Articolo metodologico

Misurazione delle dinamiche di sensibili alla forza della proteina in cellule viventi, utilizzando una combinazione di tecniche di fluorescenza

DOI:

10.3791/58619

⸱

2 novembre 2018

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Duke University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo un protocollo per l'uso simultaneo di Förster risonanza energia basati sul trasferimento di tensione sensori per misurare recupero carico e fluorescenza della proteina dopo photobleaching per misurare la dinamica della proteina che permette la misurazione di sensibili alla forza dynamics della proteina nelle cellule viventi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellule di percepiscono e rispondono ai segnali fisici nel loro ambiente convertendo stimoli meccanici in segnali biochimicamente rilevabili in un processo chiamato mechanotransduction. Un passo fondamentale nella meccanotrasduzione è la trasmissione di forze tra gli ambienti interni ed esterni. Per la trasmissione di forze, ci deve essere una continua, ininterrotta sollevatore fisico creato da una serie di interazioni proteina-proteina. Per un'interazione proteina-proteina data, carico meccanico non può avere alcun effetto sull'interazione, portare alla dissociazione più veloce dell'interazione, o addirittura stabilizza l'interazione. Comprendere come molecolare carico detta turnover delle proteine in cellule viventi in grado di fornire preziose informazioni circa lo stato meccanico di una proteina, a sua volta chiarire il suo ruolo nella meccanotrasduzione. Le tecniche esistenti per la misurazione dinamica di proteine sensibili alla forza mancano misure dirette di carico proteico o si basano su misure effettuate di fuori del contesto cellulare. Qui, descriviamo un protocollo per il recupero di trasferimento-fluorescenza Förster energia di risonanza dopo tecnica photobleaching (FRET-FRAP), che consente la misurazione delle dinamiche di sensibili alla forza della proteina nelle cellule viventi. Questa tecnica è potenzialmente applicabile a qualsiasi sensore di tensione basato su FRET, facilitare lo studio della dinamica di proteine sensibili alla forza in varietà di strutture subcellulari e in diversi tipi cellulari.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'ambiente extracellulare è una fonte ricca di spunti sia biochimici e fisici che determinano il comportamento delle cellule. In particolare, la natura fisica del microambiente possa mediare principali funzioni cellulari, tra cui la crescita delle cellule, migrazione e differenziazione1,2,3,4. Disregolazione della meccanica del microambiente è una componente critica per molte malattie che non hanno ancora adeguato trattamento, quali cancro5, aterosclerosi6e7di fibrosi. Una comprensione completa di come le cellule convertono stimoli fisici in segnali biochimicamente rilevabili, un processo chiamato meccanotrasduzione, richiede la delucidazione dei meccanismi molecolari che mediano la trasmissione della forza, sia all'interno e all'esterno delle cellule e all'interno di più strutture subcellulari.

All'interno di strutture subcellulari, proteine si rivolgono costantemente sopra; associazione e separazione basata sulla forza del loro interazioni con l'associazione partner8. Per le forze per essere trasmesso con successo attraverso una distanza fisica, ci devono essere una catena ininterrotta di interazioni proteina-proteina, significante che il fatturato di una proteina deve essere abbastanza lento per sostenere e trasmettere forza alla sua associazione partner9. Mentre interazioni proteina-proteina consistono generalmente di diversi legami non covalenti tra i domini della proteina, l'interazione spesso è concettualizzato come uno stato legato che può eseguire la transizione a uno stato non associato sotto diverse condizioni10, 11. per un'interazione proteina-proteina data, è possibile che in vigore non può avere effetto sulla durata dell'interazione, conosciuto come un "legame ideale", ridurre la durata dell'interazione, conosciuto come un "legame di slittamento" o aumentare la durata dell'interazione , conosciuto come un "legame di cattura"10. Così, c'è un intricato rapporto tra carico proteico e dinamica di proteine che ci riferiamo come sensibili alla forza dinamica.

Verso la comprensione l'effetto del carico sulle dinamiche di vincolo, è stata effettuata una serie di esperimenti altamente informativi a livello di singola molecola. Utilizzando proteine isolate, o frammenti di proteine e tecniche di manipolazione come magnetiche pinzette, pinzette ottiche e microscopia a forza atomica, questi studi hanno dimostrato interazioni della proteina-proteina di sensibili alla forza per più rilevanti proteine11,12. Entrambe le integrine13 e caderine14, che sono proteine transmembrana importante per formare interazioni cellula-matrice e cellula-cellula, rispettivamente, hanno dimostrato alterazioni nella dinamica dovuta a caricare. All'interno della cellula, vinculina viene reclutato a entrambi talin15 e α-catenina16 in un modo dipendente dalla forza e può formare un legame di cattura con l'actina17, che indica un ruolo cruciale per vinculin sia adesioni focali (FAs) e giunzioni intermedie (AJs ) sotto carico. Studi di singola molecola consentono per l'isolamento delle interazioni specifiche proteina-proteina e producono risultati inequivocabili, ma essi non tengono conto della complessità dell'ambiente cellulare.

