Microscopia 4D del lievito

Sommario

Questo protocollo descrive l'analisi dei compartimenti intracellulari etichettati fluorescentmente in lievito in erba utilizzando la microscopia confocale 4D (time-lapse 3D). I parametri di imaging vengono scelti per catturare segnali adeguati limitando i fotodanni. I plug-in Custom ImageJ consentono di tenere traccia delle strutture etichettate e di analizzarle quantitativamente.

Abstract

L'obiettivo di questo protocollo è quello di caratterizzare come i compartimenti della membrana si formano e si trasformano in cellule vive di lievito in erba. Molti compartimenti intracellulari nel lievito sono dinamici e una piena comprensione delle loro proprietà richiede l'imaging time-lapse. La microscopia a fluorescenza confocale 4D multicolore 4D è un metodo potente per monitorare il comportamento e la composizione di un compartimento intracellulare su una scala temporale di 5-15 min. L'analisi rigorosa della dinamica del compartimento richiede la cattura di migliaia di Sezioni. Per raggiungere questo obiettivo, il fotosbiancamento e la fototossicità vengono ridotti al minimo mediante la scansione rapida a bassissima potenza laser, e le dimensioni dei pixel e gli intervalli di passo z vengono impostati sui valori più grandi compatibili con il campionamento dell'immagine a piena risoluzione. I set di dati 4D risultanti sono rumorosi, ma possono essere levigati dalla deconvoluzione. Anche con dati di alta qualità, la fase di analisi è impegnativa perché le strutture intracellulari sono spesso numerose, eterogenee e mobili. Per soddisfare questa esigenza, i plugin ImageJ personalizzati sono stati scritti per mettere in rete dati 4D sullo schermo di un computer, identificare le strutture di interesse, modificare i dati per isolare le singole strutture, quantificare i corsi temporali di fluorescenza e fare filmati degli stack di z proiettati. I film 4D sono particolarmente utili per distinguere i compartimenti stabili dai compartimenti transitori che girano per maturazione. Tali filmati possono anche essere utilizzati per caratterizzare eventi come la fusione dei compartimenti e per testare gli effetti di mutazioni specifiche o altre perturbazioni.

Introduzione

I compartimenti del sistema di endomembrana sono in costante flusso, e la loro caratterizzazione completa richiede l'imaging delle cellule vive. Descritto qui è un protocollo che impiega la microscopia confocale 4D (time-lapse 3D) per visualizzare scomparti etichettati fluorescentmente in lieviti in erba. Il metodo è stato sviluppato per monitorare la dinamica dei compartimenti secretorici in Pichia pastoris e Saccharomyces cerevisiae^1,2,3. Questo protocollo si concentra su S. cerevisiae, che ha un Golgi non impilato in cui le singole cisterne sono otticamente risolvibili⁴. L'insolita organizzazione Golgi a S. cerevisiae ha permesso la dimostrazione di microscopia 4D che una cisterna Golgi inizialmente etichetta con proteine Golgi precoci residenti, e poi perde quelle proteine mentre acquisisce proteine residenti tardo Golgi^{3 ,5}. Questa transizione può essere visualizzata creando un ceppo in cui la proteina Predicità Golgi Vrg4 è etichettata con GFP mentre la proteina Sec7 tardo Golgi è etichettata con una proteina fluorescente rossa monomerica. Quando le singole cisterne vengono tracciate, la maturazione viene osservata come conversione da verde a rosso³. Questo tipo di analisi può fornire informazioni preziose sulla localizzazione delle proteine e sull'identità del compartimento. Ad esempio, due proteine con orari di arrivo e partenza leggermente sfalsati potrebbero talvolta sembrare etichettare scomparti diversi in immagini statiche, ma possono essere viste nei film 4D per etichettare lo stesso vano in punti temporali diversi^6,7 . Così, la microscopia 4D rivela fenomeni che altrimenti non sarebbero evidenti.

