Method Article

Ottimizzazione del interferone-gamma ELISpot analisi di risposte a cellula T misura nel modello cavia dopo la vaccinazione

DOI:

10.3791/58595

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January 20th, 2019

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1Inovio Pharmaceuticals, Inc, 2Mycotic and Parasitic Agents and Mycobacteria, Robert Koch Institute

In This Article

Summary

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Lo sviluppo del test ELISpot interferone per la cavia PBMCs permette la caratterizzazione delle risposte delle cellule T in questo modello altamente rilevante per lo studio delle malattie infettive. Abbiamo applicato il test per misurare le risposte delle cellule T associate intradermica consegna di vaccini a DNA.

Abstract

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La cavia ha giocato un ruolo fondamentale come un piccolo modello animale rilevante nello sviluppo di vaccini per malattie infettive come la tubercolosi, influenza, difterite e febbri emorragiche virali. Abbiamo dimostrato che la distribuzione del vaccino di DNA del plasmide (pDNA) nella pelle suscita risposte umorali robuste nella cavia. Tuttavia, l'uso di questo animale a risposte immunitarie modello un po ' è stato limitato nel passato a causa della mancanza di reagenti disponibili e protocolli per studiare le risposte delle cellule T. Cellule T giocano un ruolo fondamentale nel immunoprophylactic sia meccanismi di immunoterapia. Capire le risposte delle cellule T è fondamentale per lo sviluppo di malattie infettive e vaccini di oncologia e accomodante consegna dispositivi. Qui descriviamo un'analisi enzima-collegata immunospot (ELISpot) di interferone-gamma (IFN-γ) per cavia cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs). Il test consente ai ricercatori di caratterizzare le risposte a cellula T vaccino specifico in questo importante modello di roditore. La capacità di cellule isolate da sangue periferico di analisi offre l'opportunità di tenere traccia di immunogenicità nei singoli animali.

Introduction

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Il protocollo descritto qui consente la rilevazione di interferone-gamma cellule secernenti (IFN-γ) dopo il richiamo di antigene in una popolazione di sangue periferico (PBMC) di cellule mononucleate raccolta dalle cavie di Hartley. Abbiamo applicato il test per caratterizzare la cinetica e le magnitudini delle risposte di cellule T antigene-specifiche per un regime di vaccinazione influenzale nella cavia. Crediamo che questo protocollo spingerà significativamente lo sviluppo pre-clinico di programmi di vaccinazione in questo modello animale altamente pertinente.

Le cellule di T suscitate da vaccini svolgono un ruolo essenziale nella protezione contro agenti infettivi e immunoterapia vie connesse con altre malattie. L'importanza delle cellule di T è stata evidenziata negli studi multipli di vaccino. Immunizzazione di furetti e topi con un DNA del plasmide (pDNA) codifica per H5 hemagglutinin e protezione fornita di neuraminidasi N1 da morbilità e mortalità in una sfida di virus influenzale in assenza di neutralizzazione degli anticorpi, che indica l'importanza di Di immunità delle cellule t1. Oltre a neutralizzare la risposta umorale, forte T-cellule svolgono un ruolo cruciale per non solo clearance virale2 ma anche la protezione dall'infezione con il virus respiratorio sinciziale (RSV) in topi3. In esseri umani, cellule T CD8 + pre-esistenti sono state associate con la severità di malattia in diminuzione durante la H1N1 pandemica 20094. Conta delle cellule CD4 + T insieme a certa concentrazione di citochina del plasma è correlati con la gravità della malattia in bambini con infezione da RSV5.

La cavia ha guadagnato la protuberanza come un modello di laboratorio per la ricerca e sviluppo in vari settori della medicina quali la sensibilizzazione cutanea, ricerca nutrizionale, studi del sistema uditivo e, più rilevanti per questo lavoro, le malattie infettive. Era cruciale per la scoperta dei vaccini contro la tubercolosi e la difterite. Più recentemente la cavia è utilizzata come un modello per Influenza6 e7di Ebola. Inoltre, possedendo fisiologiche somiglianze a pelle umana8, la cavia offre un modello animale piccolo accessibile per metodi di consegna della droga dermico. In contrasto con la sua importanza come un modello di laboratorio, la disponibilità di cavia specifici saggi e sonde per caratterizzare le risposte immunitarie rimane limitata9. Test cellulari di base quali l'IFN-γ enzimo-immunospot (ELISpot-saggio) che è usata ordinariamente in ricerca pre-clinica e clinica per enumerare le risposte delle cellule T non sono disponibili.

La prime analisi di fase solida enzimo-immunospot sono state usate per determinare il numero di cellule disecrezione specifiche in delle cellule di B-popolazione varia10,11. Il formato ha avanzato per rilevare cellule che secernono citochine compreso il-1, il-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, GM-CSF, TNF-alfa, TNF-beta, granzyme B e IFN-γ. Il test ELISpot possiede alta sensibilità; potenzialmente ogni cella di produzione di citochina può essere rilevato. Il limite di rilevazione per le analisi di ELISpot è stato segnalato per essere inferiore a 10 punti per ogni 100.000 PBMCs12. Recentemente un paio di anticorpo specifico di IFN-γ-cavia è stato effettuato disponibili13, e questo ha aperto la possibilità di colmare questa lacuna nel campo.

