Articolo metodologico

Stima del numero di Nephron in rene intero utilizzando il metodo di macerazione acida

DOI:

10.3791/58599

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22 maggio 2019

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1Department of Pharmacology and Toxicology, The University of Mississippi Medical Center, 2Department of Medicine, Division of Nephrology, Rush University Medical Center, 3Department of Medicine, Division of Nephrology, The University of Mississippi Medical Center, 4Department of Neurology, The University of Mississippi Medical Center

In questo articolo

Sommario

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Le stime del numero di nefrone rene intero sono importanti clinicamente e sperimentalmente, in quanto vi è un'associazione inversa tra il numero di nefrone e un aumentato rischio di malattie renali e cardiovascolari. Qui è dimostrato l'uso del metodo di macerazione acida, che fornisce stime rapide e affidabili del numero di nefrone renale intero.

Abstract

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L'investitura di nephron si riferisce al numero totale di nefroni a cui è nato un individuo, poiché la nefrogenesi nell'uomo è completata da 36 settimane di gestazione e non si formano nuovi nefroni dopo la nascita. Il numero di nephron si riferisce al numero totale di nefroni misurati in qualsiasi momento post-parto. Sia i fattori genetici che quelli ambientali influenzano sia il numero che l'investitura dei nevi. Comprendere come i geni o i fattori specifici influenzano il processo di perdita o scomparsa di nefrogenesi e di nefrone è importante in quanto gli individui con una dotazione o un numero di nefrone inferiore sono pensati per essere ad un rischio maggiore di sviluppare malattie renali o cardiovascolari. Comprendere come le esposizioni ambientali nel corso della vita di una persona influisce sul numero di nefrone sarà anche vitale per determinare il rischio di malattia futuro. Pertanto, la capacità di valutare in modo rapido e affidabile il numero di nefratti renali interi è un requisito sperimentale di base per comprendere meglio i meccanismi che contribuiscono o promuovono la perdita di nefrogenesi o di nefrone. Qui, descriviamo il metodo di macerazione acida per la stima del numero di nefrone renale intero in base alla procedura descritta da Damadian, Shawayri e Bricker, con lievi modifiche. Il metodo di macerazione acida fornisce stime rapide e affidabili del numero di nefratti (valutati dal conteggio dei glomeruli) che sono entro il 5% di quelli determinati utilizzando metodi più avanzati, seppur costosi, come l'imaging a risonanza magnetica. Inoltre, il metodo di macerazione acida è un ottimo metodo ad alto rendimento per valutare il numero di nefrini in un gran quantità di campioni o condizioni sperimentali.

Introduzione

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Il nefrone è sia la struttura di base che l'unità funzionale del rene1. Strutturalmente, il nefrone è costituito dal glomerulo (capillari e podociti) che si trova all'interno della capsula del Bowman e del tubulo renale, costituito dal tubulo prossimale, dal loop di Henle e dal tubulo distale che termina nel condotto di raccolta. Funzionalmente, il ruolo del nefrone è la filtrazione e il riassorbimento di acqua ed elettroliti e la secrezione di rifiuti. In generale, la nefrogenesi è completata a 36 settimane di gestazione negli esseri umani e poco dopo la nascita in diverse specie come il topo e il ratto2. L'investitura di nefrone si riferisce al numero totale di nefroni con cui è nato un individuo, mentre il numero di nevi è il numero totale di nefroni misurati in qualsiasi momento dopo la nascita3. Il termine numero di nefrone e il numero glomerulare sono spesso usati in modo intercambiabile. Poiché c'è solo un glomerulo per nefrone, la valutazione del numero di glomeruli è un surrogato importante per stimare il numero di nefrone.

La valutazione della dotazione di nefrone e del numero di nefrone è di interesse clinico, in quanto gli studi hanno dimostrato un'associazione tra la dotazione di nefrone e i numeri di nefrone ridotti con un aumento dell'incidenza di malattie cardiovascolari4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15. sulla base dei risultati nei reni all'autopsia, Brenner ha osservato che gli individui ipertesi presentavano un numero totale inferiore di nefroni rispetto agli individui normotensivi16. Così, Brenner ipotizzò che vi è una relazione inversa tra il numero di nefrone e il rischio di sviluppare ipertensione più tardi nella vita. Brenner ipotizzò anche che una riduzione del numero dei nefroni fosse compensata dai nefroni rimasti. Al fine di mantenere il normale tasso di filtrazione nel rene, i nefroni residui compensano aumentando la loro superficie glomerulare (ipertrofia glomerulare), lavorando così per mitigare qualsiasi effetto avverso della perdita di nefrone sulla funzione renale4 ,16.