La microscopia 4D informativa dei compartimenti lievito può essere ottenuta con procedure e attrezzature appropriate². Quando possibile, l'etichettatura delle proteine fluorescenti viene eseguita mediante la sostituzione genica⁸ per evitare artefatti di sovraespressione. Poiché le strutture intracellulari sono spesso molto dinamiche, l'imaging 4D è necessario per garantire che una struttura venga tracciata in modo affidabile nel tempo. Il protocollo qui descritto utilizza un microscopio confocale a scansione laser dotato di rilevatori ad alta sensibilità. Con questo dispositivo, l'intero volume cellulare di S. cerevisiae può essere immaginato mediante microscopia confocale circa ogni 1-3 s, con intervalli di 2 s tipici. I dati possono essere raccolti fino a 5-15 min a seconda delle densità di etichettatura dei fluorofori e delle loro proprietà fotofisiche. L'ostacolo principale è quello di ridurre al minimo il fotosbiancamento. A tale scopo, le intensità laser vengono mantenute il più basse possibile, la velocità di scansione confocale viene massimizzata e i parametri ottici sono configurati per l'immagine al limite di Nyquist al fine di catturare le informazioni pertinenti evitando un'eccessiva esposizione alla luce. Queste impostazioni sono anche tenuti ad alleviare la fototossicità, un fattore che viene spesso trascurato durante l'imaging delle cellule vive^9,10,11. I dati rumorosi risultanti vengono elaborati con la correzione della candeggina e algoritmi di deconvoluzione per facilitare la quantificazione delle intensità di fluorescenza.

Anche con film 4D di alta qualità, l'analisi è difficile perché i compartimenti di lievito tendono ad essere numerosi, eterogenei e mobili. A causa delle limitazioni intrinseche della microscopia confocale e delle impostazioni non ottimali necessarie per l'imaging 4D prolungato, le strutture fluorescenti che sono vicine tra loro sono difficili da risolvere. Questo problema può essere risolto concentrandosi sul piccolo numero di strutture fluorescenti che rimangono otticamente risolvibili per tutta la durata del periodo di etichettatura, partendo dal presupposto che tali strutture siano rappresentative dell'intera popolazione di persone etichettate Scomparti. I compartimenti fluorescenti che possono essere tracciati in modo affidabile sono identificati visualizzando filmati di stack di z proiettati e creando una serie di montaggi in cui le sezioni ottiche per ogni punto temporale sono schierate sullo schermo di un computer. Questa analisi impiega plugin personalizzati ImageJ^12, che permettono di tracciare una struttura individuale in isolamento.

Recenti studi di metodi riguardavano l'uso di proteine fluorescenti nel lievito^13, nonché la teoria e la pratica dell'imaging confocale 4D delle cellule di lievito². Questo protocollo si concentra sugli aspetti pratici chiave di un esperimento di imaging 4D. Include alcuni miglioramenti alle procedure descritte in precedenza, nonché le versioni aggiornate del codice e della documentazione del plug-in ImageJ. L'esempio mostrato si concentra sulla dinamica di Golgi, ma questo protocollo è ugualmente adatto per l'imaging di altri compartimenti di lievito.

Protocollo

1. Preparazione

1. Rendere non fluorescente minimo NSD medium². L'assenza di riboflavina dovrebbe ridurre la fluorescenza verde di fondo e la fototossicità associata.
2. Far crescere il ceppo di lievito durante la notte a 23 gradi centigradi fino alla fase logaritmica in 5 mL NSD in una fiaschetta sconcertata da 50 mL con buona aerazione. Circa 3-4 h prima dell'analisi, diluire la coltura del lievito in NSD fresco in modo che l'ultimo OD₆₀₀ sarà 0.5-0.8 al momento dell'imaging.
3. Preparare una soluzione da 2 mg/mL di concanavalin A (ConA). Se lo si desidera, congela gli aliquote di questa soluzione in azoto liquido e conservare a -80 gradi centigradi.
4. Girare la soluzione ConA per 5 minuti a tutta velocità in una microcentrifuga per rimuovere il particolato che può interferire con l'imaging. Quindi aggiungere 250 l del supernatante a una pulita livrina inferiore di copertura 35 mm piatto di microscopia inferiore. Dopo 15 min, lavare 2-3 volte con 2 mL di dH₂O e lasciare asciugare.
5. Aggiungete 250 l della coltura del lievito al piatto rivestito con ConA, attendere 10 min per consentire alle cellule di aderire e lavare delicatamente 2-3 volte con 2 mL NSD. Coprire le celle con 2 mL di NSD freschi.

