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Articolo metodologico

Fluorimetrica tecniche per la valutazione delle membrane degli spermatozoi

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DOI:

10.3791/58622

⸱

28 novembre 2018

 , 
1Animal Sperm Research Center, Department of Animal Sciences, Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Hebrew University of Jerusalem, 2Department of Animal Sciences, Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Hebrew University of Jerusalem

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo le metodologie per valutare l'integrità della membrana di spermatozoan, una cellulare caratteristica associata con competenza di fertilizzazione dello sperma. Descriviamo tre tecniche per la valutazione di fluorimetrico delle membrane degli spermatozoi: macchiatura simultanea con sonde fluorescenti specifiche, microscopia a fluorescenza e citometria a flusso di sperma-dedicato avanzate. Inoltre vengono presentati esempi di combinazione delle metodologie.

Abstract

Spermiograms standard che descrivono la qualità dello sperma sono principalmente basati sui parametri fisiologici e visual, come il volume di liquido seminale e concentrazione, motilità e motilità progressiva e morfologia degli spermatozoi e vitalità. Tuttavia, nessuna di queste valutazioni è abbastanza buona per predire la qualità dello sperma. Dato che il mantenimento della vitalità degli spermatozoi e fecondazione potenziale dipende dalla funzionalità intracellulare e l'integrità della membrana, la valutazione di questi parametri potrebbe consentire una migliore previsione di competenza di fertilizzazione dello sperma. Qui, descriviamo tre possibili metodi per valutare la qualità dello sperma usando sonde fluorescenti specifiche combinate con analisi di citometria a flusso o microscopia di fluorescenza. Analisi ha valutato l'integrità della membrana del plasma utilizzando 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e ioduro di propidio (PI), l'integrità della membrana acrosomiale utilizzando fluoresceina isotiocianato-coniugato dell'agglutinina Pisum sativum (FITC-PSA) e l'integrità della membrana mitocondriale usando 5, 5', 6, 6'-tetra-chloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl ioduro di carbocyanine (JC-1). Combinazioni di questi metodi inoltre sono presentati. Per esempio, uso di annessina V combinato con consente di fluorocromi PI apoptosi di valutare e calcolare la percentuale di spermatozoi apoptotici (indice apoptotico). Crediamo che queste metodologie, che si basano sull'esame di membrane di spermatozoo, sono molto utili per la valutazione della qualità dello sperma.

Introduzione

L'integrità e la funzionalità delle membrane degli spermatozoi sono alcuni dei fattori che indica la vitalità degli spermatozoi e potenziale di fecondazione. La membrana plasmatica agisce come una barriera tra compartimenti intracellulari ed extracellulari, mantenendo l' equilibrio osmotico cellulare1. Qualsiasi stress che induce il danno all'integrità della membrana plasmatica potrebbe alterare l'omeostasi, ridurre la capacità di fertilizzazione e redditività e aumentare la morte delle cellule. Per esempio, crioconservazione riduce la vitalità degli spermatozoi causa danni alla sua membrana plasmatica, a seguito di variazioni di temperatura e stress osmotico2. Precedentemente abbiamo segnalato che esponendo lo sperma di Toro a basse concentrazioni di contaminanti di origine alimentare come i pesticidi atrazina, suo principale metabolita diaminochlorotriazine o l'aflatossina B1, la micotossina riduce sperma attuabilità1,3 . Questo è stato determinato dall'etichettatura il DNA double-stranded con DAPI in combinazione con PI, che si lega al DNA delle cellule con una membrana plasmatica danneggiata.

Reazione acrosomiale (AR) comporta la fusione della membrana acrosomiale esterna e la membrana di plasma sovrastante conseguente rilascio di enzimi acrosomiali4,5. Questi sono eventi da non mancare per penetrazione della zona pellucida e ulteriormente l'Unione dello sperma con l' ovocita6. Pertanto, la valutazione dell'integrità della membrana acrosomiale costituisce un parametro utile per valutare la qualità dello sperma e la fertilità maschile7,8,9. Parecchie tecniche fluorescenti sono utilizzabili per la verifica di integrità acrosomiale, FITC-PNA o FITC-PSA8,10. Nei nostri studi precedenti, utilizzando i modelli di FITC-PSA colorazione1,3, abbiamo fornito le definizioni precise per (i) acrosomiale intatta, (ii) danneggiato della membrana acrosomiale e (iii) ha reagito acrosomiale. Nel rapporto corrente, valutiamo lo stato acrosomiale mediante citometria a flusso di sperma-dedicato e confrontare i risultati con quelli utilizzando la microscopia a fluorescenza.