IFN-γ è considerato una molecola effettore importante nella risposta immunitaria adattativa; può essere prodotto e secreto dalle cellule sia CD4 e CD8 T al momento dell'attivazione. IFN-γ ha una vasta gamma di biologico funzioni nel contesto di una risposta immunitaria ad un'infezione di virus, come l'attivazione dei macrofagi e la up-regolazione del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) I e MHCII dell'espressione. Inoltre promuove la differenziazione delle cellule di B, inibisce la crescita delle cellule T-helper-2 e attiva le cellule di assassino naturali. IFN-γ blocca la replicazione virale in cellule somatiche infette e sopraregola espressione di molecole MHC. Così, la produzione di IFN-γ è un'indicazione molto importante della qualità della risposta delle cellule T a un vaccino o un agente patogeno.

Un aspetto importante di IFN-γ, il ELISpot qui presentato è l'uso di PBMCs anziché splenocytes13. PBMCs può essere ottenuto dalla lavorazione di un campione di sangue prelevato non terminale, considerando che la raccolta di splenocytes richiede euthanization animale prima della raccolta della milza. L'utilizzo di PBMCs consente risposte IFN-γ T-cellula essere monitorati nel corso di un periodo di tempo e la valutazione degli effetti sulle risposte delle cellule T come primo-boost regimi14.

Per i ricercatori che attualmente usano la cavia come modello animale, il metodo di IFN-γ ELISpot amplierà la gamma di dati scientifici che possono guadagnare. La disponibilità ora può ridurre la necessità di condurre studi con modelli animali meno rilevanti per la malattia di destinazione, che in precedenza sono stati scelti a causa della disponibilità di reagente per l'esame delle risposte cellulari. L'uso di PBMCs anziché milza o linfonodi consente esperimenti non terminale e monitoraggio continuo dei singoli animali.

Di seguito forniamo una descrizione dettagliata dei passaggi coinvolti nella rilevazione di una risposta cellulare di IFN-γ in cavie per pDNA vaccino. Abbiamo illustrato la nostra procedura di consegna specifica e descrivere il test ELISpot generale che comprende il prelievo di sangue, sangue elaborazione, vendemmia PBMC, procedura di dosaggio e analisi dei dati. Un disegno schematico del test ELISpot è raffigurato nella Figura 1.

Diagramma del flusso di lavoro di isolamento PBMC; raccolta del sangue, placcatura cellulare, stimolazione dell'antigene, risultati del test.
Figura 1 : Descrizione schematica della cavia protocollo ELISpot. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

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Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dalla cura degli animali e uso Comitato (ACUC) di Acculab.

Nota: Il protocollo richiede l'uso di materiali pericolosi potenziali. Consultare MSDS del produttore e indossare l'equipaggiamento adeguato (PPE) durante tutta la procedura.

1. preparare il sito di immunizzazione di cavia, Mantoux-iniezione intradermica e CELLECTRA-3P-EP-procedura

  1. Preparazione del sito di trattamento sulla cavia.
    1. Posizionare la cavia in un aula di induzione e anestetizzare al 5% Isoflurane-vapor.
    2. Eliminare l'animale dalla camera e mettere il cono di naso in posizione, fornendo 2% Isoflurane vapor per mantenere l'anestesia durante tutta la procedura.
    3. Radere la zona di circa 4 cm2 sul fianco addominale.
    4. Disinfettare la zona rasata con etanolo-tampone.
  2. Iniezione di procedura pDNA-formulazione ed elettroporazione.
    1. Utilizzare una siringa per insulina da iniettare 100 µ l formulazione nel derma mediante la tecnica di Mantoux. Viene inserito l'ago smusso fino ad un angolo di 10 gradi con il corpo dell'animale.
    2. Rimuovere l'ago e immediatamente inserire l'array di elettrodi CELLECTRA® - 3P di iniezione-wheal e applicare il campo elettrico.
    3. Rimuovere l'animale dall'anestesia e controllare il suo recupero.

2. Non-terminale sanguinare

  1. Raccolta di sangue dalla vena giugulare di cavia anestetizzato.
    1. Posizionare la cavia in un'aula di induzione e anestetizzare l'animale come descritto al punto 1.1.1
    2. Usando una siringa da 3 ml con ago 27 1/2 pollice, punteggiano la vena giugulare dell'animale anestetizzato e raccogliere 3 ml di sangue.
    3. Trasferire immediatamente il sangue in provetta K2EDTA, capovolgere la provetta diverse volte per mescolare il sangue con anticoagulante e posto sul ghiaccio.
      Nota: Evitare la coagulazione del sangue è cruciale per la riuscita elaborazione a valle del campione di sangue.
    4. Monitorare il recupero dell'animale.