Pietra miliare gli esperimenti hanno dimostrato che diverse strutture subcellulari, tra cui FAs e AJs, mechanosensitive ed esibiscono Assemblea avanzata in risposta a carichi generati internamente o esternamente applicato18,19, 20,21,22. Inoltre, diversi modelli teorici hanno suggerito che potrebbe essere guidato mechanosensitive assemblaggio di proteine sensibili alla forza dinamica23,24,25. Per esaminare queste dinamiche di sensibili alla forza nelle cellule viventi, sono stati presi alcuni approcci indiretti. FRAP e relative tecniche forniscono una metodologia relativamente semplice per la misurazione dinamica della proteina in cellule26,27,28,29. Tuttavia, la misurazione del carico proteico è stato più limitata. Un approccio tipico è quello di confrontare la dinamica della proteina in cellule con e senza l'esposizione ad un inibitore del citoscheletro utilizzato per ridurre il generale cella contrattilità8,30,31. Concettualmente, questo è un confronto tra un carico elevato e basso carico stato. Tuttavia, non c'è nessuna quantificazione del carico attraverso la proteina in entrambi gli Stati, e ci possono essere effetti biochimici non intenzionali dell'inibitore, tale perdita di siti di legame chiave lungo un filamento di F-actina. Un altro approccio, specifico per FAs, è stato per misurare lo sforzo di forza totale sul substrato dalla FA usando microscopia di forza di trazione per approssimare carico molecolare ed esaminare la relazione con le dinamiche di una singola proteina all'interno la FA32. Mentre questo approccio consente per la quantificazione della forza totale, non fornisce informazioni specifiche molecolarmente. FAs sono costituiti da più di 200 differenti proteine, molte delle quali può sopportare carico33. Così, misurare la produzione di forza totale di un FA potenzialmente oscura la possibilità di molteplici vie di trasmissione di forza e in modo affidabile non fornisce una misura del carico su una proteina specifica.

A differenza di precedenti approcci in mechanobiology, l'avvento dei sensori di tensione basato su FRET permette diretta misurazione del carico di proteine specifiche all'interno di vita di cellule34,35,36. Qui, presentiamo un protocollo che combina sensori di tensione basato su FRET con la misura di FRAP-base della dinamica della proteina. Ci riferiamo a questa tecnica come FRET-FRAP. Questo approccio permette la misurazione simultanea di carico proteico e la dinamica della proteina, permettendo la valutazione delle dinamiche sensibili alla forza della proteina in cellule viventi (Figura 1). Già, la tecnica FRET-FRAP è stata applicata allo studio delle dinamiche sensibili alla forza della meccanica del linker proteina vinculin37. Sensori di tensione sono stati sviluppati per numerose proteine che sono rilevanti in una varietà di strutture subcellulari. Ad esempio, i sensori sono stati sviluppati per vinculin34 e talin38,39 a FAs, caderine e catenine in AJs40,41,42, nesprin nel complesso nucleare LINC 43, α-actinina44 e filamina36 del citoscheletro e MUC-1 nel glicocalice45, tra gli altri46. Allo stesso modo, FRAP è che una tecnica comunemente usata è stata utilizzata sulle proteine meccanosensibili entro le adesioni focali8,31, adherens junctions47, actina corteccia26e nucleo48. Movimento in avanti, che la tecnica FRET-FRAP dovrebbe essere ampiamente applicabile a uno qualsiasi di questi sensori esistenti o appena sviluppato sensori, consentendo per le misurazioni di sensibili alla forza dinamica in un'ampia varietà di contesti e strutture subcellulari. A tal fine, forniamo un dettagliato protocollo generalizzato per implementare la tecnica FRET-FRAP applicabile a questi diversi sistemi. Speriamo che questo vi permetterà una vasta gamma di esperimenti chiarire i ruoli delle varie proteine meccanosensibili nella regolazione della trasmissione della forza e nel mediare il comportamento delle cellule.

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Protocollo

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1. generare i campioni per l'Imaging