2. Imaging

1. Utilizzare una lente ad immersione ad olio da 63x o 100x. È sufficiente un'apertura numerica (NA) di 1,40, ma è possibile utilizzare anche una lente NA superiore.
2. Formattare la dimensione del fotogramma in 256 x 128 (larghezza x altezza). Se è necessaria una dimensione del telaio più grande, l'aumento della larghezza non ridurrà la velocità di scansione finché il microscopio confocale è dotato di uno scanner risonante.
3. Regolare il fattore di zoom per ottenere una dimensione in pixel di 80 nm.
4. Utilizzare la velocità massima di scansione, che in genere è nell'ordine di 8 kHz. Attivare la scansione X bidirezionale, se disponibile, e se gli esperimenti di controllo confermano che le scansioni dalle due direzioni sono nel registro.
5. Impostare l'accumulo della linea su 4 o 6. Assicurarsi di utilizzare l'accumulo (somma) invece di media.
6. Impostare il foro stenopeico su 1.2 unità Airy. Empiricamente, durante l'imaging di cellule di lievito vivo, questa impostazione cattura più fotoni rispetto alla scelta standard di 1.0 Airy unit, causando nessuna perdita di risoluzione apprezzabile.
7. Per ogni canale di fluorescenza, impostare la lunghezza d'onda dell'eccitazione, assegnare un rilevatore ad alta sensibilità, impostare l'intervallo di lunghezza d'onda di emissione e attivare la modalità di conteggio dei fotoni, se disponibile. Le scelte di lunghezza d'onda dipenderanno dai fluorofori. Ad esempio, eccitare la fluorescenza GFP a 485 nm e raccogliere da 495-550 nm, e eccito mScarlet fluorescenza a 555 nm e raccogliere da 562-625 nm.
8. Impostare l'intensità di ogni laser per essere il più basso possibile. Questa impostazione deve essere determinata empiricamente. Un'intensità appropriata si tradurrà in una sequenza di immagini rumorosa ma interpretabile, con il segnale di fluorescenza sbiancante non più del 50% entro la fine di un film di 5 minuti. Sul microscopio confocale utilizzato qui (vedi Tabella deimateriali), questa intensità corrisponde a un'impostazione di potenza laser dell'ordine del 5%.
9. Utilizzare filtri di tacca o gating tempo per evitare di catturare la luce riflessa dal coverslip. Se il calendario è disponibile, impostare la finestra di gating su 0,6-10,0 ns.
10. Attivare l'imaging brightfield e utilizzare un rilevatore a bassa sensibilità per la raccolta dei dati. Impostare il guadagno su un livello che renda le celle chiaramente visibili. Non utilizzare il contrasto di interferenza differenziale (DIC) perché il prisma interferirà con l'acquisizione di dati di fluorescenza affidabili.
11. Impostare l'intervallo di z su 0,25-0,35 m. Immagine dell'intero volume delle cellule di lievito raccogliendo circa 20-25 sezioni ottiche per stack z. Specificare la direzionalità dell'imaging in modo che "giù" si muove verso la coverslip.
12. Per un filmato tipico, impostare l'intervallo di tempo tra gli stack z su 2 s e impostare la durata del filmato da 5 a 10 min. A seconda del vano in fase di studio, ridurre l'intervallo per realizzare filmati più brevi di dinamiche relativamente veloci o aumentare l'intervallo per realizzare filmati più lunghi di dinamiche relativamente lente.
13. Salvare il filmato come file LIF con le immagini brightfield nell'ultimo canale. Profondità di bit più elevate non sono necessarie in questa fase e la pipeline di elaborazione è configurata per accettare dati TIFF a 8 bit.

