Microscopia 4D del lievito

Sommario

Questo protocollo descrive l'analisi dei compartimenti intracellulari etichettati fluorescentmente in lievito in erba utilizzando la microscopia confocale 4D (time-lapse 3D). I parametri di imaging vengono scelti per catturare segnali adeguati limitando i fotodanni. I plug-in Custom ImageJ consentono di tenere traccia delle strutture etichettate e di analizzarle quantitativamente.

Abstract

L'obiettivo di questo protocollo è quello di caratterizzare come i compartimenti della membrana si formano e si trasformano in cellule vive di lievito in erba. Molti compartimenti intracellulari nel lievito sono dinamici e una piena comprensione delle loro proprietà richiede l'imaging time-lapse. La microscopia a fluorescenza confocale 4D multicolore 4D è un metodo potente per monitorare il comportamento e la composizione di un compartimento intracellulare su una scala temporale di 5-15 min. L'analisi rigorosa della dinamica del compartimento richiede la cattura di migliaia di Sezioni. Per raggiungere questo obiettivo, il fotosbiancamento e la fototossicità vengono ridotti al minimo mediante la scansione rapida a bassissima potenza laser, e le dimensioni dei pixel e gli intervalli di passo z vengono impostati sui valori più grandi compatibili con il campionamento dell'immagine a piena risoluzione. I set di dati 4D risultanti sono rumorosi, ma possono essere levigati dalla deconvoluzione. Anche con dati di alta qualità, la fase di analisi è impegnativa perché le strutture intracellulari sono spesso numerose, eterogenee e mobili. Per soddisfare questa esigenza, i plugin ImageJ personalizzati sono stati scritti per mettere in rete dati 4D sullo schermo di un computer, identificare le strutture di interesse, modificare i dati per isolare le singole strutture, quantificare i corsi temporali di fluorescenza e fare filmati degli stack di z proiettati. I film 4D sono particolarmente utili per distinguere i compartimenti stabili dai compartimenti transitori che girano per maturazione. Tali filmati possono anche essere utilizzati per caratterizzare eventi come la fusione dei compartimenti e per testare gli effetti di mutazioni specifiche o altre perturbazioni.

Introduzione

I compartimenti del sistema di endomembrana sono in costante flusso, e la loro caratterizzazione completa richiede l'imaging delle cellule vive. Descritto qui è un protocollo che impiega la microscopia confocale 4D (time-lapse 3D) per visualizzare scomparti etichettati fluorescentmente in lieviti in erba. Il metodo è stato sviluppato per monitorare la dinamica dei compartimenti secretorici in Pichia pastoris e Saccharomyces cerevisiae^1,2,3. Questo protocollo si concentra su S. cerevisiae, che ha un Golgi non impilato in cui le singole cisterne sono ....

Protocollo

1. Preparazione

1. Rendere non fluorescente minimo NSD medium². L'assenza di riboflavina dovrebbe ridurre la fluorescenza verde di fondo e la fototossicità associata.
2. Far crescere il ceppo di lievito durante la notte a 23 gradi centigradi fino alla fase logaritmica in 5 mL NSD in una fiaschetta sconcertata da 50 mL con buona aerazione. Circa 3-4 h prima dell'analisi, diluire la coltura del lievito in NSD fresco in modo che l'ultimo OD₆₀₀ sarà 0.5-0.8 al momento dell'imaging.
3. Preparare una soluzione da 2 mg/mL di concanavalin A (ConA). Se lo si desidera, congela gli aliquote di questa soluzione in azoto liquido e conserv....

Risultati

L'esempio qui riportato documenta e quantifica la maturazione di due lieviti Golgi cisterne come visualizzato dalla microscopia confocale 4D a doppio colore³. Una cella di lievito contiene nell'ordine di 10-15 Cisternae Golgi, ognuna delle quali matura in un corso temporale di circa 2-4 min. La maturazione può essere visualizzata etichettando il marcatore Golgi Vrg4 con GFP e etichettando il tardo marcatore Golgi Sec7 con un fluorescente rosso proteine come mCherry.......

Discussione

L'imaging confocale 4D degli organelli di lievito richiede un'attenta messa a punto di più parametri. La preoccupazione principale è il fotosbiancamento e la fototossicità. Un tipico filmato 4D prevede la raccolta di migliaia di sezioni ottiche, quindi l'illuminazione laser deve essere mantenuta il più bassa possibile. I tag proteici fluorescenti Tandem possono essere utilizzati per aumentare il segnale senza aumentare l'espressione della proteina marcata^16,17. M.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre con fondo in vetro da 35 mm N. 1.5	MatTek	P35G-0.170-14-C	Piastre di imaging
Concanavalin A polvere	Sigma-Aldrich	C2010
Trolox	Vector Laboratories	CB-1000
Leica SP8 microscopio confocale	Leica Microsystems
Leica Application Suite X	microscopio	Leica Microsystems
Software Huygens Essential, versione 17.04	deconvoluzione dell'imaging		di volume scientifico
l'elaborazione e l'analisi delle immagini	NIH		ImageJ

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