3. trattamento del campione di sangue

  1. Separazione di PBMCs da sangue intero mediante centrifugazione su gradiente di densità
    1. Diluire 1:1 con Hank bilanciato sale soluzione (HBSS) di sangue.
      Nota: Per evitare la contaminazione di tutto il lavoro da qui in poi deve essere eseguita in un armadio di sicurezza biologica applicando una tecnica asettica.
    2. Strato diluito sangue gradualmente oltre 4,5 ml Ficoll-Paque Plus in un tubo 15 ml-conico. Evitare la dispersione dell'interfaccia. Nota: Per assicurare la corretta separazione, Ficoll-Paque deve essere a temperatura ambiente.
    3. Centrifugare le provette a rcf 800 per 30 min con freno fuori.
      Nota: come un'alternativa, tubi SepMate™ (STEMCELL Technologies) può essere utilizzata per la separazione di PBMC. Diluita in HBSS sangue è aggiunto ai 15 ml SepMate tubo riempito con 3,5 ml Ficoll-Paque Plus e poi centrifugato a 1200 rcf per 10 min (freno). Questa tecnica di centrifugazione su gradiente risparmiatrice di tempo provoca redditività pari, -rendimento delle celle e spot-formazione.
    4. Raccogliere strato Buffy-Coat e diluire in mezzo R10 (10% (v/v) calore-disattivata FBS e 1% (v/v) Pen/Strep in mezzo RPMI1640) per un volume totale di 15 ml.
    5. Pellet di cellule mediante centrifugazione a 450 rcf per 5 min.
    6. Lavare le cellule due volte con il mezzo di R10.
    7. Risospendere le cellule in 1 ml R10 e passare sospensione cellulare attraverso 70 µm cella-setaccio in un nuovo tubo.
    8. Contare le celle e determinare il numero di cellule vive di macchiatura blu di Trypan.
    9. Diluire le cellule con R10 medium ad una concentrazione di 1 x 10 ^ 6 cellule vive per millilitro.

4. preparazione del ELISpot-piastre e stimolazione di cellule

  1. Cappotto e blocco dei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti ELISpot PVDF-membrana prima della semina il PBMCs.
    1. Piastre devono essere pre-trattati per 60 secondi. Pre-trattamento dell'etanolo si tradurrà in meno non specifico posto-formazione e macchie con migliore definizione.
      Nota: Prestare particolare attenzione affinché la membrana completa entra in contatto con 15 µ l 35% etanolo.
    2. Dopo 60 secondi aggiungere 150 µ l 1X PBS per pozzetto e quindi svuotare pozzi invertendo le piastre.
      Nota: Il pre-trattamento di etanolo è molto sensibili al fattore tempo. Non Incubare la membrana di ben più di 60 sec. membrane non deve seccare durante i seguenti passaggi della procedura.
    3. Lavare le piastre tre volte con PBS di 1x 250 µ l per pozzetto.
    4. Cappotto con 100 µ l/pozzetto di 5 µ g/ml cattura anti-cavia dell'anticorpo di IFN-γ V-E4 in PBS.
    5. Incubare le piastre per almeno 12 ore a 4° C.
    6. Lavare le piastre, aggiungere 250 µ l/pozzetto PBS tre volte.
    7. Aggiungere 200 µ l/pozzetto tampone bloccante (10% (p/v) saccarosio e il 2% (p/v) BSA in PBS) e incubare per 2 ore a temperatura ambiente.
    8. Lavare tre volte le piastre con 250 µ l/pozzetto PBS.
  2. Piastra PBMCs con antigene-specifici peptidi, controlli positivi e negativi.
    1. Diluire la piscina di proteine-peptidi in R10 a concentrazione nel peptide finale desiderata.
    2. Analizzare il campione PBMCs in triplici copie.
      Nota: Aggiungere il terreno con gli stimolanti per le piastre di ELISpot prima e aggiungere in secondo luogo la sospensione PBMC.
    3. Aggiungere 50 µ l di terreno di peptide-R10 pozzetti indicati.
    4. Per il controllo negativo aggiungere 50 µ l formulazione di vuoto del peptide in R10 nei pozzetti indicati.
    5. Per controllo positivo aggiungere 5 µ g/ml della concanavalina A (ConA) nel mezzo di R10 nei pozzetti indicati.
    6. Aggiungere 100 µ l di sospensione cellulare PBMC in tutti i pozzetti
    7. Incubare le piastre in atmosfera umidificata di 5% CO2 a 37° c per 18 ore.
      Nota: Posto ELISpot piastre su un superficie/rack anche nell'incubatrice ed evitare qualsiasi perturbazione delle piastre durante il periodo di incubazione.

5. rilevazione dei punti positivi di interferone-gamma

  1. Incubazione con rilevazione dell'anticorpo e piastra di sviluppo.
    Nota: Per tutti i passaggi in questa sezione è necessaria una tecnica asettica.
    1. Rimuovere con attenzione le piastre da incubatrice e in modo sicuro svuotare pozzetti. Lavare le piastre, aggiungere 250 µ l/pozzetto PBS per tre volte.
    2. Aggiungere 100 µ l/pozzetto di 2 µ g/ml rilevamento cavia anti-IFN-γ anticorpo biotinilato N-G3 diluito in tampone bloccante.
      Nota: Soluzione di anticorpo filtro (22 µm) per ridurre di fondo.
    3. Incubare con l'anticorpo di rilevazione per 2 ore a temperatura ambiente.
    4. Scartare il surnatante e lavare piatti aggiungendo 250 µ l/pozzetto PBS tre volte.
    5. Aggiungere 100 µ l/pozzetto di fosfatasi alcalina (ALP)-streptavidina coniugata, diluito in tampone bloccante.
      Nota: Filtro (22 µm) soluzione per ridurre sfondo.
    6. Con ALP-streptavidina Coniugato Incubare 1 ora a temperatura ambiente.
    7. Eliminare la soluzione di ALP-streptavidina e lavare le piastre, aggiungere 250 µ l/pozzetto PBS due volte e rimuovere l'eccesso di PBS invertendo la piastra e macchiare e contro una salvietta di carta pulita.
    8. Lavare le piastre, aggiungere 250 µ l/pozzetto DI UltraPure acqua una volta e rimuovere l'acqua in eccesso invertendo la piastra e macchiare e contro una salvietta di carta pulita.
    9. Aggiungere 100 µ l di soluzione substrato BCIP/NBT (attenzione) in ciascun pozzetto. Attenzione: BCIP/NBT è altamente infiammabile e tossico se ingerito, a contatto con la pelle, o inalato. Prima dell'uso consultare la scheda di sicurezza.
    10. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce.
    11. Sciacquare la piastra 4 volte con acqua deionizzata. Capovolgere e toccare per rimuovere l'acqua in eccesso.
    12. Rimuovere il drenaggio in plastica dalla parte inferiore delle piastre di ELISpot e lasciate asciugare le piastre.
    13. Quantificare i punti manualmente o utilizzando un lettore di ELISpot automatizzato, ad esempio il lettore di piastra CTL-Immunospot S6.