  1. Costrutto di sensore tensione stabile espresso nel tipo cellulare desiderato.
    1. Clonare Tensione sensore costrutto in pRRL vettoriale o altri plasmidi di espressione virale.
      Nota: Diversi strumenti clonazione molecolare sono disponibili per realizzare questo passaggio compreso l'uso degli enzimi di restrizione, si sovrappongono estensione e Gibson Assembly35. Il vettore di pRRL è usato nella trasduzione virale lenti e consente un notevole grado di produzione di proteine attraverso l'uso del promotore umano del citomegalovirus (CMV). Diversi vettori possono essere necessari per un particolare contesto. Per esempio, il promotore di CMV è messa a tacere in alcuni tipi di cella49. Inoltre, solo basato su FRET sensori contenenti proteine fluorescenti che omologia di sequenza forte mancanza, come mTFP1 e A206K Venus, utilizzabile per creare linee cellulari stabili. Sensori contenente ciano proteina fluorescente e la proteina fluorescente gialla sarà probabilmente soggetto a ricombinazione omologa50.
    2. Generare dei lentivirus in cellule di rene embrionale umano (HEK) 293T utilizzando psPax2 e pMD2.G imballaggio plasmidi utilizzando virus standard produzione metodi51.
      Attenzione: Lentivirus dovrebbero essere curati solo da personale adeguatamente addestrato in un ambiente di laboratorio di livello 2 di biosicurezza.
      Nota: Questa combinazione di cellule e imballaggio plasmidi è appropriata per l'utilizzo con pRRL. Altri sistemi possono essere richiesti con altri vettori.
    3. Trasducono celle volute con virus utilizzando protocolli di trasduzione standard52 e utilizzare citometria a flusso per ordinare celle53 selezionando una popolazione omogenea che esprimono ogni costrutto a livelli endogeni circa37. Dopo la selezione della cella, gli esperimenti possono essere eseguiti immediatamente, o cellule possono essere criogenicamente congelate per un uso successivo. Non superare 2 cicli di gelo-disgelo per una linea cellulare stabile determinato.
      Nota: L'uso di linee cellulari carenti nella proteina di essere studiato (per esempio, MEFs vinculin- / - per l'utilizzo con il sensore di tensione vinculina) aumenterà il segnale di rumore rapporto in esperimenti di FRET, nonché di limitare gli artefatti sovra-espressione. Tali linee di fibroblasti embrionali (MEF) stabile del mouse possono essere utilizzati per circa 15 passaggi prima perdita significativa di espressione o degradazione dei sensori è apparente. Se i metodi di base virale non sono desiderati, una pletora di reagenti commerciale utilizzabile secondo il protocollo del produttore a transfect transitoriamente una varietà di tipi cellulari con sensori di tensione in un plasmide appropriato, ad esempio pcDNA3.1. Espressione ottimale sarà 24-48 h dopo trasfezione.
  2. Preparare substrati per la semina delle cellule.
    1. Acquisire 4, piatti con fondo di vetro 35mm.
    2. Lavorando in una cappa di coltura delle cellule, in un tubo da 15 mL canonico, fare 4 mL di 10 µ g/mL fibronectin in tampone fosfato (PBS) di soluzione fisiologica con PBS sterile nella cappa di cultura cellulare. Capovolgere delicatamente la provetta una volta per mescolare e lasciare la soluzione di sedersi per 5 min nella cappa di cultura cellulare.
      Nota: La concentrazione o il tipo di proteina della ECM potrebbe essere necessario essere regolato per altri tipi di cellule. Le condizioni di cui sono adatte per MEFs.
    3. Pipettare 1 mL di soluzione di fibronectina su ogni piatto con fondo di vetro.
    4. Lasciare la soluzione di fibronectina sui piatti per 1 h a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C.
    5. Aspirare la soluzione di fibronectina, sciacquare una volta con PBS e aggiungere 1 mL di PBS.
  3. Seme le cellule su substrati preparati.
    1. Iniziare con le celle di interesse ad una percentuale di confluenza appropriata per subcoltivazione in una piastra di coltura di 6 cm.
      Nota: Diversi tipi di cellule richiede condizioni di coltura distinte delle cellule e protocolli subcoltivazione. Questa sezione fornisce indicazioni adatti a MEFs. In genere, MEFs sono cresciuto fino a 85% confluenza prima subcoltivazione.
    2. Lavorando all'interno di una cappa di cultura cellulare, sciacquare le cellule una volta con 3 mL di PBS. Aggiungere 1 mL di 0.05% tripsina-EDTA e incubare per 5 min a 37 ° C.
    3. Aggiungere 3 mL di terreno completo al piatto cm 6, raccogliere le celle e inserire in una provetta conica da 15 mL.
      Nota: Composizione per media completi dipenderà il tipo di cella utilizzato. Per MEFs, completa per i media è spesso definita come Medium di Eagle per volta di alto glucosio Dulbecco con 10% siero bovino fetale, 1% antibiotico antimicotico (contenente amfotericina B, penicillina e streptomicina) e una soluzione di 1% degli aminoacidi non essenziali (NEAA).
    4. Rallentare le cellule a 1000 x g per 5 min.
    5. Aspirare i media e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di multimediale completo.
    6. Rimuovere PBS da piatti di vetro rivestite di fibronectina. Contare le celle e 30.000 cellule su ogni piatto di vetro rivestite di fibronectina con il supporto completo appropriato per un volume finale di 1,5 mL di semi.
      Nota: Questa densità cellulare è adatta per MEFs e porterà ad una popolazione di cellule che non sono toccanti, ma non eccessivamente sparse. Il numero esatto delle cellule potrebbe essere necessario essere regolato per altri tipi di cellule o altra camera imaging.
    7. Permettono alle cellule di diffondere per 4 h dopo la semina. A 2 h di diffusione, aspirare il media di crescita e sciacquare una volta con imaging media, lasciando 1,5 mL di imaging media.
      Nota: Questa volta spalmare è adatta per MEFs ma potrebbe essere necessario essere modificato per altre cellule. Tuttavia, i periodi di incubazione di durata superiore a 6-8 h porterà ad significativa deposizione di ECM proteine da siero nei mezzi di comunicazione completa. Media di imaging devono contenere le stesse aggiunte come multimediale completo ma dovrebbe essere otticamente chiaro e non contiene composti che reagiscono in canali di imaging, come Flavine o placare la fluorescenza, come il rosso fenolo. Un generalmente utile supporti di imaging sono DMEM-gfp Live Cell visualizzazione completati con 10% FBS e 1% di soluzione NEAA. Se sfondo autofluorescenza è inaccettabilmente alto, quindi la quantità di siero può essere ridotto. Se non è possibile un cambiamento di media dopo la placcatura iniziale, le cellule possono essere direttamente risospesi in media completati con un inibitore della tripsina di imaging.