Mentre protettivo nell'ipertrofia glomerulare a breve termine, a lungo termine, porta ad un aumento della ritenzione di sodio e liquidi, un aumento del volume del fluido extracellulare e aumenti della pressione arteriosa, portando a un circolo vizioso di ulteriori aumenti in pressione capillare glomerulare, iperfiltrazione glomerulare e cicatrizzazione del nefrone (sclerosi) e lesione4,16.

Ottenere stime o conteggi di numero di nefrone offre un paio di vantaggi sperimentali: 1) fornisce informazioni sul processo di nefrogenesi, che può quindi essere collegato a specifici geni o fattori nell'embrione o nell'ambiente materno-fetale, e 2) C'è un'associazione di numero di nefrone con malattia cardiovascolare e, quindi, c'è il potenziale che le stime del numero di nefrone potrebbero essere utilizzate per predire il rischio cardiovascolare futuro2,17,18, 19 anni di , 20 il , 21 anni di , 22. oltre all'ambiente materno-fetale, diverse malattie influenzano direttamente il numero di nevi e la funzione renale, tra cui l'aterosclerosi, il diabete, l'ipertensione e anche l'invecchiamento normale2,9, 10,11,12,22,23. Pertanto, la valutazione del numero di nefrone del rene intero è importante per comprendere sia i fattori genetici che quelli ambientali che influenzano la nefrogenesi (valea dire, l'investitura del nefrone) e il numero di nefrone nel corso della vita di una persona e gli effetti risultanti sulla funzionalità renale e sulla salute cardiovascolare.

Attualmente, ci sono diversi metodi disponibili per la determinazione e la quantificazione del numero di nefrone, ciascuno con i propri vantaggi e limitazioni24,25,26,27,28 ,29,30. Metodi sofisticati per determinare il numero di nefratti renali interi includono metodi stereologici, come il metodo dissettore/frazionata e risonanza magnetica25,26. Spesso considerato il gold-standard per la determinazione del numero di nefrone rene intero, il metodo dissector/fratore è sia costoso e dispendioso in termini di tempo. I recenti progressi e il miglioramento dell'imaging e della lavorazione a risonanza magnetica hanno fornito gli strumenti per contare singolarmente ogni nefrone. Tuttavia, l'imaging a risonanza magnetica non è solo dispendioso in termini di tempo, ma anche estremamente costoso. Inoltre, sia il metodo dissettore/fratore che la risonanza magnetica richiedono competenze tecniche avanzate, limitando così l'uso di tali metodi nella maggior parte dei laboratori di ricerca.

La maggior parte dei metodi per determinare il numero di nefrone fa conteggi o stime in base all'identificazione dei glomeruli, in quanto sono facilmente identificabili strutturalmente. In questo documento, il metodo di macerazione acida per stimare il numero di nefrone in rene intero è descritto e dimostrato27. Il metodo di macerazione acida è veloce, affidabile e significativamente meno costoso rispetto ad altri metodi, come il metodo del dissettore/fratore e l'imaging a risonanza magnetica. Inoltre, il metodo di macerazione acida fornisce stime altamente ripetibili del numero di nevi che sono stati segnalati all'interno della gamma di quelli determinati utilizzando la risonanza magnetica Imaging26.

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Protocollo

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Le forniture e i reagenti elencati di seguito sono per la determinazione del numero di nefrone renale intero in un topo, cioè due reni. Le modifiche per l'uso del metodo di macerazione acida per ratto sono identificate con asterischi. Tutti i protocolli sperimentali sono conformi alla guida nazionale degli istituti di salute per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università del Mississippi Medical Center.

1. procedura di isolamento dei reni

  1. Pesare il topo (o altre specie) ed eutanizzare con un isoflurano (5%-8%) sovradosaggio o pentobarbital (150 mg/kg di iniezione intraperitoneale).
  2. Una volta che il mouse è eutanizzato, aprire la sua cavità addominale utilizzando forbici chirurgiche sottili lungo la linea mediana.
  3. Sollevare con cautela l'intestino e l'adiposo riproduttivo sul lato destro della cavità addominale. Per dissezione lorda, isolare il rene sinistro. Utilizzando forbici chirurgiche fini, tagliare l'arteria renale sinistra e la vena e rimuovere con cautela il rene sinistro, mettendo il rene in un opportunamente etichettato (numero del mouse/identificatore) barca di pesatura contenente fosforo-tamponata Salina (PBS).
  4. Ripetere la procedura per il rene destro.
  5. Rimuovere ogni rene dalla rispettiva barca di pesatura e posizionarlo su una garza chirurgica pre-inumidito con PBS.
  6. Lasciando il rene sulla garza chirurgica, rimuovere rapidamente qualsiasi tessuto non renale aderente (come adiposo perirenale o ghiandola surrenale) seguita dalla rimozione della capsula renale. Pesare ogni rene singolarmente, registrando il peso del rene sinistro e destro separatamente in un taccuino di laboratorio.