Results

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I risultati presentati qui servono come riferimento per i risultati attesi a seguito dell'uso di questo protocollo, sottolineando l'importanza delle fasi cruciali e conferma i benefici di ottimizzazioni descritte.

Dopo la centrifugazione in gradiente di densità, come descritto al punto 3.1 del protocollo, il liquido viscoso rosso nella parte inferiore del tubo conterrà la maggior parte delle cellule del sangue rosso. Come illustrato nella Figura 2A, sopra i globuli rossi è uno strato di densità-medio. Tra uno strato di plasma chiaro o giallo sulla parte superiore e la densità gradiente medio è lo strato di buffy-coat marrone chiaro o bianco, che contiene la maggior parte dei globuli bianchi e piastrine. Incompleta separazione sarebbe manifestato come la presenza di globuli rossi in cima il mezzo del gradiente di densità. La colorazione rossa del plasma in Figura 2A è più probabilmente a causa di emolisi, come questo campione di sangue è stato memorizzato nel tubo di raccolta 1,5 h prima di essere elaborati. Figura 2 B viene illustrata la sfumatura prima (a sinistra) e dopo la centrifugazione (a destra) nel dispositivo di PBMC-isolamento. Campione di sangue in Figura 2B è stato elaborato con un ritardo minimo dopo la raccolta del sangue e la colorazione del plasma è giallo.

L'effetto di prebagnatura le membrane con etanolo (Vedi punto 4.1 del protocollo) su spot-sviluppo è illustrato nella Figura 3. Macchie nei pozzetti pre-trattati una migliore definizione del display, e c'è una riduzione del numero di punti nei pozzetti di controllo negativo medio/DMSO (Figura 3A). Tipica vitalità della cavia trasformato PBMCs varia circa 90% ed è simile per entrambi i regolari 15ml tubi e dispositivi di PBMC-isolamento (Figura 3B). Resa di cellule vitali da un campione di sangue di 3ml varia tipicamente tra 3 x 106 e 5 x 106.

Gli animali sono stati immunizzati con il plasmide DNA codificante la nucleoproteina (NP) del ceppo H1N1 dell'Influenza A/PuertoRico8. La figura 4 Mostra enumerazione delle risposte delle cellule T IFN-γ ha presentato come spot-formando unità (SFU) generato per tutta la durata di un regime di vaccinazione. Test ELISpot con PBMCs raccolte dai risultati di animali non immunizzati nei conteggi posto trascurabili (no tx). Quattordici giorni dopo la prima immunizzazione (primo), una media di 970 punti di IFN-γ per milioni PBMCs sono stati contati dopo stimolo immunogeno. Sette giorni dopo la seconda immunizzazione (boost), le risposte delle cellule T contro tutte e tre piscine sono state ampliate, raggiungendo una media di6 5020 SFUs/10 di IFN-γ PBMCs. quaranta-sei giorni dopo la seconda immunizzazione (memoria), un totale medio di IFN-γ 6310 SFUs/10 6 PBMCs sono stati contati nel sangue periferico.

LEGGENDE DI FIGURA:

Risultati del processo di centrifugazione; separazione del sangue in plasma, buffy coat; schema delle provette da centrifuga.
Figura 2 : Immagini rappresentative degli strati dopo la centrifugazione in gradiente di densità. Campione di sangue (A) prima (a sinistra) e dopo (a destra) centrifugazione in tubi regolari. Campione di sangue (B) prima (a sinistra) e dopo (a destra) centrifugazione in dispositivi di PBMC-isolamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati del test di vitalità cellulare; effetti di stimolazione peptidica; Immagini al microscopio e confronto tra grafici.
Figura 3 : Ottimizzazione del protocollo. (A) aspetto tipico dei punti positivi IFN-γ in una piastra di test ELISpot ben sviluppato secondo il protocollo. Pozzi triplici di esempio vengono mostrati dopo pre-trattamento con etanolo (a destra) o senza pre-trattamento (a sinistra). Le cellule sono state incubate con DMSO (in alto) come controllo no-stimolo, pernottamento pari antigene peptidi (medio), o il mitogene ConA (in basso). PBMCs ha provenuto dallo stesso animale individuale. Pozzi erano imaged utilizzando un piastra-scanner automatico. (B) confronto dei tubi di pendenza di densità diversi sulle cellule trasformate. 3 mL di campioni di sangue da 3 cavie individuali sono stati raccolti. 1,5 mL di ogni campione sono stati elaborati utilizzando tubi regolari (medio gradiente di densità) o dispositivi di PBMC-isolamento. Vitalità (sinistra, % ± SEM) e numero di cellule vive (bene, x 106 ± SEM) sono stati determinati utilizzando una cella automatica contando sistema e test di esclusione del blu di trypan. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Grafico a barre; risultati PBMC ELISPOT; SFU vs trattamento; piscine NP con codice colore; Analisi della risposta immunitaria.
Figura 4 : Rilevazione delle robuste risposte immunitarie cellulari nel corso di un regime di vaccinazione. Nei giorni 1 e 15, 30 µ g di pDNA codifica nucleoproteina di influenza A (NP) è stata consegnata intra-epidermicamente addominale fianco delle cavie di Hartley, immediatamente seguita da pelle-elettroporazione. IFN-γ ELISpot risposta è stata misurata 14 giorni dopo la prima immunizzazione (primo) e 7 giorni (boost) e 46 giorni (memoria) dopo la seconda immunizzazione. Media SFUs + SEM sono state tracciate per 5 cavie trattati e non trattati 2 porcellini d'India (no tx). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

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La cavia è un prezioso modello animale per lo sviluppo pre-clinico di vaccini e strategie di consegna intradermica. Il protocollo di cui sopra descrive la metodologia per misurare le risposte di cellule T antigene-specifiche in questo modello altamente pertinente. Il dosaggio fornisce un'enumerazione chiara di periferico T-cellule che producono interferone-gamma dopo stimolazione con peptidi di antigene-specifiche. La cinetica della risposta immunitaria può essere monitorata da prelievo di sangue non terminale.

Abbiamo ottimizzato il protocollo e identificato gli aspetti critici per ottenere risultati ottimali, usando questa analisi. Ad esempio, la formazione di coaguli di sangue nel tubo di raccolta si tradurrà in vitalità e non ottimale recupero PBMC. Cavia sangue coagula rapidamente18. È fondamentale eseguire rapidamente il tiraggio del sangue. Au-Birck et al. fornire una guida completa per spurgo tecniche nella cavia modello16. Poiché la raccolta di sangue richiede l'anestesia generale, si raccomanda di rivedere applicabili procedure operative standard di questo aspetto del procedimento19. Insufficientemente anestetizzati cavie reagirà spostando le loro gambe o vocalizzazione dopo un breve pizzico del tessuto tra le dita dei piedi con le unghie o batter ciglio le loro orecchie e spostando che loro baffi avanti dopo pizzicare loro orecchio. L'immediato trasferimento del sangue in una provetta con anticoagulante e mescolare accuratamente di rotolamento o invertendo il tubo più volte è un passo essenziale in questo protocollo. Per il protocollo descritto qui provette EDTA sono state usate, e non altri anticoagulanti sono stati testati. Siete pregati di notare che l'EDTA è ipertonica, tubi idealmente dovrebbero essere riempiti più di mezzo pieno e pertanto la dimensione di tubo appropriato per il volume del campione deve essere utilizzato.

Se eseguita correttamente, centrifugazione in gradiente di densità provoca costantemente pulito preparazione di PBMC. Il mezzo di pendenza di densità deve essere a temperatura ambiente quando il gradiente prima centrifugazione di stratificazione e freni non devono essere utilizzati per l'arresto della centrifuga quando si utilizzano tubi regolari. Un miglioramento significativo in termini di praticità di PBMC-trattamento era la combinazione di centrifugazione in gradiente di densità con dispositivi di PBMC-isolamento. Questo permette una riduzione del tempo di centrifugazione. Centrifugazione in gradiente di densità in dispositivi di PBMC-isolamento e tubi normali risultati simili attuabilità, cellule vive conteggi di PBMCs trasformati e la formazione di spot. Indipendentemente dal tipo di tubo usato per la separazione, il raccolto di buffy-coat deve seguire immediatamente. Nel corso di un periodo di tempo prolungato contatto con il mezzo del gradiente di densità è citotossico per i PBMCs.

Conteggio preciso delle PBMC praticabile è importante il numero costantemente uguale seme delle cellule ai pozzetti della piastra. Qualche metodo di live/dead discriminazione deve essere applicato. Nel nostro laboratorio, usiamo il test di esclusione del trypan blu e un contatore di cellule automatizzato.

Punto qualità, definiti come punti di contrastati sharp-edged e alte, si tradurrà in una migliore precisione e contando spot coerente, soprattutto quando si utilizza un sistema di conteggio automatico. In linea con le raccomandazioni del produttore, abbiamo osservato il pre-trattamenti etanolo delle piastre ELISpot per essere un punto cruciale per ridurre il numero dei punti di fondo e migliorare la definizione dei punti. Si consiglia vivamente l'uso di un lettore di piastra per il test ELISpot-piastre alla fine del protocollo di immagine. Immagini originali di ciascun pozzetto possono essere facilmente ed efficientemente acquisiti e memorizzati. Utilizzando un software di analisi di immagine immagini digitali permettono anche per analisi obiettiva e conteggio posto rispetto al conteggio manuale di singoli operatori.