2. impostare il microscopio per l'Imaging

  1. Accendere il microscopio.
    1. Accendere la lampada ad arco prima.
      Nota: Una lampada ad arco rilascerà un impulso elettromagnetico, che possono danneggiare altre attrezzature che sono già su.
    2. Attivare il filtro ruota controller, controller di fase automatico, interfaccia del microscopio-computer e fotocamera.
    3. Accendere il laser FRAP e comandi di posizionamento del laser.
      Attenzione: Se visualizzate direttamente, laser ad alta potenza può essere dannoso per gli occhi. Si consiglia di configurare il sistema di microscopio per bloccare l'eccitazione laser da essere diretto per i pezzi di occhio, che possono essere eseguiti spostando uno specchio nel percorso del fascio FRAP durante lo sbiancamento per riflettere il laser verso il campione e prevenire la trasmissione all'oculare.
    4. Accendere il computer e il software di controllo aperto microscopio.
    5. Consentire 15 min per la lampada ad arco e FRAP laser per riscaldarsi.
  2. Tarare il laser FRAP.
    1. Aprire la finestra di configurazione del laser. Impostare Impostazione illuminazione (durante l'impulso) per le impostazioni di illuminazione FRAP appropriate per il campione a radiazioni laser. Impostare Impostazione illuminazione (durante l'imaging) per le impostazioni di illuminazione appropriata per solo il fluoroforo accettore di imaging.
    2. Selezionare l'obiettivo per calibrare in Impostazione del sistema di Coordinate. Deselezionare Punti di calibrazione manuale fare clic su e selezionare visualizzare immagini durante la calibrazione.
    3. Impostare il tempo di permanenza a 10.000 µs e il numero di impulsi a 100.
    4. Porre il vetrino di calibrazione, fatto di bromuro di etidio sigillato tra una lastra di vetro e un vetrino coprioggetti, all'adattatore di fase con il vetrino coprioggetti lato verso il basso.
      Attenzione: Il bromuro di etidio è un agente mutageno e deve essere maneggiato usando guanti. Se la diapositiva è compromessa, smaltire secondo le linee guida dell'istituzione.
    5. Utilizzare le impostazioni di illuminazione acceptor per concentrarsi sulla superficie del vetrino, identificabile come il piano focale con il segnale più brillante. Piccoli difetti nel rivestimento sarà visibili per aiutare nella messa a fuoco.
    6. Spostare la diapositiva in un'area con fluorescenza uniforme in tutto il piano di formazione immagine.
    7. Fare clic su Crea impostazione. Il software verrà inizializzato il processo di calibrazione, candeggio e rilevamento della posizione del punto sbiancato automaticamente.
    8. Garantire una calibrazione successo valutando l'immagine finale, che sarà una 3x3 griglia di punti sbiancati che dovrebbero essere distribuiti uniformemente e messo a fuoco. Salvare l'immagine di calibrazione per riferimento futuro.
    9. Rimuovere il vetrino di calibrazione e archiviare in modo sicuro. Calibrazione deve essere eseguita prima di iniziare ogni esperimento ma non deve necessariamente essere eseguita tra i campioni.

