Articolo metodologico

Digestione del fegato murino per un'analisi citofluorimetrica delle cellule endoteliali linfatiche

DOI:

10.3791/58621

⸱

7 gennaio 2019

 ,  , 
1Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus, School of Medicine, 2Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'obiettivo del presente protocollo è quello di identificare popolazioni di cellule endoteliali linfatiche all'interno del fegato usando gli indicatori descritti. Utilizziamo collagenasi IV e DNasi e una delicata macinazione del tessuto, combinato con citometria a flusso, per identificare una popolazione distinta di cellule endoteliali linfatiche.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

All'interno del fegato, i vasi linfatici si trovano all'interno della triade portale e loro funzione descritta è per rimuovere il liquido interstiziale dal fegato ai linfonodi dove possono esaminarsi gli antigeni e detriti cellulari. Siamo molto interessati a capire come il sistema vascolare linfatico potrebbe essere coinvolti nell'infiammazione e nella funzione delle cellule immuni all'interno del fegato. Tuttavia, molto poco è stato pubblicato che stabilisce protocolli di digestione per l'isolamento di cellule endoteliali linfatiche (LECs) dal fegato o marcatori specifici che possono essere utilizzati per valutare il fegato LECs su base per cella. Di conseguenza, abbiamo ottimizzato un metodo per la digestione e la macchiatura del fegato al fine di valutare la popolazione di LEC nel fegato. Siamo sicuri che il metodo descritto qui sarà utile per l'identificazione e l'isolamento di LECs dal fegato e rafforzerà la nostra comprensione di come LECs rispondere il microambiente del fegato.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il ruolo dei vasi linfatici e LECs nel fegato non è ben compreso. Mentre i vasi linfatici si trovano all'interno della triade portale del fegato1 ed espandono durante la malattia2, molto poco è capito per quanto riguarda la funzione e il fenotipo di LECs all'interno del fegato. Con la scoperta degli indicatori che si trovano principalmente il LECs3, l'importanza di queste cellule all'interno di nicchie differenti del tessuto nell'omeostasi e nella malattia riempirà una notevole lacuna nella nostra comprensione. LECs hanno un ruolo importante nel mantenimento della tolleranza periferica nel linfonodo ed in tumori metastatici interagendo direttamente con T cellule4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13. LECs nel linfonodo può promuovere l'immunità protettiva attraverso le loro interazioni con le cellule dendritiche migratori14,15,16. Di conseguenza, non ci sono più ruoli per LECs che possono essere specifici per i tessuti e le interazioni in cui sono presenti. Tuttavia, molto poco è capito circa come LECs interagiscono con le cellule immunitarie nel tessuto o funzionamento di LECs in sistemi differenti dell'organo; quindi, valutando LECs su base per cella all'interno del fegato o altri organi può portare a progressi nel come LECs programma immunità tessuto-specifica. Mentre gran parte della letteratura che si concentra sulle LEC nel fegato utilizza la microscopia per visualizzare LECs utilizzando uno o due marcatori e morfologia17, molto poco è stato fatto per valutare specificamente LECs su base dalla cella mediante citometria a flusso, anche se uno studio ha fatto valutare le differenze tra le cellule endoteliali sinusoidali del fegato (LSECs) e LECs18. Essendo in grado di analizzare popolazioni LEC nel fegato tramite flusso cytometry consente lo studio approfondito del fenotipo LEC durante la normale omeostasi o malattia.

Per valutare il LECs mediante citometria a flusso, sono necessari più marcatori di superficie. In genere, LECs sono visualizzati dall'espressione di prospero-correlati homeobox 1 (Prox-1), ricevitore 1 (LYVE1) di hyaluronan endoteliale del vaso linfatico o del ricevitore di fattore di crescita endoteliale vascolare 3 (VEGFR3) usando la microscopia. Tuttavia, nel fegato, l'espressione di questi indicatori non è limitato al LECs. Prox-1 è ampiamente espressa dagli epatociti durante lo sviluppo del fegato, rigenerazione e lesioni19, e LYVE1 e VEGFR3 sono espresse da cellule endoteliali sinusoidali epatiche18. Nel linfonodo, LECs sono identificati mediante citometria a flusso come cluster di differenziazione (CD) CD45-, CD31 + e podoplanin + (PDPN)16. Tuttavia, questo approccio è troppo minimal per isolare LECs nel fegato, poiché le cellule CD45 - CD31 + catturerà le cellule endoteliali, e la popolazione predominante delle cellule endoteliali vascolari nel fegato è LSECs. Così, altri indicatori sono necessari per distinguere la popolazione di LEC rara da abbondante popolazione di LSEC. CD16/32 (espresso da maturo LSECs18) sia CD146 (un cellula endoteliale vascolare marcatore comune che è prevalentemente espresso entro i sinusoids del fegato da cellule endoteliali sinusoidali epatiche20 con poca o nessuna espressione di linfatico cellule endoteliali21) erano marcatori candidati.

