interneurone molto ben riempito in CA2. Il corpo delle cellule (CB) è macchiato scuro e ha contorni chiari. I dendriti sono in rilievo e visualizzate alcune spine (rappresentati da stelle rosse). L'arbor assonale (A) è denso e presenta piccole boutons. (B) esempio di un povero dentritici ed axonal macchiatura delle 2 cellule piramidali in CA2. La colorazione della CB è debole con nessun contorno chiaro. Povero di colorazione è spesso associato con più brevi registrazioni elettrofisiologiche, con conseguente presenza di pochissimi rami biocitina-riempito. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Video 1: 3D ricostruzione neuronale di una cella di cesto CA2 con limitato arbor dendritiche (noto anche come cellula di cesto stretto arbor CA2) con sua soma nel corneum pyramidale, dendriti che attraversa tutti gli strati e assone in CA2 corneum pyramidale e adiacente strato oriens e radiato. Molto pochi rami ha raggiunto la prossimale CA3 strato oriens e CA3 corneum pyramidale. Questa cella è stata riempita con biocitina seguito registrazioni elettrofisiologiche e sezioni sono stati elaborati con avidina-HRP seguendo il protocollo descritto qui. A causa di affettare, solo l'assone all'interno della profondità della fetta è stato recuperato, anche se i dendriti sono intatti. Dendriti sono in rosa scuro e assone in bianco. I limiti di strato e regione sono state aggiunte all'inizio del video. Ricostruzione 3D da video di Georgia Economides-3D da Svenja Falk. Il video è stato registrato con un software di ricostruzione del neurone come indicato nel passo 2.17 e modificato con un software di editing video. Link al video:30. Per favore clicca qui per scaricare questo video.

Soluzioni utilizzateComposizione/istruzioni
Soluzione di fissazioneparaformaldeide al 4%, 0,2% saturi acido picrico soluzione, soluzione di glutaraldeide 0.025% in tampone fosfato 0,1 M (PB)
0,1 tampone fosfato M a pH 7,6Aggiungere 100 mL di brodo 1 M fosfato tampone a 900 mL di acqua distillata
Tampone fosfato salino (PBS) pH 7,4/7.5Aggiungere 10 mL di tampone fosfato 0.1M, 0,2 g di KCl e 8,76 g di NaCl a 990 mL di acqua distillata
Tampone TRIS pH 7.5Sciogliere 5,72 g di Tris cloridrato e 1,66 g di Tris Base in 50 mL di acqua distillata. Quindi apportare fino a 1 L con acqua distillata.
Soluzione fissante glutaraldeide e paraformaldeide tamponataparaformaldeide al 4%, 0,2% saturi acido picrico soluzione, soluzione di glutaraldeide 0.025% in tampone fosfato 0,1 M.
Soluzione di ABCSoluzione da effettuarsi almeno 30 min prima dell'uso del kit di ABC. Aggiungere 1 goccia di soluzione A e 1 goccia di soluzione B a 2,5 mL di PBS.
Resina epossidica di Durcupan:Fare 20 vasi: 20 g di componente A, 20 g di componente B, 0,6 g di componente C e 0,4 g di componente D -
Proteggere l'equilibrio da sversamenti accidentali di coprire la piastra con un cerchio di carta da filtro. Valutare attentamente i reagenti in un becher di tripour nelle proporzioni sopra indicato. Miscelare accuratamente agitando vigorosamente utilizzando due bastoni di legno per almeno 5 min. La miscela dovrebbe trasformarsi in un colore marrone scuro di densità uniforme. Porre il becher in forno a ~ 50 ° C per un massimo di 10 min per rimuovere come molte bolle di aria possibile. Nota: La resina inizia a curare se si lascia il bicchiere nel forno più di 10 min. decantare la resina in vasi di plastica o siringhe da 5 mL, datarle e riporre nel congelatore di-20 ° C pronto per l'uso.

Tabella 1: Tabella delle soluzioni. 