3. scegliere i parametri per l'Imaging FRET

  1. Correzione uno dei campioni delle cellule che esprimono il sensore di tensione con paraformaldeide al 4% per un minimo di 10 soluzione di paraformaldeide generati deve essere metanolo libero, spesso definito come EM-grade, per prevenire la denaturazione delle proteine fluorescenti. Posto in PBS dopo la fissazione.
    Attenzione: Le soluzioni di paraformaldeide sono tossiche. Questo passaggio deve essere eseguito in una cappa aspirante e la soluzione deve essere smaltita secondo le politiche istituzionali.
    Nota: Questa ottimizzazione non dipendono dalla dinamica della proteina, e un campione fisso consente massima imaging tempo senza preoccuparsi di salute delle cellule.
  2. Sciacquare il campione tre volte con PBS e lasciare in PBS.
    Nota: Utilizzo di supporti di montaggio più commercialmente disponibili influirà fluoroforo proprietà, il campione rendendo inadatto per FRET54di imaging. Idealmente, le cellule saranno essere ripreso immediatamente, ma possono essere lasciate durante la notte a 4 ° C. Tempi di attesa più lunghi si tradurrà in deterioramento del campione.
  3. Il campione viene posto in titolare di fase del microscopio per l'imaging.
  4. Aprire lo strumento di acquisizione multi-dimensional (MDA). Stabilire un imaging sequenza di tre canali: eccitazione solo acceptor ed emissione (canale ricettore), eccitazione del donatore ed emissione accettore (FRET canale) e donatore solo eccitazione ed emissione (canale di donatore).
    Nota: Ci sono una varietà di modi per campioni di immagine FRET. I tre canali o "tre-cubo" metodo di imaging abbinato a mezzo di calibrare il sistema per misurare l'efficienza FRET è consigliato per tensione basato su FRET sensori55,56. Questo approccio è veloce, semplice e non distruttivo, richiede solo una fluorescenza standard imaging microscopio e consente il confronto di esperimenti in giorni diversi e configurazioni di imaging.
  5. Esplorare il campione utilizzando un tempo di esposizione di 500 ms e un filtro a densità neutra (ND) del 10%. Trovare una cella esprimendo il sensore di tensione con localizzazione chiaro a una struttura di interesse.
  6. Selezionare un tempo di esposizione di 500 ms o la lunghezza desiderata per ogni canale imaging e un filtro ND del 100% e acquisire una sequenza di immagini FRET.
  7. Stimare l'intensità media del sensore alle strutture subcellulari di interesse in ogni canale imaging. Segnali bassi possono portare a risultati imprecisi a causa di improprio correzione stime, non-linearità in rivelatori, o contributo significativo di segnali di fondo. Una guida approssimativa di riferimento è quella di puntare per intensità superiore al 10% della gamma dinamica della fotocamera (cioè., per una fotocamera di 16 bit, intensità dovrebbe essere sopra 6.000).
    Nota: Impostazioni ottiche identiche (tempi di esposizione, filtri, obiettivi e altre variabili come l'aumento di fotocamera o binning) devono essere utilizzate per tutti gli esperimenti di FRET che saranno confrontati. Cambiando queste impostazioni porterà ad un'alterazione nella quantità FRET che è sia generato e/o rilevati nella confi gurazione di microscopia. Misure di efficienza FRET sono indipendenti di queste impostazione, ma non sono i fattori di calibrazione utilizzati per determinare l'efficienza FRET. In teoria, vari set di fattori di calibrazione potrebbe essere utilizzato per generare FRET efficienze da ottiche diverse impostazioni, ma questo non è consigliato. Candeggio o fototossicità possono essere diversi tra le varie impostazioni, creazione di falsi risultati.
  8. Acquisire una sequenza di immagini FRET seconda dello stesso campo di vista. Photobleaching di stima tra i fotogrammi confrontando l'intensità media del sensore in ogni canale imaging. Photobleaching dovrebbe essere ridotto al minimo, preferibilmente inferiore a 1-5% perdita di segnale.
  9. Regolare i parametri di imaging per massimizzare l'intensità riducendo photobleaching. Per regolazione grossolana, cambiare il filtro ND utilizzato durante l'acquisizione. Per regolazioni più precise, cambiare il tempo di esposizione in passi di 250 ms.
  10. Ripetere i passaggi 3.5-3.8 segnale adeguato può essere ottenuto riducendo al photobleaching.
    Nota: In genere, le impostazioni per il sensore di tensione vinculin nei MEFs vinculin- / - sono 1.500 ms, ms 1.500 e 1.000 ms per i donatore, FRET e acceptor canali rispettivamente. I valori ottimali variano con il tipo di sistema di illuminazione, obiettivo, set di filtro e sensore di livello di espressione.