Di conseguenza, abbiamo ottimizzato un metodo per isolare e visualizzazione LECs nel fegato utilizzando tali marcatori, CD45, CD31, CD146, CD16/32 e linfatico per citometria a flusso. Descriviamo l'uso della collagenasi IV, DNasi 1 e separazione meccanica per la digestione del tessuto del fegato in una sospensione unicellulare. Inoltre descriviamo l'uso di gradienti di densità di iodixanol per l'isolamento di cellule non parenchimali (NPC) e per eliminare i detriti cellulari. Infine, utilizzando più marcatori, determinare la strategia di gating di citometria a flusso ottimale per identificare LECs dal fegato con PDPN come il marcatore predominante.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della University of Colorado Anschutz Medical Campus.

1. preparazione dei materiali

  1. Fare una soluzione di 5 mg/mL di dnasi I in tampone fosfato salino (PBS).
  2. Fai una miscela di digestione aggiungendo 5.000 U/mL di collagenasi IV ai media EHAA di clic.
  3. Riscaldare la miscela di digestione a 37 ° C per 30 min prima dell'uso.
  4. Fai un buffer di isolamento aggiungendo 4,8% albumina di siero bovino (BSA) e acido etilendiamminotetracetico 2mm (ed) a Hanks' soluzione salina (HBSS) equilibrata.
  5. Fare un tampone di lisi di globuli rossi (RBC) con l'aggiunta di cloruro di ammonio di 100 mM, 10 mM KHCO3e 0,1 mM EDTA a distillata H2O.

2. preparazione di una sospensione di singola cellula da un fegato di topo

  1. Eutanasia il mouse con CO2 e dislocazione cervicale.
  2. Spray giù il mouse con etanolo al 70% per bagnare la sua pelliccia. Perno del mouse piedi a un tavolo di dissezione.
  3. Con dissezione le forbici per tagliare la pelle di circa 1 cm sopra l'ano, facendo attenzione a tagliare solo attraverso la pelle (circa 1 mm). Tirare la pelle dal corpo con il forcipe dentato e inserire le forbici tra la pelle e il peritoneo. Aprire le forbici per separare la pelle dal peritoneum e, quindi, tagliare la pelle dall'incisione al collo.
  4. Pin la pelle alla scheda di dissezione utilizzando un pin sotto ogni braccio e sopra ogni gamba. Tirare il sac peritoneale e tagliare verso l'alto verso il collo. Afferrare i lobi del fegato e tagliare appena sotto lo sterno.
    Nota: Cura dovrebbe essere presa se qualsiasi del fegato verrà utilizzato per l'immunoistochimica (IHC).
  5. Tagliare intorno al fegato e rimuovere il fegato dal mouse e posizionarlo in 4 mL di media EHAA di clic.
  6. Usando un bisturi, tagliare il fegato in ~ 1 mm diametro pezzi.
  7. Aggiungere 500 µ l di miscela la digestione e 500 µ l della dnasi I (2 mg/mL) per il fegato.
  8. Incubare il fegato per 30 min a 37 ° C. Dopo 15 min, miscelare il liquido utilizzando una pipetta da 5 mL.
  9. Dopo 30 minuti di incubazione, è necessario trasferire il campione digerito attraverso un colino di 100 µm a una provetta conica da 50 mL.
  10. Spingere delicatamente i pezzi rimanenti attraverso il filtro con lo stantuffo della siringa 1 mL.
  11. Lavare il filtro con 5 mL di buffer di isolamento e spingere delicatamente il tessuto con il colino con il dorso di uno stantuffo da una siringa da 1 mL. Ripetere questa operazione fino a quando il filtro viene lavato con 25 mL di buffer di isolamento.
  12. Centrifugare le cellule a 400 x g per 5 min. Aspirare accuratamente il sovranatante.
  13. Risospendere il pellet con 4 mL di tampone di lisi RBC. Incubare le cellule a temperatura ambiente per 5 min.
  14. Lavare le cellule con 10 mL di buffer di isolamento e centrifugare a 400 x g per 5 min.
  15. Contare le celle su un emocitometro per determinare il conteggio completo del fegato.
  16. Risospendere le cellule in 5 mL di 20% iodixanol e strato di loro con 1 mL di PBS.
  17. Centrifugare le cellule a 300 x g per 15 min senza freno.
  18. Rimuovere lo strato tra il PBS e il iodixanol e inserirli, attraverso un filtro a 100 µm, in una nuova provetta conica 50 mL.
  19. Lavare le cellule con 10 mL di buffer di isolamento e centrifugare a 400 x g per 5 min.
  20. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 500 µ l di PBS con 2% siero bovino fetale (FBS).

