L'obiettivo del presente protocollo è quello di identificare popolazioni di cellule endoteliali linfatiche all'interno del fegato usando gli indicatori descritti. Utilizziamo collagenasi IV e DNasi e una delicata macinazione del tessuto, combinato con citometria a flusso, per identificare una popolazione distinta di cellule endoteliali linfatiche.
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Articolo metodologico
Digestione del fegato murino per un'analisi citofluorimetrica delle cellule endoteliali linfatiche
In questo articolo
Sommario
Abstract
All'interno del fegato, i vasi linfatici si trovano all'interno della triade portale e loro funzione descritta è per rimuovere il liquido interstiziale dal fegato ai linfonodi dove possono esaminarsi gli antigeni e detriti cellulari. Siamo molto interessati a capire come il sistema vascolare linfatico potrebbe essere coinvolti nell'infiammazione e nella funzione delle cellule immuni all'interno del fegato. Tuttavia, molto poco è stato pubblicato che stabilisce protocolli di digestione per l'isolamento di cellule endoteliali linfatiche (LECs) dal fegato o marcatori specifici che possono essere utilizzati per valutare il fegato LECs su base per cella. Di conseguenza, abbiamo ottimizzato un metodo per la digestione e la macchiatura del fegato al fine di valutare la popolazione di LEC nel fegato. Siamo sicuri che il metodo descritto qui sarà utile per l'identificazione e l'isolamento di LECs dal fegato e rafforzerà la nostra comprensione di come LECs rispondere il microambiente del fegato.
Introduzione
Il ruolo dei vasi linfatici e LECs nel fegato non è ben compreso. Mentre i vasi linfatici si trovano all'interno della triade portale del fegato1 ed espandono durante la malattia2, molto poco è capito per quanto riguarda la funzione e il fenotipo di LECs all'interno del fegato. Con la scoperta degli indicatori che si trovano principalmente il LECs3, l'importanza di queste cellule all'interno di nicchie differenti del tessuto nell'omeostasi e nella malattia riempirà una notevole lacuna nella nostra comprensione. LECs hanno un ruolo importante nel mantenimento della tolleranza periferica nel linfono....
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Protocollo
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della University of Colorado Anschutz Medical Campus.
1. preparazione dei materiali
- Fare una soluzione di 5 mg/mL di dnasi I in tampone fosfato salino (PBS).
- Fai una miscela di digestione aggiungendo 5.000 U/mL di collagenasi IV ai media EHAA di clic.
- Riscaldare la miscela di digestione a 37 ° C per 30 min prima dell'uso.
- Fai un buffer di isolamento aggiungendo 4,8% albumina di siero bovino (BSA) e acido etilendiamminotetracetico 2mm (ed) a Hanks' s....
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Risultati
Studi analisi dei vasi linfatici del fegato hanno utilizzato principalmente immunohistochemistry per quantificare la frequenza e il diametro dei vasi linfatici nel fegato. Tuttavia, questo metodo non consente per la valutazione di LECs su una base di cella o per l'espressione di più marcatori, citochine, chemochine o fattori di trascrizione. Pertanto, abbiamo chiesto se fegato LECs potrebbero essere isolate dal fegato e valutato mediante citometria a flusso. Lavoro precedente isolando LEC.......