Discussione

Le registrazioni elettrofisiologiche in vitro (Figura 1 Ac,d e Bc, d) combinato con istochimiche e immunohistochemical le procedure consentono la morfologia dettagliata, il contenuto proteico di calcio associazione e identità di adulti interneuroni corticali registrata per essere rivelato. Nella regione CA2, questa tecnica ha permesso lo studio dei circuiti locali per la prima volta e ha rivelato le sottoclassi di interneuroni che precedentemente non erano stato descritto in CA1 o CA3: cellule di arbor ampio dentritici ed axonal Cestino (Figura 1B), le cellule bistratified e interneuroni SP-SR.

Il protocollo descritto qui è stato ottimizzato per preservare l'ultrastruttura dei neuroni e ottenere eccellente recupero di entrambi (tra cui delle spine dendritiche) e pergole assonale. Fasi critiche include l'uso della tecnica doppia fissazione per aumentare il contrasto per microscopia chiara26 e l'aggiunta di glutaraldeide e acido picrico soluzione alla soluzione fissante per migliorare la penetrazione dell'anticorpo e preservare il neuronale ultrastruttura27. Dolce gelo-disgelo permeabilizzazione dà migliore conservazione della struttura fine, mentre osmicate e resina incorporamento ridurre il restringimento del piano z28. Inoltre, la visualizzazione di strutture molto belle (belle ad esempio gli assoni con piccolo boutons) è migliorata incubando le sezioni con H2O2 e NaBH4 per ridurre la colorazione di fondo. Contrasto può essere aumentato anche con l'aggiunta di Burundi,2 per la reazione di HRP.

La procedura istologica dettagliata qui offre ottimi risultati in termini di riproducibilità e affidabilità. Tuttavia, la durata delle registrazioni elettrofisiologiche determinerà la qualità della colorazione, con brevi registrazioni connesse solitamente con scarsa colorazione axonal biocitina/fluorescenza. La scelta di registrazione protocolli (registrazioni intracellulari usando degli elettrodi affilati vs cellule intere patch di bloccaggio) può anche influenzare biocitina conservazione e preservazione dell'anatomia bene.

Mentre le difficoltà incontrate nel preservare la struttura fine durante la lavorazione istologiche descritte qui e il tempo necessario per ricostruire a 100 ingrandimenti (1-4 settimane a seconda della complessità dell'assone) sono apprezzate, questo metodo dà un rappresentazione accurata dei diametri dentritici ed axonal. L'uso di meno esigenti protocolli per rivelare l'etichettatura biocitina è comprensibile, tuttavia, questi spesso preclude visualizzazione chiara dei rami axonal bene. Detergenti, per favorire l'ingresso di avidina-HRP a rivelare la biocitina e anticorpi, sono spesso necessari in sezioni spesse, ma possono interferire con struttura fine. Neuroscienziati cerca costantemente per semiautomatiche metodi di ricostruzione, ma, per ora e per gli assoni soprattutto, biocitina-HRP con ricostruzione manuale rimane il gold standard31.

Altamente dettagliate ricostruzioni neuronale, soprattutto i disegni precisi dei boutons axonal e nodi, la presenza o assenza di mielina e più in generale, il disegno di arbor axonal completa, con la rappresentazione di assone-diametro preciso cambia lungo il lunghezza, fornire ulteriori informazioni per l'identificazione precisa di un tipo distinto di interneurone. Anche se molti interneuroni non rientrano esattamente in una determinata classe, la tecnica sopra descritta fornisce dati correlati sulle proprietà elettrofisiologiche neuronale, la plasticità a breve termine associato a un tipo specifico di connessione e dettagliate ricostruzioni di un neurone, permettendo lo schema elettrico, nella regione CA2, ad esempio, di essere studiato in dettaglio.