4. scegliere i parametri per FRAP Imaging

  1. Ottimizzare le impostazioni del laser per garantire completa imbianchimento della regione di interesse (ROI) senza candeggio zona circostante o causare photodamage.
    1. Difficoltà uno dei campioni generati delle cellule che esprimono il sensore di tensione con paraformaldeide al 4% per 10 min.
      Nota: Questa ottimizzazione non dipendono dalla dinamica della proteina, e un campione fisso consente massima imaging tempo senza preoccuparsi di salute delle cellule. Questo eviterà anche il recupero di candeggio di proteine cellulari, consentendo l'isolamento dell'effetto di sbiancamento, evitando tutti gli effetti dal recupero rapido, diffusione-mediata fluorescenza che si verificano tra l'incidenza di candeggio e prendendo la prima immagine post-candeggina.
      Attenzione: Le soluzioni di paraformaldeide sono tossiche. Questo passaggio deve essere eseguito in una cappa aspirante e la soluzione deve essere smaltita secondo le politiche istituzionali.
    2. Sciacquare il campione 3 volte con PBS e lasciare in PBS.
      Nota: L'utilizzo di supporti di montaggio più commercialmente disponibili influenzerà il fluoroforo proprietà, che rende il campione inadatto per FRAP54di imaging. Idealmente, le cellule saranno essere ripreso immediatamente, ma possono essere lasciate durante la notte a 4 ° C. Tempi di attesa più lunghi si tradurrà in deterioramento del campione.
    3. Il campione viene posto in titolare di fase del microscopio per l'imaging.
    4. Aprire la finestra di configurazione del laser. Iniziare con l'impostazione di un tempo di permanenza del laser di 1.000 µs e 10 impulsi, che significa che ogni spot nella scansione attraverso il ROI riceverà 10.000 µs di piena potenza laser
      Nota: Un 500 mW, 515 nm del laser è stato usato per lo sbiancamento. Questo è stato scelto per sbiancare selettivamente Venus A206K, il ricettore in vinculin sensore di tensione, con la massima efficienza. Se vengono utilizzati sensori di tensione basato su FRET con altre proteine fluorescenti, può avere un altro tipo di laser da impiegare.
    5. Trovare una cella esprimendo il sensore di tensione con localizzazione chiaro a una struttura di interesse e di acquisire un'immagine.
    6. Disegnare un ROI rettangolare che delinea l'area per memorizzare la posizione di ROI e candeggina. Impulso del laser. Scattare un'altra immagine del campione.
      Nota: Le dimensioni della casella dovrebbero essere circa la dimensione della intera FA. Cura dovrebbe essere presa che la dimensione della casella non varia drasticamente attraverso esperimenti. L'area sbiancato deve essere attentamente monitorato in proteine la cui dinamica è interessati da diffusione. Si tratta di una potenziale preoccupazione in proteine transmembrana, come caderine47, o proteine che diffondono lentamente27,57.
    7. Controllare la qualità di photobleaching controllando che il ROI intero è sbiancato tale che l'intensità è vicino a livelli di fondo. Inoltre, assicurarsi che non vi è nessun candeggio fuori il ROI.
    8. Regolare le impostazioni di laser come necessario per ottenere una quantità significativa di candeggio entro il ROI senza indurre candeggio significativo fuori il ROI. Per regolazione grossolana, alzare e abbassare il tempo di permanenza nei passaggi di 100 µs e per le regolazioni fini, alzare e abbassare il numero di impulsi in passi di 5 impulsi.
    9. Ripetere i passaggi 4.1.5 – 4.1.8 fino a raggiungere le impostazioni minime, in cui il ROI è completamente sbiancato senza photobleaching fuori bersaglio.
      Nota: Realizzare un sostanza valore iniziale sbianca senza indurre fototossicità è un aspetto fondamentale dell'analisi FRAP. Utilizzare le impostazioni di laser che si traducono in una completa candeggina nei campioni fissi. In generale, il numero minimo di fotoni deve essere utilizzato per raggiungere il livello di schiaritura desiderato. Inoltre, il protocollo di imbianchimento dovrebbe essere tenuto relativamente costante durante gli esperimenti, come alterazioni possono influenzare le misure di proteina dynamics58.
  2. Ottimizzare i parametri di time-lapse per catturare appieno la dinamica della proteina di interesse, riducendo al minimo photobleaching.
    1. Preparare il set-up di microscopia per l'imaging di cellule vive, preferibilmente con un piatto riscaldato e obiettivo, nonché il controllo di CO2 . Permettono di equilibrare per 20 min.
      Nota: Per mantenere la salute delle cellule imaged, pH e temperatura devono essere mantenuti nel vaso imaging. Una varietà di fasi riscaldate e riscaldatori oggettive prontamente in grado di mantenere la temperatura della cella a 37 ° C. Il controllo del pH per molti tipi di supporti può essere compiuto tramite l'uso di una pompa peristaltica a pass umidificati 5% CO2 sopra il campione a 15 mL/min, in alternativa, se CO2 controllo non è disponibile, dal vivo imaging supporto contenente HEPES deve essere utilizzato per evitare variazioni di pH grande.
    2. Posto uno dei campioni generati delle cellule che esprimono il sensore di tensione in titolare di fase del microscopio per l'imaging. Permettono di equilibrare per 10 min.
    3. Utilizzando il tool MDA, impostare un time-lapse di acquisire 3-5 immagini pre-bleach, bleach il ROI e continuano a prendere 10-60 immagini.
      Nota: Per vinculin presso FAs, imaging ogni 5 s per 5 min post-bleach è sufficiente osservare le dinamiche senza introdurre eccessivo imbianchimento31. Punti di partenza utili per imaging tasso e la durata per molte altre proteine può essere trovati nella letteratura47,48,59,60.
    4. Utilizzare acceptor imaging impostazioni che minimizzano l'esposizione del campione alla luce, pur mantenendo un rapporto segnale-rumore sufficiente, per realizzare l'immagine della struttura di interesse. Un buon punto di partenza è la metà di il ND filtro e tempo di esposizione necessario per l'imaging di acceptor durante FRET.
    5. Trovare una cella esprimendo il sensore di tensione con localizzazione chiaro a una struttura di interesse e far scattare un'immagine.
    6. Disegnare un ROI rettangolare per evidenziare dove candeggina e memorizzare la posizione di ROI. Avviare il time-lapse.
    7. Esaminare il set di immagini per potenziali problemi.
      1. Se ci sono salti notevoli (superiori al 10% dell'intensità iniziale) nel recupero di fluorescenza tra i fotogrammi, ridurre il tempo-passaggio tra i fotogrammi.
      2. Se c'è una significativa perdita globale di fluorescenza nel tempo (maggiore di 5-10% dell'intensità iniziale), ridurre il numero di immagini scattate post-candeggina e/o modificare le impostazioni di imaging per ridurre l'esposizione del campione alla luce.
      3. Se recupero fluorescenza non ha stabilizzato entro la fine del time-lapse, aumentare la lunghezza totale del time-lapse.
    8. Regolare di conseguenza i parametri di time-lapse e ripetere i passaggi 4.2.5 – 4.2.7 fino a quando il recupero di fluorescenza è adeguatamente catturato senza foto-danno globale al campione.