2. procedure di omogeneizzazione, incubazione e straining

  1. Una volta che ogni rene viene pesato, drenare ogni barca di pesatura di PBS e riportare i reni nella barca di pesatura opportunamente etichettata. Usando una lama di rasoio pulita, tagliare il rene a metà, longitudinalmente. Posizionare ogni mezzo rene rivolto verso il basso e tagliare ogni metà in pezzi di 2 mm o più piccoli.
  2. Utilizzando lo stesso Razorblade, raccogliere accuratamente e posizionare i pezzi di rene tritati in un etichettato 15-mL tubo conico (mouse numero/identificatore; sinistra contro rene destro).
  3. Ripetere la procedura per il rene opposto, utilizzando una nuova lama di rasoio. Posizionare il rene tritato in un tubo conico da 15 mL con etichetta separata.
  4. In un cappuccio di fumi ben ventilato, aggiungere 5 mL di acido cloridrico 6 M (HCl) ad ogni tubo conico da 15 mL.
  5. Sostituire il tappo al tubo conico, agitare delicatamente la miscela rene/HCl e posizionare il tubo conico da 15 mL in un bagno d'acqua preriscaldato a 37 ° c per 90 min (* 120 min per i reni del ratto).
  6. Agitare brevemente ogni tubo da 15 mL ogni 15 minuti durante l'incubazione per garantire che tutti i tessuti siano esposti all'acido HCl.
  7. Inserire un ago da 18 G in una siringa da 5 mL (* siringa da 10 mL per ratto) e rimuovere con cautela lo stantuffo della siringa. Collocare la siringa in un tubo conico da 50 mL (tubo #1) in una cappa di aspirazione.
  8. Rimuovere la soluzione di rene/HCl dal bagno d'acqua e versare la soluzione tissutale nell'estremità aperta della siringa e impostare il tubo conico da 15 mL da parte in un rack provetta. Sostituire con cautela lo stantuffo e spingere lentamente lo stantuffo in modo da estinare la soluzione attraverso l'ago e nel tubo #1.
  9. Lavare il tubo conico da 15 mL con 5 mL di soluzione PBS. Agitare il PBS nel tubo conico da 15 mL in modo da solubilizzare il tessuto renale rimanente.
  10. Di nuovo, rimuovere con cautela lo stantuffo dalla siringa da 5 mL contenente l'ago da 18 G e versare il contenuto dal tubo conico da 15 mL all'estremità aperta della siringa. Sostituire con cautela lo stantuffo e sciacquare la siringa spingendo delicatamente verso il basso lo stantuffo, in #1 del tubo. Ripetere questo processo 2x (eseguito 3x in totale).
  11. Inserire un ago da 21 G in una nuova siringa da 5 mL (* siringa da 10 mL per ratto) e rimuovere con cautela lo stantuffo della siringa. Posizionare la siringa con l'ago da 21 G inserito in un nuovo tubo conico 50 mL (tubo #2).
  12. Versare il contenuto dal tubo #1 all'estremità aperta della siringa contenente l'ago da 21 G. Inserire con cautela lo stantuffo e sciacquare la siringa spingendo delicatamente verso il basso lo stantuffo della siringa e posizionando la soluzione estrusa nel tubo #2.
  13. Lavare il tubo #1 con 5 mL di soluzione PBS. Swirl il PBS in tubo #1 in modo da solubilizzare qualsiasi tessuto renale rimanente.
  14. Di nuovo, rimuovere con cautela lo stantuffo dalla siringa da 5 mL contenente l'ago da 18 G e versare il contenuto dal tubo #1 all'estremità aperta della siringa. Sostituire con cautela lo stantuffo e sciacquare la siringa spingendo delicatamente verso il basso lo stantuffo, estecando la soluzione nel tubo #2. Ripetere questo processo 2x (eseguito 3x in totale).
  15. Portare il volume totale di tubo #2 fino a 50 mL aggiungendo ulteriori PBS, fino alla linea 50-mL su tubo #2.
  16. Incubare #2 del tubo contenente la soluzione di tessuto renale in un rack di tubi su una piastra Rocker in un frigorifero impostato a 4 ° c durante la notte (minimo 8-10 h).