Una necessità assoluta per lo sviluppo del test descritto qui è stata la generazione di un'adatta cavia anti-coppia di anticorpo di interferone-gamma. Anticorpi monoclonali di topo V-E4 e N-G3 sono stati sviluppati da ibridomi-tecnica con cloni di linfociti dai topi che sono stati immunizzati con cavia ricombinante interferone gamma20. V-E4, che è dell'isotipo IgG1, e N-G3, ovvero IgG2a, sono segnalati per associare entrambi all'antigene ricombinante e nativo. Assegnazione di V-E4 come l'anticorpo di cattura e biotinilati N-G3 come l'anticorpo di rilevazione ha provocato ad alta sensibilità per la proteina ricombinante sia nativa mantenendo basso fondo segnale in un formato di sandwich ELISA. Entrambi gli anticorpi sono disponibili alla comunità scientifica attraverso un accordo di produzione ha condotto dal laboratorio del Dr. Hubert Schaefer, che è co-autore di questa pubblicazione. Le richieste saranno ricevute dal laboratorio del Dr. Schaefer e quindi prodotto da un partner commerciale.

Interferone-gamma è segnalata per essere instabile in regolari Buffer o media21. Schaefer et al.20 segnalato solo una moderata diminuzione del tasso di recupero quando usando degradata IFN-y, che aveva perso la funzionalità biologica, in un formato di ELISA utilizzando anticorpi V-E4 e N-G3. Tuttavia, aumentando il tempo di incubazione di stimolazione del peptide di PBMCs oltre 18 h dovrebbe essere attentamente verificato.

I vantaggi dell'utilizzo di PBMCs è stato discusso. Tuttavia, il dosaggio descritto qui riflette solo risposte antigene-specifiche delle T-cellule nella periferia di circolazione. Tessuto-infiltrazione T-cellule o cellule isolate da organi linfatici, quali milza e linfonodi, possono presentare diverse proprietà22,23,24. Dopo il confronto di punti di interferone-gamma da PBMCs e splenocytes dalle cavie che sono stati immunizzati con il vaccino di stessa influenza pNP14sono state osservate differenze significative in risposte cellulari.

In questo protocollo, abbiamo descritto una procedura di vaccinazione intradermica. Una logica principale per l'immunizzazione di ID di destinazione è l'alta densità di cellule dendritiche presenti nella pelle25. Noi ed altri abbiamo indicato che queste cellule possono specificamente essere mirate, adattando il metodo di consegna26, formulazione27o droga-design28. Le cellule presentanti l'antigene professionale attivate possono migrare ad un linfonodo drenante e attivare il sistema immunitario adattivo29,30,31,32. Le cellule dendritiche sono antigene essenziale cellula-tipo di presentazione per l'innesco produttivo le risposte immunitarie cellulari.

Per questo studio, gli animali sono stati immunizzati con il plasmide DNA codificante la nucleoproteina di influenza H1N1 ceppo A/PuertoRico/8. Consegna della pelle di questo vaccino pDNA (pNP) in combinazione con elettroporazione aveva dimostrato di suscitare le risposte umorali antigene-specifica in cavie33, furetti e primati non umani (NHPs)1,34. Inoltre, questo vaccino ha suscitato robuste risposte a cellula T in topi dopo la consegna nell'epidermide35, che potrebbe essere attribuito al CD4 e CD8 T-cellule stimolando con peptidi che rappresentano epitopi specifici per queste popolazioni cellulari. Il vaccino pNP era anche immunogenico dopo la consegna della mucosa, come dimostrato dalla generazione di risposte umorali in conigli e porcellini d'India, come pure le risposte cellulari e umorali in topi36. Più di recente, il nostro gruppo era in grado di dimostrare la generazione delle risposte IFN-γT-cellula nel coniglio dopo la consegna intra-muscolare (dati non pubblicati).

Attualmente, le macchie di interferone-gamma osservate nella cavia ELISpot non possono essere allocate a un sottoinsieme di CD4 + o CD8 + T-cell. Soprattutto per la progettazione e lo sviluppo di terapie immunitarie della pelle di targeting, sarebbe molto utile per determinare se le frequenze osservate interferone-gamma sono causate da espansione di un particolare sottoinsieme o una risposta equilibrata di entrambi al fine di valutare l'efficacia della vaccinazione per innescare cross-presentazione. Questa limitazione potrebbe essere superata da negativo ordinamento delle cellule CD4 o CD8 prima della semina le cellule sulla piastra o di identificazione di MHC di classe II (per risposte CD4) o MHC di classe I (per risposte CD8) limitato epitopi.

Il dosaggio di interferone-gamma ELISpot descritto qui utilizzando cavia PBMCs risponde alla necessità di valutare il corso delle risposte cellulari nel modello di laboratorio di cavia. Consente di perfezionare lo sviluppo di vaccini e protocolli di recapito di pelle. Noi crediamo che permette per l'occupazione di questo rilevante modello animale per studiare le malattie con importanti componenti di cellula T come TB37, Ebola38, HSV39e altri. Ridurrà l'utilizzo di modelli animali meno rilevanti.

Disclosures

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Gli autori Katherine Schultheis, Holly M. Pugh, Bryan S. Yung, Janet Oh, Holly M. Pugh, Jacklyn Nguyen, Laurent Humeau, Kate E. Broderick e Trevor R.F. Smithare dipendenti di Inovio Pharmaceuticals e ricevere come tale stipendio e benefici, compreso la proprietà di magazzino e stock option, da parte della società.