I mitocondri sono organelli multifunzionali coinvolti in, tra le altre cose, ATP sintesi, produzione di specie reattive dell'ossigeno, segnalazione del calcio e apoptosi. Disfunzioni fisiologiche, tra cui l'infertilità maschile e femminile, sono associate con la funzione mitocondriale alterata11. I mitocondri dello sperma sono disposti nel midpiece e svolgono un ruolo cruciale in spermatozoi motilità12. È ben accettato che potenziale di membrana mitocondriale alta (ΔΨm) è associata con normale motilità e fertilizzazione alta capienza13. Al contrario, ΔΨm basso è associato con un livello elevato di specie reattive dell'ossigeno e ridotto tasso di fertilizzazione14. Tuttavia, vari composti ambientali, per esempio gli interferenti endocrini, possono indurre stress cellulare e portare a un aumento transitorio nel ΔΨm, hyperpolarization1,3, aumentata produzione di radicali liberi e, infine, apoptosi15. La sonda fluorescente 5, 5', 6, 6'-tetra-chloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl ioduro di carbocyanine (JC-1) consente, ad esempio, esaminare gli effetti delle tossine di origine alimentare sul sperma ΔΨm1,3.

Spermiograms standard, basato su parametri fisiologici e morfologici, non sono abbastanza buone predire la qualità dello sperma. Metodi più accurati sono tenuti a garantire la qualità dello sperma. Qui, forniamo fattibile due metodi per determinare la qualità dello sperma sulla base delle valutazioni delle membrane degli spermatozoi: colorazione quadrupla simultanea con sonde fluorescenti specifiche e microscopia a fluorescenza, descritto nei nostri studi1,3 e citometria a flusso di sperma-dedicato avanzate, recentemente utilizzato nel nostro laboratorio e già utilizzato da altri16,17,18.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati effettuati conformemente agli orientamenti israeliano 1994 per il benessere animale. Sperma di bovini è stato fornito da società commerciale israeliana per inseminazione artificiale e l'allevamento. Eiacula di 11 tori sono stati valutati in questo studio.

1. preparazione del campione di sperma

Nota: La procedura è basata sul protocollo1,3 di laboratorio Roth.