3. Deconvoluzione

1. Avviare il software di deconvoluzione (vedere Tabella dei materiali), utilizzando l'algoritmo di stima massima della probabilità massima classica.
2. Aprire il set di dati generato nel passaggio 2.13.Open the data set generated in step 2.13. Selezionare "Deconvoluzione guidata". Esaminare i valori visualizzati nella "Creazione guidata parametri". I parametri di imaging devono essere rilevati e visualizzati correttamente. In "Refractive indexes", modificare il valore "Embedding med." su 1.40 per approssimare il citoplasma del lievito. In "coverslip", seleziona "Avvia editor" e "Posizione stima" e "OK" per impostare la posizione della coverslip. Seleziona "Imposta tutto verificato" e "Accetta".
3. Procedere attraverso il "Procedura guidata di deconvoluzione" per ogni canale di fluorescenza. Selezionare "Manuale" come modalità per la stima dello sfondo. Esaminare il profilo di intensità di fluorescenza dei dati non elaborati per determinare un valore di base stimato, che in genere è di circa 0,1.
4. Nel menu di configurazione della deconvoluzione, immettere un valore "Numero massimo di iterazioni" pari a 40 e disattivare la correzione candeggina. Immettere un valore SNR stimato, che in genere è di circa 5.0. Fare clic su "Deconvolve".
5. Se necessario, tornare al file di dati originale, regolare i valori di sfondo e SNR e ripetere la deconvoluzione, fino a quando il rumore non viene sufficientemente rimosso senza eliminare la vera fluorescenza dalle strutture dim.
6. Unire i canali di fluorescenza del campo luminoso e deconvolved. Per i successivi passaggi di modifica del filmato in ImageJ, disporre i canali in modo che il rosso sia il primo, il rosso (se presente) sia il prossimo, il blu (se presente) sia il prossimo e il campo luminoso sia l'ultimo. Salvare la sequenza di immagini come file TIFF a 8 bit.

4. Correzione sbiancamento e generazione di filmati

1. Importate la sequenza di immagini deconvolved in ImageJ e convertitela in un hyperstack scegliendo Immagine > Hyperstacks > Stack in Hyperstack. Selezionate "xyzct" dal menu a discesa e riempite il numero di canali, le sezioni di impilamento z e gli intervalli di tempo (http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector).
2. Scegliete Immagine > Colore > Dividi canali.
3. Correggere i canali di fluorescenza per il fotosbiancamento utilizzando il plug-in ImageJ disponibile da http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector. Una volta che il plugin è stato scaricato e installato, scegli Plugin > EMBLtools > Correzione sbiancamento. Seleziona "Adatta esponenziale".
4. Per unire i canali di fluorescenza del campo luminoso e della fluviale corretta in un hyperstack, scegliete Immagine > Colore > Unisci canali. Salvare l'hyperstack risultante come file TIFF a 8 bit.
5. Installare i plugin ImageJ personalizzati forniti con questo protocollo. Seguire le istruzioni nel documento di accompagnamento per visualizzare, modificare e quantificare la sequenza di immagini e per produrre un filmato finale delle pile di z proiettate.

Risultati

L'esempio qui riportato documenta e quantifica la maturazione di due lieviti Golgi cisterne come visualizzato dalla microscopia confocale 4D a doppio colore³. Una cella di lievito contiene nell'ordine di 10-15 Cisternae Golgi, ognuna delle quali matura in un corso temporale di circa 2-4 min. La maturazione può essere visualizzata etichettando il marcatore Golgi Vrg4 con GFP e etichettando il tardo marcatore Golgi Sec7 con un fluorescente rosso proteine come mCherry...

Discussione

L'imaging confocale 4D degli organelli di lievito richiede un'attenta messa a punto di più parametri. La preoccupazione principale è il fotosbiancamento e la fototossicità. Un tipico filmato 4D prevede la raccolta di migliaia di sezioni ottiche, quindi l'illuminazione laser deve essere mantenuta il più bassa possibile. I tag proteici fluorescenti Tandem possono essere utilizzati per aumentare il segnale senza aumentare l'espressione della proteina marcata^16,17. M...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre con fondo in vetro da 35 mm N. 1.5	MatTek	P35G-0.170-14-C	Piastre di imaging
Concanavalin A polvere	Sigma-Aldrich	C2010
Trolox	Vector Laboratories	CB-1000
Leica SP8 microscopio confocale	Leica Microsystems
Leica Application Suite X	microscopio	Leica Microsystems
Software Huygens Essential, versione 17.04	deconvoluzione dell'imaging		di volume scientifico
l'elaborazione e l'analisi delle immagini	NIH		ImageJ