3. analisi citofluorimetrica delle cellule singole dal fegato

  1. Contare le celle con un emocitometro e microscopio, utilizzando l'esclusione del blu di trypan per misurare cellule vitali. Aggiungere 10 µ l di cellule a 10 µ l di blu di trypan e immediatamente li posto su un emocitometro e contare le cellule vive (non blu) sotto un microscopio. Quindi, calcolare il numero di cellule per microlitro.
  2. Circa 5 milioni di aliquota delle cellule restanti parenchimale in un unico pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
  3. Centrifugare le cellule a 400 x g per 5 min.
  4. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 90 µ l di PBS con 2% FBS.
  5. Aggiungere anti-CD45 (1: 200), anti-CD146 (1: 200), anti-CD31 (1: 200) e PDPN (1: 200) diluito in 10 µ l di 10 x 2.4G2 o anti-CD16/32 (1: 200).
    Nota: Nessun blocco Fc (2.4G2) è stato utilizzato quando è stato utilizzato l'anticorpo anti-CD16/32-labeled.
  6. Per determinare dove devono essere impostati cancelli positivi e negativi, includere una fluorescenza meno una macchia (FMO) per ogni colore e un controllo di isotipo dell'anticorpo.
  7. Per determinare diretta contro le cellule morte, macchia con un indicatore di redditività (ad es., fantasma rosso 780). Incubare le cellule a 4 ° C per 30 min.
  8. Lavare le cellule con 100 µ l di PBS con 2% FBS.
  9. Utilizzare una piccola aliquota di cellule per regolare le impostazioni di compensazione e laser il citometro a flusso. Macchia le celle con un anticorpo per ogni fluoroforo individuo e uno senza alcun anticorpo.
    Nota: A seconda il citometro a flusso utilizzato, si dovrebbe istituire una matrice di incremento retributivo per rimuovere la sovrapposizione spettrale.
  10. Posizionare la provetta con il campione sulla sonda citometro e raccogliere e registrare tutti gli eventi.