  1. Prelevare circa 1 – 6 mL di sperma del Toro in una provetta da 15 mL a temperatura ambiente.
  2. Per ogni 1 mL di liquido seminale, aggiungere 6 mL di tampone NKM preriscaldata (a 37 ° C) (110 mM NaCl, 5 mM KCl, MOPS 20 mM [acido 3-N-morphilino propansolfonico; pH 7.4]) e centrifugare per 8 min a x 600 g, 1 – 2 volte fino a quando il surnatante è chiara.
    Nota: Se la concentrazione dello sperma o il volume iniziale è molto elevato, diviso in due tubi al primo lavaggio.
  3. Immediatamente rimuovere e scartare il supernatante chiaro e lasciare circa 1 cm del surnatante sopra il pellet.
  4. Appoggiare con cura i tubi ad un angolo di 30° per aumentare la superficie per gli spermatozoi di nuotare fino e attendere 20-30 min per consentire gli spermatozoi di nuotare fino a 37 ° C.
    Nota: Torbidità può essere visto.
  5. Utilizzando una micropipetta con attenzione, rimuovere il superiore 1 mL del surnatante contenente gli spermatozoi mobili in una nuova provetta da 1,5 mL.
  6. Mantenere lo sperma a 37 ° C fino all'utilizzo.
  7. Stimare il numero di spermatozoi utilizzando un emocitometro Neubauer.
    Nota: È invece possibile utilizzare una camera di conteggio differente, ma il conteggio è diverso.
    1. Per evitare qualsiasi movimento dello spermatozoo, diluire 100 µ l degli spermatozoi motili con 10 mL di acqua distillata doppia (DDW) (diluizione 1: 100) in una provetta da 15 mL e mescolare delicatamente.
    2. Caricare 10 µ l di campione in ciascun lato dell'emocitometro e vetrino coprioggetti. Assicurarsi di evitare la formazione di bolle all'interno della camera come questo può provocare un numero di spermatozoi imprecise.
    3. Osservare sotto un microscopio con un obiettivo X 20.
      Nota: La griglia completa su un emocitometro contiene 9 grandi piazze, ciascuna di 1 mm2, e il coprioggetto riposa 0,1 mm sopra il pavimento della camera. Così, il volume sopra la zona centrale di conteggio è di 0,1 mm3 o 0,1 µ l. Zona centrale dell'emocitometro contiene 25 quadrati medi e ogni quadrato medio ha 16 piazze più piccole con linee singole.
    4. Contare il numero totale di cellule che si trovano in 4 quadrati di angolo medio e la piazza centrale. Per una maggiore precisione, conta due camere (entrambi i lati dell'emocitometro Neubauer) e utilizzare la media per calcolare la concentrazione cellulare.
    5. Calcolare il numero di spermatozoi moltiplicando il numero medio ottenuto da 5 (per ottenere il numero di cellule per la zona di conteggio) e da 10.000 (per ottenere il numero di cellule per 1 mL del campione diluito). Quindi moltiplicare il numero ottenuto per il fattore di diluizione (1: 100).
      Nota: Ad esempio, un numero medio di spermatozoi contati in 5 dei 25 quadrati medi all'interno dell'area centrale di conteggio di due alloggiamenti è 150 ([152 + 148] / 2). Così, il numero medio di spermatozoi per camera (o per 0,1 µ l) è 150 x 5 = 750. Moltiplicare 750 di 10.000 per ottenere il numero di cellule per 1 mL del campione diluito (7.500.000) e poi moltiplicare per 100 (fattore di diluizione) per ottenere 75 x 107 cellule per mL di campione di seme originale.

2. tecnica #1: Valutazione simultanea delle membrane degli spermatozoi utilizzando più fluorescente sonde

Nota: Membrane degli spermatozoi (plasma, acrosomale e mitocondriale) sono state valutate come precedentemente descritto da Celeghini et al.10, con alcune modifiche. Epifluorescente microscopia è stata usata, combinato con una videocamera digitale con eccitazione a 450-490 nm ed emissione a 515-565 nm utilizzando un triplo filtro.