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Discussione
L'importanza complessiva di LECs in omeostasi immunitaria e regolamento è venuta recentemente alla luce25. Gran parte della letteratura pubblicata linfatica si concentra sulla pelle e nei linfonodi; Tuttavia, vasi linfatici si trovano in tutto il corpo26 e, così, è necessaria la nostra comprensione della loro importanza in diversi organi. Qui vi mostriamo un metodo in cui LECs nel fegato può essere studiata su una base di cella per capire meglio la loro espressione simultan.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori vorrei ringraziare il GI e programmi Immune innata di fegato per sostegno monetario di questo progetto. B.A.J.T. è anche finanziato dalla AI121209 R01.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Irvine | Scientific | 9195 | |
| Collagenasi IV | Worthington Biochemical corporation | LS004188 | |
| DNasi I | Worthington Biochemical corporation | LS002145 | Deossiribonucleasi 1 |
| OptiPrep | Sigma Aldrich | D1556 | Gradiente di densità Medio |
| V450 anti topo CD146 (clone ME-9F1) | BD bioscienze | 562232 | |
| FITC anti topo CD146 (clone ME-9F1) | Biolegend | 134706 | Fluoresceina isotiocianato (FITC) |
| Pacific Blue anti topo CD31 (clone 390) | Biolegend | 102422 | |
| PerCp/Cy5.5 anti topo CD31 (clone 390) | Biolegend | 102420 | Peridinina-clorofilla-Proteina cianonica 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| APC anti topo PDPN (clone 8.1.1) | Biolegend | 127410 | Alloficocianina (APC), podoplanina (PDPN) |
| APC/Cy7 anti topo CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| Brilliant Violet 510 anti topo CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103138 | |
| FITC anti topo CD16/32 (clone 93) | Biolegend | 101306 | Isotiocianato di fluoresceina (FITC) |
| PerCp/Cy5.5 anti topo CD16/32 (clone 93) | Biolegend | 101324 | Peridinina-Proteine della clorofilla-Cianina 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| fantasma 780 colorante di vitalità | TONBO biosceinces | 3-0865-T100 | |
| APC criceto siriano IgG (clone SHG-1) | Biolegened | 402102 | |
| PerCp/Cy5.5 ratto IgG2a (clone RTK2758) | Biolegend | 400531 | |
| FITC ratto IgG2 (clone eBR2a) | ebioscience | 1-4321-80 | |
| Anti mouse LYVE1 (clone 223322) | R& Sistemi D | FAB2125A | |
| anti-topo Citocheratina (clone EPR17078) | abcam | ab181598 | |
| anti-topo F4/80 (clone Cl:A3-1) | Bio-rad | MCA497 | |
| BSA (frazione V) | Fischer | BP1600-100 | Albumina sierica bovina (BSA) |
| Siero di capra | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Siero d'asino | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| EDTA | VWR | E177 | Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) -per tampone di lisi dei globuli rossi |
| Cloruro di ammonio | Fischer | A687-500 | per i globuli rossi tampone di lisi |
| Bicarbonato di potassio | Fischer | P184-500 | per tampone di lisi dei globuli rossi |
| Scalpel | Feather | 2975#21 | |
| 100 μ Filtro cellulare | Filtro Fischer | 22363549 | |
| 2.4G2 | in house/ATCC | ATCC HB-197 | Blocco FC per inibire il legame non specifico alle cellule Fc gamma + -a base di ibridoma |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Hanks Soluzione salina bilanciata (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Atlanta biologicals | S11550 | |
| Piastra a 96 pozzetti | Corning | 3788 | |
| Piastra a 6 pozzetti | Corning | 3506 | |
| 50 mL conica | Truline | TR2004 | |
| 15 mL conica | Falcon | 352196 | |
| 1 mL Punta per pipette | USA scientific | 1111-2721 | |
| 200 &; Punta per pipetta a L | USA scientific | 1110-1700 | |
| 10 & micro; Punta a L | USA scientific | 1111-3700 | |
| seriologico 10 mL pipete | greiner bio-one | 607107 | |
| seriologico 5 mL pipete | greiner bio-one | 606107 | |
| Incubatore cellulare | Fischer | Heracell 160i | |
| BD FacsCanto II citometro | BD biosciences | ||
| Centrifuga clinica | Beckman modello di coltro | X-14R |
Riferimenti
- Tanaka, M., Iwakiri, Y. Lymphatics in the liver. Current Opinion in Immunology. 53, 137-142 (2018).
- Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis. The ....
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Ristampe e permessi