4. analisi dei dati

  1. Guardando a dispersione laterale zona vs forward-scatter area, cancello sulle cellule "dal vivo" basato su dimensioni e granularità e attuabilità colorante indicatore.
  2. Successivamente, utilizzando CD45 brillante viola 510 e CD31 PerCp CY 5.5, cancello sulle cellule CD45 - CD31 + utilizzo dei controlli di isotipo e FMO per determinare popolazioni positivi e negativi.
  3. Infine, utilizzando CD146 v450 o CD16/32 FITC e PDPN APC, prendere il CD146 - PDPN + o CD16/32-PDPN + celle, nuovamente utilizzando controlli di isotipo e FMO, per determinare le popolazioni positivi e negativi. Queste cellule sono il LECs.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Studi analisi dei vasi linfatici del fegato hanno utilizzato principalmente immunohistochemistry per quantificare la frequenza e il diametro dei vasi linfatici nel fegato. Tuttavia, questo metodo non consente per la valutazione di LECs su una base di cella o per l'espressione di più marcatori, citochine, chemochine o fattori di trascrizione. Pertanto, abbiamo chiesto se fegato LECs potrebbero essere isolate dal fegato e valutato mediante citometria a flusso. Lavoro precedente isolando LEC...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'importanza complessiva di LECs in omeostasi immunitaria e regolamento è venuta recentemente alla luce25. Gran parte della letteratura pubblicata linfatica si concentra sulla pelle e nei linfonodi; Tuttavia, vasi linfatici si trovano in tutto il corpo26 e, così, è necessaria la nostra comprensione della loro importanza in diversi organi. Qui vi mostriamo un metodo in cui LECs nel fegato può essere studiata su una base di cella per capire meglio la loro espressione simultan...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori vorrei ringraziare il GI e programmi Immune innata di fegato per sostegno monetario di questo progetto. B.A.J.T. è anche finanziato dalla AI121209 R01.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
IrvineScientific9195
Collagenasi IVWorthington Biochemical corporationLS004188
DNasi IWorthington Biochemical corporationLS002145Deossiribonucleasi 1
OptiPrepSigma AldrichD1556Gradiente di densità Medio
V450 anti topo CD146 (clone ME-9F1)BD bioscienze562232
FITC anti topo CD146 (clone ME-9F1)Biolegend134706Fluoresceina isotiocianato (FITC)
Pacific Blue anti topo CD31 (clone 390)Biolegend102422
PerCp/Cy5.5 anti topo CD31 (clone 390)Biolegend102420Peridinina-clorofilla-Proteina cianonica 5.5 (PerCP-Cy5.5)
APC anti topo PDPN (clone 8.1.1)Biolegend127410Alloficocianina (APC), podoplanina (PDPN)
APC/Cy7 anti topo CD45 (clone 30-F11)Biolegend103116
Brilliant Violet 510 anti topo CD45 (clone 30-F11)Biolegend103138
FITC anti topo CD16/32 (clone 93)Biolegend101306Isotiocianato di fluoresceina (FITC)
PerCp/Cy5.5 anti topo CD16/32 (clone 93)Biolegend101324Peridinina-Proteine della clorofilla-Cianina 5.5 (PerCP-Cy5.5)
fantasma 780 colorante di vitalitàTONBO biosceinces3-0865-T100
APC criceto siriano IgG (clone SHG-1)Biolegened402102
PerCp/Cy5.5 ratto IgG2a (clone RTK2758)Biolegend400531
FITC ratto IgG2 (clone eBR2a)ebioscience1-4321-80
Anti mouse LYVE1 (clone 223322)R& Sistemi DFAB2125A
anti-topo Citocheratina (clone EPR17078)abcamab181598
anti-topo F4/80 (clone Cl:A3-1)Bio-radMCA497
BSA (frazione V)FischerBP1600-100Albumina sierica bovina (BSA)
Siero di capraJackson Immunoresearch017-000-121
Siero d'asinoJackson Immunoresearch017-000-121
EDTAVWRE177Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) -per tampone di lisi dei globuli rossi
Cloruro di ammonioFischerA687-500per i globuli rossi tampone di lisi
Bicarbonato di potassioFischerP184-500per tampone di lisi dei globuli rossi
ScalpelFeather2975#21
100 μ Filtro cellulareFiltro Fischer22363549
2.4G2in house/ATCCATCC HB-197Blocco FC per inibire il legame non specifico alle cellule Fc gamma + -a base di ibridoma
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Corning21-040-CV
Hanks Soluzione salina bilanciata (HBSS)Gibco14185-052
Siero fetale bovino (FBS)Atlanta biologicalsS11550
Piastra a 96 pozzettiCorning3788
Piastra a 6 pozzettiCorning3506
50 mL conicaTrulineTR2004
15 mL conicaFalcon352196
1 mL Punta per pipetteUSA scientific1111-2721
200 &; Punta per pipetta a LUSA scientific1110-1700
10 & micro; Punta a LUSA scientific1111-3700
seriologico 10 mL pipetegreiner bio-one607107
seriologico 5 mL pipetegreiner bio-one606107
Incubatore cellulareFischerHeracell 160i
BD FacsCanto II citometroBD biosciences
Centrifuga clinicaBeckman modello di coltroX-14R
Rosso