  1. Preparare soluzioni di riserva.
    1. Preparate 0,1 mg/mL soluzione stock DAPI sciogliendo 5 mg di DAPI in 50 mL di tampone fosfato salino (PBS). Aliquote di 50 µ l di preparare e conservare a-20 ° C. Prima dell'uso, diluire la soluzione di riserva con PBS alle 01:10 (soluzione di lavoro; 10 µ g/mL).
    2. Preparare 1 mg/mL soluzione stock FITC – PSA sciogliendo 1mg di FITC – PSA in 1 mL di PBS. Aliquote di 50 µ l di preparare e conservare a-20 ° C. Prima dell'uso, diluire la soluzione di riserva con PBS alle 01:10 (soluzione di lavoro; 100 µ g/mL).
    3. Preparare soluzione madre 1 mg/mL JC-1 sciogliendo 1 mg di JC-1 in 1 mL di solfossido dimetilico (DMSO). Aliquote di 10 µ l di preparare e conservare a-20 ° C. Prima dell'uso, diluire la soluzione di riserva con DMSO alle 01:10 (soluzione di lavoro; 0,1 mg/mL).
    4. Preparare la soluzione di riserva di PI sciogliendo 10 mg di PI in 400 µ l di PBS (dando 2,5 mg/mL). Conservare a + 4 ° C. Diluire il magazzino 1 con PBS alle 01:20 (soluzione di lavoro; 0,125 mg/mL). Conservare a + 4 ° C come una soluzione di riserva.
      Attenzione: PI è un potenziale mutageno e deve essere maneggiato con cura. Il colorante deve essere smaltito in modo sicuro e in conformità alle normative locali vigenti.
  2. Trasferire 133 µ l degli spermatozoi mobili (passo 1.5) in una nuova provetta da 1,5 mL (25 x 106 spermatozoi/mL).
    Nota: Se la concentrazione del campione è superiore, diluirlo nel buffer NKM per raggiungere la concentrazione necessaria; Se la concentrazione del campione delle swim up campione è inferiore, centrifugare il sopranatante ottenuto dopo il nuoto fino a 1.000 x g per 5 min, rimuovere 0,5 mL del surnatante e contare di nuovo lo sperma.
  3. 17 µ l di DAPI (soluzione di lavoro) e incubare per 10 min a 37 ° C.
  4. Centrifugare a 1.000 x g per 5 min e scartare il surnatante.
  5. Per il pellet, aggiungere 100 µ l di tampone NKM.
  6. Aggiungere 50 µ l di coniugato – PSA, 2 µ l di JC-1 e 3 µ l di PI (soluzioni di lavoro) e incubare per 10 min a 37 ° C.
  7. Centrifugare a 1.000 x g per 5 min e rimuovere il surnatante.
  8. Per il pellet, aggiungere 40 µ l di tampone NKM e risospendere pipettando.
  9. Trasferire 10 µ l di campione a un vetrino, sbavatura e il vetrino coprioggetti.
  10. Visualizzare immediatamente di epifluorescenza (uso obiettivo 40x) con un triplo filtro, dotato di una fotocamera digitale e acquisire un'immagine separatamente per ciascun filtro.
    Nota: Non c'è alcun significato all'ordine dei filtri visualizzati.
    1. Visualizzare sotto il canale DAPI con eccitazione a 358 nm ed emissione a 461 nm.
    2. Visualizzare sotto canale FITC per verde monomeri con eccitazione a 450-490 nm ed emissione a 515 – 565 nm.
    3. Visualizzare sotto il canale di PI per aggregati rossi con eccitazione a 488 nm ed emissione a 590 nm.
    4. Visualizzare sotto JC-1 rossi aggregati con eccitazione a 559 nm e delle emissioni nella gamma di 574 – 627 nm; JC-1 verde monomeri con eccitazione a 488 nm ed emissione nel range di 500 – 535 nm.
  11. Unire le tre immagini ricevute dai filtri in formato JPG/JPEG, utilizzando l'opzione "Unisci" del software della fotocamera.
  12. Aprire l'immagine unita con lo strumento "Paint" e utilizzare l'opzione pennello per contrassegnare gli spermatozoi contati.
  13. Classificare gli spermatozoi basati sulla fluorescenza emessa da ogni sonda:
    1. In generale valutare almeno 200 spermatozoi per vetrino — tutte le cellule appaiono blue (DAPI).
    2. Valutare la fattibilità contando le cellule morte, che appaiono viola (PI [rosso] + [Blu] DAPI) e calcolare la percentuale di cellule morte (dead cellule/totale contato cellule x 100).
    3. Valutare lo stato acrosomiale utilizzando il pattern di colorazione fluorescente (FITC – PSA). Calcolare le percentuali dei modelli differenti (acrosoma intatto, danneggiate o reagito cellule/totale contato cellule x 100).
      Nota: Membrana acrosomiale danneggiata viene visualizzato come un cappuccio acrosomiale completamente macchiati, verde; ha reagita membrana acrosomiale Mostra residuo verde equatoriale o superiore colorazione; celle contenenti membrana acrosomiale intatta non esporrà qualsiasi colorazione verde della regione acrosomiale.
    4. Valutare ΔΨm distinguendo gli spermatozoi con alta ΔΨm, che esibiscono un midpiece macchiato di rosso e gli spermatozoi con basso ΔΨm che esibiscono un midpiece macchiato di verde. Conte Rosso e verde midpieces separatamente e calcolare il loro rapporto (rosso/verde).

3. tecnica #2: Valutazione delle membrane degli spermatozoi con kit pronti per l'uso e citometria a flusso

Nota: Valutazione dell'integrità della membrana plasmatica, l'integrità di membrana acrosomiale e potenziale di membrana mitocondriale è stato effettuato con kit di citometria a flusso di ready-to-use contenenti liofilizzati fluorocromi in ciascun pozzetto. La procedura è stata eseguita secondo i costruttori con alcune modifiche.