5. acquisire dati FRET-FRAP

  1. Preparare il set-up di microscopia per l'imaging di cellule vive, preferibilmente con un piatto riscaldato e obiettivo, nonché il controllo di CO2 . Permettono di equilibrare per 20 min.
    1. Per garantire la salute delle cellule imaged, mantenere la temperatura a 37 ° C nella camera di imaging. Uso una pompa peristaltica per passare umidificati 5% CO2 sopra il campione a 15 mL/min per mantenere il pH.
    2. In alternativa, se CO2 controllo non è disponibile, è possibile utilizzare live avviabile contenente HEPES per impedire variazioni di pH grande.
  2. Aprire lo strumento MDA e impostare con FRET parametri, tra cui il set di filtri differenti di imaging.
  3. Salvare questo MDA sperimentale nella cartella con il nome di MDA_FRET_Date.
  4. Impostare un altro MDA con FRAP parametri, tra cui il set di filtri diversi, le impostazioni di time-lapse e la Gazzetta di imaging per il laser di impulso dopo pre-candeggina acquisizione.
  5. Salvare questo MDA sperimentale nella cartella con il nome di MDA_FRAP_Date. Chiudere la finestra MDA.
  6. Nella barra degli strumenti nella parte superiore dello schermo, selezionare Journal | Avviare la registrazione.
  7. Aprire la finestra MDA, caricare lo stato di MDA_FRET_Date e premere Acquisisci. Caricare lo stato di MDA_FRAP_Date , quindi premere Acquisisci.
  8. Al termine dell'acquisizione, nella barra degli strumenti nella parte superiore dello schermo, selezionare Journal | Interrompere la registrazione.
  9. Salvare questa rivista sperimentale nella cartella con il nome di FRETFRAP_Date e aggiungerlo a una barra degli strumenti per un facile accesso. Chiudere la finestra MDA.
  10. Posto uno dei campioni generati delle cellule che esprimono il sensore di tensione nel porta-microscopio per l'imaging. Permettono di equilibrare per 10 min.
  11. Navigare l'esempio utilizzando l'acquisizione dell'immagine sotto Acquire | Acquisire con un'esposizione minima tempo e ND filtro per identificare le celle di interesse.
  12. Impostare l'autofocus continuo accedendo a dispositivi | Messa a fuoco. Mettere a fuoco manualmente sul campione fino a raggiungere il corretto piano di formazione immagine.
  13. Fare clic su Impostare messa a fuoco continua, attendere che il sistema regolare e fare clic su Start messa a fuoco continuo.
    Nota: Questo non è obbligatorio, ma migliora significativamente la qualità delle curve di recupero FRAP perché impedisce il campione di drifting out-of-focus.
  14. Trovare una cella esprimendo il sensore di tensione con localizzazione chiaro a una struttura di interesse e far scattare un'immagine.
  15. Disegnare un ROI rettangolare per evidenziare dove di candeggina. Memorizzare la posizione di ROI.
  16. Inizializzare il giornale di FRETFRAP_Date , che inizierà l'acquisizione di immagini FRET seguita dall'inizializzazione della FRAP time-lapse.
  17. Ripetere i passaggi 5.14-5.16 per 10-15 set di immagini vengono acquisite.
    Nota: La misura non può essere ripetuta nella stessa cella. Una volta che si verifica photobleaching, FRET dati sono inaffidabili.

6. analizzare i dati FRET-FRAP

  1. Analizzare le immagini FRET utilizzando il software di scelta.
    Nota: Esistono diversi modi per immagine e quantificare FRET61, tra cui raziometrici FRET62 e FRET indice34,35. Tuttavia, si consiglia di utilizzare le stime di FRET efficienza55,63 per l'interpretazione dei dati FRET-FRAP. Vedere la discussione per un'ulteriore esplorazione di questo argomento. Per emissione sensibilizzata e calcolo dell'efficienza FRET, software personalizzato è disponibile dal laboratorio Hoffman a https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public.
  2. Quantificare i parametri pertinenti per ogni struttura subcellulare che era sbiancato. Questo dovrebbe includere FRET Indice/efficienza e media iniziale acceptor intensità media (proporzionale alla concentrazione) ma potrebbe anche includere i parametri fisici quali la dimensione del ROI.
  3. Analizzare le immagini FRAP utilizzando il software di scelta.
    Nota: Esistono diversi modi per quantificare FRAP26,27,28,29. Principali preoccupazioni sperimentali includono contabilità per lo sbiancamento durante post-candeggina cambiamenti nell'intensità di sfondo e traslocazione di strutture subcellulari altamente dinamici, quali adesioni focali, di imaging. Sbianca le correzioni e le variazioni nell'illuminazione di sfondo può essere realizzata attraverso l'analisi delle regioni non sbiancato e non fluorescenti delle immagini. Altamente dinamici strutture subcellulari, particolarmente quelle che mostrano eccessiva crescita o smontaggio dinamica sono incompatibili con analisi FRAP standard e non dovrebbero essere analizzati. Inoltre, ci sono una varietà di modi per normalizzare i dati. Le linee guida fornite sono per l'analisi più semplice.
  4. Correggere i dati di recupero per lo sbiancamento di effetti e quindi normalizzare per pre-candeggiare intensità. Quantificare il tempo di recupero e la frazione mobile secondo la seguente equazione28,34:
    MF - (MF - Ro) e-kt
    dove MF è la frazione mobile, Ro è il recupero iniziale, e k è il tasso di recupero. Il tempo di recupero è determinato da:
    Τ1/2 = ln 2/k.
    Nota: Ci sono una varietà di pacchetti di software disponibile pubblicamente per il completamento di queste analisi64 , nonché una serie di plugin di ImageJ. Software personalizzato è disponibile dal laboratorio Hoffman a https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public. Ulteriori analisi devono essere utilizzati per le situazioni dove la diffusione colpisce la dinamica della proteina di interesse, più scale temporali sono evidenti nel recupero, o geometrie d'imbianchimento non standard sono utilizzati.