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tanaka, M., Iwakiri, Y. Lymphatics in the liver. Current Opinion in Immunology. 53, 137-142 (2018).
  2. Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis. The American Journal of Pathology. 151 (1), 169-175 (1997).
  3. Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
  4. Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
  5. Cohen, J. N., et al. Tolerogenic properties of lymphatic endothelial cells are controlled by the lymph node microenvironment. PLoS One. 9 (2), e87740(2014).
  6. Rouhani, S. J., et al. Roles of lymphatic endothelial cells expressing peripheral tissue antigens in CD4 T-cell tolerance induction. Nature Communications. 6, 6771(2015).
  7. Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).
  8. Dubrot, J., et al. Lymph node stromal cells acquire peptide-MHCII complexes from dendritic cells and induce antigen-specific CD4(+) T cell tolerance. Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1153-1166 (2014).
  9. Hirosue, S., et al. Steady-state antigen scavenging, cross-presentation, and CD8+ T cell priming: a new role for lymphatic endothelial cells. Journal of Immunology. 192 (11), 5002-5011 (2014).
  10. Lund, A. W., et al. VEGF-C promotes immune tolerance in B16 melanomas and cross-presentation of tumor antigen by lymph node lymphatics. Cell Reports. 1 (3), 191-199 (2012).
  11. Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
  12. Swartz, M. A. Immunomodulatory roles of lymphatic vessels in cancer progression. Cancer Immunology Research. 2 (8), 701-707 (2014).
  13. Dietrich, T., et al. Cutting edge: lymphatic vessels, not blood vessels, primarily mediate immune rejections after transplantation. Journal of Immunology. 184 (2), 535-539 (2010).
  14. Kedl, R., et al. Migratory Dendritic Cells acquire archived antigen from Lymphatic Endothelial Cells for antigen presentation during lymph node contraction. Nature Communications. 8, 2034(2017).
  15. Kedl, R. M., Tamburini, B. A. Antigen archiving by lymph node stroma: A novel function for the lymphatic endothelium. European Journal of Immunology. 45 (10), 2721-2729 (2015).
  16. Tamburini, B. A., Burchill, M. A., Kedl, R. M. Antigen capture and archiving by lymphatic endothelial cells following vaccination or viral infection. Nature Communications. 5, 3989(2014).
  17. Yokomori, H., et al. Lymphatic marker podoplanin/D2-40 in human advanced cirrhotic liver--re-evaluations of microlymphatic abnormalities. BMC Gastroenterology. 10, 131(2010).
  18. Nonaka, H., Tanaka, M., Suzuki, K., Miyajima, A. Development of murine hepatic sinusoidal endothelial cells characterized by the expression of hyaluronan receptors. Developmental Dynamics. 236 (8), 2258-2267 (2007).
  19. Dudas, J., et al. Prospero-related homeobox 1 (Prox1) is a stable hepatocyte marker during liver development, injury and regeneration, and is absent from "oval cells". Histochemistry and Cell Biology. 126 (5), 549-562 (2006).
  20. Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
  21. Amatschek, S., et al. Blood and lymphatic endothelial cell-specific differentiation programs are stringently controlled by the tissue environment. Blood. 109 (11), 4777-4785 (2007).
  22. Huang, L., Soldevila, G., Leeker, M., Flavell, R., Crispe, I. N. The liver eliminates T cells undergoing antigen-triggered apoptosis in vivo. Immunity. 1 (9), 741-749 (1994).
  23. Shay, T., Kang, J. Immunological Genome Project and systems immunology. Trends in Immunology. 34 (12), 602-609 (2013).
  24. Li, B., et al. Adult Mouse Liver Contains Two Distinct Populations of Cholangiocytes. Stem Cell Reports. 9 (2), 478-489 (2017).
  25. Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity. Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2016).
  26. Olszewski, W. L. The lymphatic system in body homeostasis: physiological conditions. Lymphatic Research and Biology. 1 (1), discussion 21-14 11-21 (2003).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Cellule endoteliali linfatiche epaticheProtocollo di digestione del fegatoIsolamento vascolare stromaleSeparazione per gradiente di densitLisi dei globuli rossiColorazione per la podoplaninaCD45 negative CD31 positiveProvette per citometria a flussoColorante marcatore di vitalit

Articoli correlati