Acknowledgements

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Vorremmo ringraziare i membri del Inovio Pharmaceuticals R & D Dipartimento per l'assistenza tecnica e personale di Acculab per fornire un servizio di eccellenza allevamento. In particolare vorremmo ringraziare Alysha Vu e Joe Agnes per correzione di bozze del manoscritto. Questo lavoro non è stato finanziato da qualsiasi sovvenzione specifiche agenzie di finanziamento nel settore pubblico, commerciale, o non-profit.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cellectra-3PInovio PharmaceuticalsID-Electroporatio device/ non commerciale, R& Provetta
per prelievo di sangue K2EDTABD367844
Hank' s Soluzione salina bilanciataGibco 14175-079
Ficoll-Paque PlusGE Healthacre mezzo di gradiente di densità17144003
Tubo SepMateSTEMCELL Technologies85415Dispositivo di isolamento PMBC
RPM Thermo Fisher11875-135
FBS termodisattivato VWR97068-085
Pen/Strep Gibco 15140-122
  β-mercaptoetanoloGibco 21985-023
Membrana in PVDF ELISpot a 96 pozzetti MilliporeMSIPS4W10Piastra per saggi ELISpot
Etanolo Sigma459844-1L
UPDIInvitrogen10977-015Acqua DI ultrapura
SaccarosioSigmaS7903
Albumina sierica bovinaSigmaA7906
10x PBSHyCloneSH30378.03
Concanavalina A (ConA) SigmaC5275-5MG
streptavidina coniugata con fosfatasi alcalina (ALP) R& D Systems Inc.SEL002
BCIP/NBT R& D Systems Inc.SEL002
cattura l'anticorpo IFN-γ anticorpo V-E4GenScriptOrder #:U5472CE080-3LOT # A217071153
rilevamento biotinilato IFN-γ anticorpo N-G3 Ordine GenScript#:U5472CE080-1LOT # A21700598
Micro analizzatore CTL S6ImmunoSpot#S6MIC12lettore di piastre ELISpot automatizzato
Vi-CELL XRBeckman-Coulter731050contatore cellulare automatizzato
ImmunoSpot 5.1Software di analisi delsaggio
ESCO Classe II Tipo A2ESCOArmadio di biosicurezza
Filtro per celle FalconCorning, Inc.VWR cat # 21008-952
Exel Comfort Point Siringa da insulinaMedLab Supply 26028
Rotanta 460RHettichcentrifuga
Vi-CELL XR Kit di reagenti Quad PakBeckman Coulter383722
Incu SafePanasonic-Healthcareincubatore
22 &; m FiltroThermoScientific Legge VWR # 597-452022 & micro; m Filtro
KimWipesKimberly-Clark Professional VWR cat# 21903-005 asciugamani di carta
ImmunoSpot