  1. Valutazione dell'integrità della membrana plasmatica
    1. Prendere il numero desiderato di pozzetti dal pacchetto del kit vitalità e concentrazione (PI e SYbr14), trasferiscili sulla base di lavoro e coprire con un coperchio flessibile (proteggere dalla luce).
    2. 199 µ l di soluzione tamponata per citometria per pozzetto.
    3. Aggiungere 1 µ l di liquido seminale omogeneo a 57 x 106/ml (57.000 cellule per pozzetto) e omogeneizzare pipettando.
    4. Coprire la piastra con il coperchio nero.
    5. Incubare per 10 min a 37 ° C al riparo dalla luce.
    6. Eseguire l'esempio attraverso il citometro a flusso con la 'vitalità' impostazione.
  2. Potenziale di membrana mitocondriale
    1. Prendere il numero desiderato di pozzetti dal pacchetto di attività mitocondriale kit (JC-1), trasferiscili sulla base di lavoro e coprire con un coperchio flessibile (proteggere dalla luce).
    2. Aggiungere 10 µ l di etanolo assoluto per pozzetto e pipettare per risospendere la polvere presente all'interno del pozzo.
    3. Aggiungere 190 µ l di PBS e omogeneizzare pipettando.
    4. Aggiungere 0,75 µ l di sperma omogeneo a 57 x 106/ml (50.000 cellule per pozzetto) e omogeneizzare pipettando.
    5. Coprire la piastra con il coperchio nero.
    6. Incubare per 30 min a 37 ° C al riparo dalla luce.
    7. Eseguire l'esempio attraverso il citometro a flusso con l'attività di ʽmitochondrial di impostazione '.
  3. Integrità della membrana acrosomiale
    Nota: FITC – PSA colorazione (Vedi tecnica #1) consente la valutazione delle 3 categorie acrosomiale (acrosoma intatto, reazione acrosomiale e danneggiato acrosomiale). Utilizzando il kit di integrità di acrosomiale (PI e FITC – PNA) e di attuabilità & citometro a flusso, gli spermatozoi sono separati in queste 3 categorie.
    1. Prendere il numero desiderato di pozzetti dal pacchetto di attuabilità & acrosomiale kit di integrità, trasferiscili sulla base di lavoro e coprire con un coperchio flessibile (proteggere dalla luce).
    2. Aggiungere 200 µ l di soluzione tamponata per citometria per pozzetto.
    3. Aggiungere 0,7 µ l di sperma omogeneo a 57 x 106/ml (40.000 cellule per pozzetto) e omogeneizzare pipettando.
    4. Coprire la piastra con il coperchio nero.
    5. Incubare per 45 min a 37 ° C al riparo dalla luce.
    6. Eseguire l'esempio attraverso il citometro a flusso con l'impostazione ʽInCyte'.
    7. Analizzare l'istogramma risultante di gating tre aree del marcatore secondo l'intensità di fluorescenza, che rappresentano le cellule trascurabile, che reagiscono basso con acrosoma intatto, senza macchia (R1), che reagiscono basso cellule con residuo macchiato parte del acrosomiale (R2) e cellule altamente fluorescenti con acrosoma perturbato (R3).
      Nota: Utilizzare la sezione "analisi dei file acquisiti utilizzando altri moduli" nella Guida dell'utente di strumento al fine di creare le tre regioni (R1, R2, R3).

4. tecnica #3: Valutazione delle membrane degli spermatozoi, utilizzando sonde fluorescenti e citometria a flusso

Nota: Uso di annessina V combinato con consente di fluorocromi PI apoptosi di valutare e calcolare la percentuale di spermatozoi apoptotici (indice apoptotico).