3. conteggio dei glomeruli e estrapolazione del numero di nephron

  1. Rimuovere il tubo #2 dal frigorifero e risospendere il tessuto pellettato capovolgendo delicatamente il tubo più volte al fine di creare una soluzione omogenea. Si consiglia di contare i glomeruli entro 5 d dopo l'elaborazione.
  2. Con cautela aliquota 500 μL della soluzione renale in un unico pozzo di una piastra 12-well. Ripetere questo 2x, mettendo ogni aliquota in un pozzo separato in modo che ci siano tre pozzi di soluzione renale per rene, per l'analisi in triplice plicato.
  3. Aggiungere 500 μL di PBS a ciascuno dei tre pozzetti contenenti la soluzione renale, per una diluizione 1:1.
  4. Utilizzando un microscopio invertito, contare il numero di glomeruli per pozzetto. Il conteggio è aiutato utilizzando una griglia di 16 sezioni separate posizionate sul fondo di ciascun pozzo. Contare il numero di glomeruli per ogni sezione della griglia e quindi sommare il conteggio per griglia per ottenere il numero totale di glomeruli per pozzo. I glomeruli sono facilmente identificabili dalla loro struttura sferica. Ulteriori identificatori includevano una tonalità rossastra a causa di capillari riempiti di sangue, così come pre-o post-arteriole che rimangono attaccati al corpo dei singoli glomeruli (Figura 1).
  5. Aggiungere il numero totale di glomeruli conteggiati per ciascuno dei tre pozzetti e poi dividerli per tre per il numero medio di glomeruli per 500 μL di soluzione renale. Se la varianza nel numero medio di glomeruli per pozzo è superiore al 10%, ripetere la procedura di conteggio dei nevi, prestando molta attenzione alla natura omogenea della soluzione renale. Moltiplicare il numero di glomeruli contati per ben volte 100 per il numero medio di glomeruli per rene. Il numero totale di nefrone può essere espresso per rene o, usando il peso del rene, per mg o g di tessuto.

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Risultati

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Di seguito sono riportate le stime rappresentative del numero di nefrone del rene intero da un modello murino di ipertensione e un modello genetico di ratto della malattia renale cronica legata all'età. Le caratteristiche chiave di identificazione dei glomeruli, come una struttura sferica con o senza strutture pre-o post-arteriolari o tubolari collegate, sono evidenziate per quelle nuove al metodo di macerazione acida (Figura 1).

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Discussione

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Con una buona tecnica sperimentale, il metodo di macerazione acida è ideale per stimare il numero di nefrone in rene intero. Anche se il rene viene sciolto in acido, i glomeruli rimangono in gran parte integri e sono facilmente identificabili, rendendo il conteggio dei singoli glomeruli relativamente facile e diretto. La tecnica di macerazione acida è particolarmente vantaggiosa per diversi motivi. In primo luogo, il metodo di macerazione acida è un metodo rapido e conveniente che richiede relativamente poco in termini d...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto in parte dagli istituti nazionali di salute, cuore nazionale, polmone, e Blood Institute (R01HL107632).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anestesia con isofluranoAbbott Laboratories05260-05
Sistema di vaporizzazione e flussometro con isofluranoBraintree ScientificVP IInclude fornitura di ossigeno per uso medico
Microscopio invertito Leica DMIL LED LeicaMicrosystemsDMIL LEDQualsiasi marca adatta anche
Bagno d'acqua digitaleFisher Scientific2239Qualsiasi marca adatto
ToughCut Forbici chirurgiche finiFine Science Tools14058-11tagliente da 25 mm, lunghezza 11,5 cm; Punte: affilate-affilate; Forma della punta: diritta
Micro pinza da dissezione 4 1/4 in.Biomed Res Instruments, Inc10-1760con punta curva
5 pollici x 7 pollici.qualsiasi fonte adattan/aQualsiasi marca adatta anche
Piatto di pesata esagonale in polistireneFisher Scientific02-2002-100Qualsiasi marca adatta anche
Lame di rasoioFisher Scientific12-640Acciaio al carbonio a bordo singolo 0,009
Spugne di garza 4 x 4 pollici 8 stratiFisher ScientificMSD-1400250
10x soluzione salina concentrata tamponata con fosfato (PBS)Sigma AldrichP5493-4LDiluire a 1x 
6 N Soluzione di acido idrocolricoSigma Aldrich3750-32
15 mL provetta da centrifuga conicaFisher Scientific14-959-70CQualsiasi marca adatta anche
50 mL provetta da centrifuga conicaFisher Scientific14-959-49AQualsiasi marca adatta anche
Siringa monouso da 5 mlCole PalmerEW-07944-06Qualsiasi marca adatta anche
18G1.5 usa e getta agoFisher Scientific14-826-5DQualsiasi marca adatta anche
21G1.5 ago monousoFisher Scientific14-826-5BQualsiasi marca adatta anche
piastre per colture cellulari a 12 pozzetti multipli con coperchioCole Palmer#FW-01959-06Qualsiasi marca adatta anche
Rack per provette modulari in polipropileneCole Palmer#EW-06733-00In grado di contenere provette coniche da 15 e 50 mL; qualsiasi marca adatta anche
Pannello in plexiglass

Riferimenti

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