7. interpretare dati FRET-FRAP

  1. Compilare le informazioni pertinenti per ogni ROI tra cui: FRET Indice/efficienza, intensità accettore, FRAP metà tempo frazione mobile FRAP.
    Nota: Indice FRET o efficienza viene utilizzato per determinare il carico medio fra proteina all'interno il ROI. Intensità di accettore misura la concentrazione locale della proteina. Il tempo di recupero è una misura della dinamica della proteina. Un intervallo più piccolo indica più rapido turnover. FRAP mobile frazione misura la quantità di proteina all'interno il ROI che è attivamente girare. Una frazione più grande mobile indica che una percentuale maggiore di proteina all'interno il ROI è girare.
  2. Per sondare l'effetto di concentrazione locale il tasso di turnover proteico e quantità, trama FRAP frazione di metà tempo e mobile contro intensità iniziale accettore.
  3. Per sondare l'effetto di carico proteico il tasso di turnover proteico e quantità, trama FRAP frazione di metà tempo e mobile contro FRET Indice/efficienza.
    Nota: A seconda della proteina o della struttura, potrebbe anche essere interessante esaminare gli effetti dei parametri fisici quali la dimensione della struttura o eccentricità, il carico di proteine o di fatturato.

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Risultati

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FRET-FRAP si compone della combinazione di due tecniche di fluorescenza, FRET e FRAP. Come ci siamo concentrati sugli effetti del carico proteico, abbiamo usato tensione basato su FRET sensori34,46. Questi sensori sono spesso basati su un modulo composto da due proteine fluorescenti, come mTFP1 e VenusA206K, collegati da un linker flagelliform (Figura 1A) sensore di tensionamento. Quando il modulo vie...

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Discussione

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Il metodo FRAP FRET consente per la misura diretta della dinamica della proteina sensibile alla forza, una proprietà che è stato difficile sondare direttamente all'interno di cellule viventi. La sensibilità del dynamics della proteina per carico molecolare è critica alla funzione della proteina come un trasmettitore di forza o trasduttore. Caricamento è necessaria per la trasmissione di entrambi generato internamente ed esternamente applicate forze, chiamato mechanotransmission e per la conversione di tali forze in segna...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato da un premio della National Science Foundation CAREER (NSF-CMMI-14-54257) così come di sovvenzioni da parte della American Heart Association (16GRNT30930019) e il National Institutes of Health (R01GM121739-01) assegnato al Dr. Brenton Hoffman e un nazionale Science Foundation Graduate Research Fellowship assegnato a Katheryn Rothenberg. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale della NSF o NIH.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,05% tripsina-EDTAThermo Fisher25300062
16% paraformaldeideMicroscopia elettronica Scienze30525-89-4
60x Obiettivo NA1.35OlympusUPLSAPO 60XO
Soluzione antibiotica-antimicotica (100x)Gibco15240-062
Fase automatizzataPrecedenteH117EIX3
Specchio dicroico personalizzatoChroma Technology CorpT450/514rpc
Filtro di emissione mTFP1 personalizzatoChroma Technology CorpET485/20m
Filtro di eccitazione mTFP1 personalizzatoChroma Technology CorpET450/30x
Filtro di eccitazione Venus personalizzatoChroma Technology CorpET514/10x
DMEM-gfp Live Cell Visualization MediumZaffiroMC102
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma AldrichD5796con L-glutammina e bicarbonato di sodio
Siero fetale bovinoHyCloneSH30396.03
Fibronectina, Corning umano47743-654
FRAPPA Diapositiva di calibrazioneAndorfornita insieme all'unità FRAPPA
Sistema FRAPPA con 515 nm LaserAndor
Piatti al fluoro con fondo in vetroWorld Precision InstrumentsFD35
HEK293-T CellsATCCCRL-3216
bromuro di esadimetrina, polibreneSigma AldrichH9268-5G
Microscopio a fluorescenza invertitaAldrich
SoftwareSAS
Lambda 10-3 Ruote portafiltri motorizzateSutter InstrumentsLB10-NW
Lampada ad arco LambdaLS con lampadina allo xeno priva di ozono da 300 WSutter InstrumentsLS/OF30
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-027
Software MATLABMathworks
MEM Aminoacidi non essenzialiThermo Fisher11140050
sistema di microumidificazioneOlympus
MoFlo Astrios EQ Cell SorterBeckman CoulterB25982
Riscaldatore obiettivo MediumBioptechs150819-13
Soluzione salina tamponata fosfatoSigma AldrichD8537
pMD2.G Busta Plasmide Addgene12259
pRRL Regalo vettorialedal Dr. Kam Leong (Columbia University)
psPax2 Imballaggio PlasmideAddgene12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 FotocameraHamamatsu PhotonicsC11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF CentrifugaThermo Fisher75004505
Stabile Z Stage WarmerBioptechs403-1926
Filtro EmissioniVenus SemrockFF01-571/72
scientifica Sigma D6429 ad alto contenuto di glucosio Dulbecco's Modified Eagle's Olympus IX83 JMP Pro MetaMorph per Olympus Bioptechs 130708 OptiMEM Thermo Fisher 31985070

Riferimenti

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