  1. Preparare 1 x Annessina V associazione buffer da 20x soluzione madre (diluire 500 µ l di tampone di associazione V 20 x soluzione di riserva con 9,5 mL di acqua distillata sterile di annexin).
  2. Stimare il numero di spermatozoi utilizzando un emocitometro Neubauer come descritto nella sezione 1.7.
  3. Lavare 106 spermatozoi in 1 mL di 1x Annessina V associazione buffer e centrifugare a 300 x g per 10 min.
  4. Aspirare il supernatante completamente.
  5. Risospendere il pellet in 100 µ l di 1x annessina buffer obbligatorio V.
  6. Aggiungere 10 µ l di annessina V coniugato di FITC.
  7. Mescolare bene e incubare per 15 minuti al buio a temperatura ambiente.
  8. Lavare gli spermatozoi aggiungendo 1 mL di buffer obbligatorio 1 x Annessina V per 106 cellule e centrifugare a 300 x g per 10 min.
  9. Aspirare il supernatante completamente.
  10. Risospendere il pellet cellulare in 500 µ l di buffer obbligatorio 1 x Annessina V per 106 cellule totale.
  11. Aggiungere 1 µ g/mL PI immediatamente prima dell'analisi con un citometro a flusso.
  12. Eseguire l'esempio attraverso il citometro a flusso impostato su ʽInCyte'.

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Risultati

Figura 1 spettacoli fluorimetrica simultanea valutazione delle membrane degli spermatozoi (plasma, acrosomale e mitocondriale) usando PI, DAPI, FITC-PSA e JC-1. Valutazione delle membrane dello sperma usando la macchiatura simultanea con quattro sonde fluorescenti permette, ad esempio, valutare la percentuale di spermatozoi in ogni categoria — live vs morti; alta vs bassa ΔΨm; intatto vs. danneggiato acrosomiale — contemporaneamente...

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Discussione

Potenziale di fertilizzazione dello sperma dipende da molteplici fattori che riflettono la sua qualità. Un'alta concentrazione di spermatozoi e un'alta percentuale di spermatozoi mobili altamente progressivamente potrebbe essere considerati la qualità dello sperma. Tuttavia, tale valutazione non prendere in considerazione altri parametri cellulari e funzionali. L'uso di 'Banco' microcapillary citometro a flusso può essere facilmente adattato alla valutazione delle varie strutture di sperma usando sonde fluorescenti, come...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano che non esistono senza conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Gli autori vorrei ringraziare la società israeliana "SION" per inseminazione artificiale e l'allevamento (Hafetz Haim, Israele) per il loro aiuto e la cooperazione e la sig. ra Li Na (IMV Technologies, L'Aigle, Francia) per assistenza con la messa in funzione e la formazione.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
NaClSigmaS5886
KClSigmaP5405
MOPS [acido 3-N-morfilino propansulfonico]SigmaM1254
PBSSigmaP5493
DMSOSigmaD2438
Etanolo assolutoSigma64-17-5
EmatocitometroNeubauer Germaniaemocitometro
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilidolo)SigmaD9542sonda
fluorescente PI (ioduro di propidio)SigmaP4170sonda fluorescente
FITC-PSA (fluoresceina isotiocianato-coniugato Pisum sativum agglutinina)SigmaL0770sonda
fluorescenteJC-1 (5,5',6,6'-tetra-cloro-1,1',3,3'-tetraetilbenzimidazolil carbocianina ioduro)ENZOBiochem, New York, NY, USAENZ52304sonda fluorescente
Annexin V coniugata a FITCMACS, Miltenyi Biotec130-093-060sonda fluorescente
Annexin V tampone legante 20x soluzione madreMACS, Miltenyi Biotec130-092-820tampone
Nikon Eclipse, TE-2000-uNikon, Tokyo, Giapponemicroscopio a fluorescenza invertita
Nis Elements Nikon, Tokyo, Giapponesoftware
Nikon DXM1200FNikon, Tokyo, Giapponefotocamera digitale
Guava EasyCyte PlusIMV Technologies, L'Aigle, Franciacitometro a flusso microcapillare per spermatozoi
CytoSoftGuava Technologies Inc., Hayward, CA, Stati Uniti; distribuito dal software IMV Technologies
Soluzione tampone per citometriaIMV Technologies, L'Aigle, Francia023862tampone
vitalità e concentrazioneIMV Technologies, L'Aigle, FranciaKit di 024708per la valutazione della vitalità
Kit di attività mitocondrialeIMV Technologies, L'Aigle, FranciaKit di 024864per attività mitocondriale kit
vitalità e integrità dell'acrosomiaIMV Technologies, L'Aigle, Francia025293kit per la valutazione dell'integrità dell'acrosomia
JMP-13SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, software USA
Sperma bovino"SION", azienda israeliana per l'inseminazione artificiale e il dreeding, Hafetz-Haim, Israele
Kit di di

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