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Laddy, D. J., et al. Heterosubtypic protection against pathogenic human and avian influenza viruses via in vivo electroporation of synthetic consensus DNA antigens. PloS One. 3 (6), 2517(2008).
  2. Lee, J. Y., Chang, J. Recombinant baculovirus-based vaccine expressing M2 protein induces protective CD8+ T-cell immunity against respiratory syncytial virus infection. Journal of Microbiology. 55 (11), 900-908 (2017).
  3. Kinnear, E., et al. Airway T cells protect against RSV infection in the absence of antibody. Mucosal Immunology. , (2017).
  4. Sridhar, S., et al. Cellular immune correlates of protection against symptomatic pandemic influenza. Nature Medicine. 19 (10), 1305-1312 (2013).
  5. Brand, H. K., et al. CD4+ T-cell counts and interleukin-8 and CCL-5 plasma concentrations discriminate disease severity in children with RSV infection. Pediatric Research. 73 (2), 187-193 (2013).
  6. Bouvier, N. M. Animal models for influenza virus transmission studies: a historical perspective. Current Opinion in Virology. 13, 101-108 (2015).
  7. St Claire, M. C., Ragland, D. R., Bollinger, L., Jahrling, P. B. Animal Models of Ebolavirus Infection. Comparative Medicine. 67 (3), 253-262 (2017).
  8. Todo, H. Transdermal Permeation of Drugs in Various Animal Species. Pharmaceutics. 9 (3), 33(2017).
  9. Schafer, H., Burger, R. Tools for cellular immunology and vaccine research the in the guinea pig: monoclonal antibodies to cell surface antigens and cell lines. Vaccine. 30 (40), 5804-5811 (2012).
  10. Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 109-121 (1983).
  11. Sedgwick, J. D., Holt, P. G. A solid-phase immunoenzymatic technique for the enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 57 (1-3), 301-309 (1983).
  12. Moodie, Z., et al. Response definition criteria for ELISPOT assays revisited. Cancer Immunology, Immunotherapy. 59 (10), 1489-1501 (2010).
  13. Gillis, P. A., et al. Development of a novel, guinea pig-specific IFN-gamma ELISPOT assay and characterization of guinea pig cytomegalovirus GP83-specific cellular immune responses following immunization with a modified vaccinia virus Ankara (MVA)-vectored GP83 vaccine. Vaccine. 32 (31), 3963-3970 (2014).
  14. Schultheis, K., et al. Characterization of guinea pig T cell responses elicited after EP-assisted delivery of DNA vaccines to the skin. Vaccine. 35 (1), 61-70 (2017).
  15. Mantoux Tuberculin Skin Test DVD Facilitator Guide - CDC (Part One). , Available from: https://www.cdc.gov/tb/education/Mantoux/images/mantoux.pdf (2013).
  16. Birck, M. M., Tveden-Nyborg, P., Lindblad, M. M., Lykkesfeldt, J. Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs. Journal of Visualized Experiments. (92), e51982(2014).
  17. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2014).
  18. Lewis, J. H. Comparative hematology: studies on guinea-pigs (Cavia porcellus). Comparative Biochemistry and Physiology: Comparative Physiology. 102 (3), 507-512 (1992).
  19. Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia (Fourth Edition). Flecknell, P. , Academic Press. 77-108 (2016).
  20. Schaefer, H., Kliem, G., Kropp, B., Burger, R. Monoclonal antibodies to guinea pig interferon-gamma: tools for cytokine detection and neutralization. Journal of Immunological Methods. 328 (1-2), 106-117 (2007).
  21. Lipiainen, T., et al. Formulation and stability of cytokine therapeutics. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (2), 307-326 (2015).
  22. Wang, X. Z., et al. Virus-Specific CD8 T Cells in Peripheral Tissues Are More Resistant to Apoptosis Than Those in Lymphoid Organs. Immunity. 18 (5), 631-642 (2003).
  23. Veron, P., et al. Deep Sequencing of T Cell Receptor in Peripheral Blood and Muscle from Adeno-Associated Virus Vector-Injected Subjects Reveals Differences in T Cell Clonality Between the Two Compartments. Molecular Therapy. 23, 210(2015).
  24. Sckisel, G. D., et al. Differential phenotypes of memory CD4 and CD8 T cells in the spleen and peripheral tissues following immunostimulatory therapy. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5 (1), 33(2017).
  25. Yanofsky, V. R., Mitsui, H., Felsen, D., Carucci, J. A. Understanding Dendritic Cells and Their Role in Cutaneous Carcinoma and Cancer Immunotherapy. Clinical and Developmental Immunology. 2013, 624123(2013).
  26. Amante, D. H., et al. Direct Transfection of Dendritic Cells in the Epidermis After Plasmid Delivery Enhanced by Surface Electroporation. Human Gene Therapy Methods. 25 (6), 315-316 (2014).
  27. Mahe, B., et al. Nanoparticle-based targeting of vaccine compounds to skin antigen-presenting cells by hair follicles and their transport in mice. Journal of Investigative Dermatology. 129 (5), 1156-1164 (2009).
  28. Vandermeulen, G., et al. Skin-specific promoters for genetic immunisation by DNA electroporation. Vaccine. 27 (32), 4272-4277 (2009).
  29. Brave, A., Nystrom, S., Roos, A. K., Applequist, S. E. Plasmid DNA vaccination using skin electroporation promotes poly-functional CD4 T-cell responses. Immunology and Cell Biology. 89 (3), 492-496 (2011).
  30. Romani, N., et al. Targeting skin dendritic cells to improve intradermal vaccination. Current Topics in Microbiology and Immunology. 351, 113-138 (2012).
  31. Smith, T. R., et al. DNA vaccination strategy targets epidermal dendritic cells, initiating their migration and induction of a host immune response. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 1, 14054(2014).
  32. Teunissen, M. B., Haniffa, M., Collin, M. P. Insight into the immunobiology of human skin and functional specialization of skin dendritic cell subsets to innovate intradermal vaccination design. Current Topics in Microbiology and Immunology. 351, 25-76 (2012).
  33. Lin, F., et al. A novel prototype device for electroporation-enhanced DNA vaccine delivery simultaneously to both skin and muscle. Vaccine. 29 (39), 6771-6780 (2011).
  34. Laddy, D. J., et al. Electroporation of synthetic DNA antigens offers protection in nonhuman primates challenged with highly pathogenic avian influenza virus. Journal of Virology. 83 (9), 4624-4630 (2009).
  35. Lin, F., et al. Optimization of Electroporation-Enhanced Intradermal Delivery of DNA Vaccine Using a Minimally Invasive Surface Device. Human Gene Therapy Methods. 23 (3), 157-168 (2012).
  36. Kichaev, G., et al. Electroporation mediated DNA vaccination directly to a mucosal surface results in improved immune responses. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (10), 2041-2048 (2013).
  37. Klunner, T., Bartels, T., Vordermeier, M., Burger, R., Schafer, H. Immune reactions of CD4- and CD8-positive T cell subpopulations in spleen and lymph nodes of guinea pigs after vaccination with Bacillus Calmette Guerin. Vaccine. 19 (15-16), 1968-1977 (2001).
  38. Shedlock, D. J., et al. Induction of Broad Cytotoxic T Cells by Protective DNA Vaccination Against Marburg and Ebola. Molecular Therapy. 21 (7), 1432-1444 (2013).
  39. Hensel, M. T., et al. Prophylactic Herpes Simplex Virus 2 (HSV-2) Vaccines Adjuvanted with Stable Emulsion and Toll-Like Receptor 9 Agonist Induce a Robust HSV-2-Specific Cell-Mediated Immune Response, Protect against Symptomatic Disease, and Reduce the Latent Viral Reservoir. Journal of Virology. 91 (9), 02257(2017).

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