Struttura bella, dettagliata è spesso semplificata in modelli computazionali. Mentre è comprensibile, questo comporta la perdita delle informazioni che potrebbero rivelarsi fondamentale in futuro. Analisi di dettagliate ricostruzioni 3D con paralleli sinaptici dati permetterà l'aggiunta di ulteriori criteri di classificazione interneuronale. Dati possono essere depositati in archivi pubblici e utilizzati dai modellisti per esplorare il risultato dei cambiamenti sporadici di diametro dell'assone e myelination sulla propagazione del potenziale d'azione informaticamente.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questa ricerca ha ricevuto un finanziamento da Novartis Pharma (Basilea) e del Medical Research Council assegnato a Prof Alex Thomson, la biotecnologia e di Biological Sciences Research Council (BBSRC-BB/G008639/1), la società fisiologica, l'Unione europea Orizzonte 2020 programma quadro per la ricerca e l'innovazione sotto l'accordo di sovvenzione specifiche n ° 720270 (Human Brain Project SGA1) e sotto l'accordo di sovvenzione specifiche n ° 785907 (Human Brain Project SGA2). Siamo estremamente grati al Prof Alex Thomson per la configurazione del protocollo in altre regioni corticali, garantire il finanziamento e per il suo continuo sostegno per questo progetto. Contributi dei membri di laboratorio che hanno contribuito a ottimizzare il protocollo di recupero e ricostruito CA2 neuroni sono ringraziano: J. Deuchars, D. I. Hughes e H. Pawelzik, A. P. Bannister, K. Eastlake, H. Trigg, N. A. Botcher.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anticorpo dell'acido avidina-7-ammino-4-metilcumarina-3-acetico (Avidin-AMCA) - 20,8 mg/mL Laboratori vettorialiA2008
Biocitina  ≥ 98% (TLC)SigmaB4261
3,5 diaminobenzidina (DAB) compresse, Per preparare 5 mLSigmaD4293
Durcupan ASigma44611
Resina epossidica Durcupan BSigma44612
Resina epossidica Durcupan CSigma44613
Resina epossidica Durcupan DSigma44614
Etanolo, purizzato. p.a., assoluto, ≥ 99,8%Sigma32221
GelatinaSigma48723
Soluzione di glutaraldeide, grado I, 25 % in H2OSigmaG5882
Glicerolo, ≥ 99% SigmaG5516
Siero di capraSigmaG9023
Isotiocianato di fluoresceina anti-topo di capra (FITC)- 14,3 mg/mLSigmaF2653
Capra anti-coniglio Texas Red (TR)- 3,3 mg/mLInvitrogenT2767
Perossido di idrogeno, soluzione al 30%SigmaH-1009
Olio da immersione, viscosità 1.250 cSt (lett.)SigmaI0890
Cloruro di nichel (NiCl2 . 6H2O)Sigma N5756
Tetrossido di osmio, per microscopia elettronica, 4% in H2O Sigma75632
Paraformaldeide, grado reagente, cristallino SigmaP6148
Acido picrico, inumidito con acqua, ≥ 98%Sigma197378
Tampone fosfato 1 MSigmaP3619
Ossido di propilene (C3H6O), 99%Alfa Aesar 30765
Tetraidroborato di sodioVWR27885.134
SaccarosioFisher scientificS/8600/53
Trizma cloridrato, ≥ 99.0%SigmaT5941
Trizma base, ≥ 99,9%SigmaT6066
Vectashield Antifade Montaggio Medio, , indice di rifrazione 1,45 Vector laboratoriesH-1000
Vectastain Elite ABC HRP kitVector laboratoriesPK6100
Attrezzatura utilizzata 
VibratomeAgar Scientific
C4A Planchette in alluminio a coppa GA-MA & ASSOCIATI, INC.
Microscopio Leica DMR Leica Microsystems
X-Cite 120PC Q Sorgente luminosa a fluorescenzaExcelitas Technologies 
Fotocamera per microscopio digitale Leica DFC450 Leica Microsystems 
Penna da disegno tecnica Rapidograph 0,18 mm London graphics centre
pennino rapidograph da 0,18 mmLondon graphics centre
penna da disegno tecnico Rapidograph 0,25 mm grafico di Londra
Pennino rapidograph da 0,25 mmCentro
Sistema Neurolucida che include workstation PC, palco, telecamera e joystic per il controllo di scena XYZMicrobrighfield (MBF) Bioscience
Neurolucida versione software 2017Microbrighfield (MBF) Bioscience
CorelDRAW graphics Suite X5Corel
Software di editing video Adobe Premiere Pro
Fiale di vetro 14 mlFisher scientific 
di resina epossidica Centro grafico di Londra

Riferimenti

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