Costruzione di un foglio di multistrato delle cellule staminali mesenchimali con un sistema di cultura dinamica 3D

Summary

Questo articolo fornisce un metodo efficiente e fattibile per la costruzione di fogli multistrato sulle cellule staminali con proprietà favorevoli della cellula formativa.

Abstract

Terapia della cellula formativa Mostra un promettente futuro nella rigenerazione di tessuti e organo danneggiato, e la tecnica di foglio di cella è stata sviluppata per migliorare la conservazione delle cellule basse e scarsa sopravvivenza all'interno della zona di destinazione. Tuttavia, durante il processo di costruzione di in vitro , è urgente una soluzione per il mantenimento delle cellule staminali bioattività e aumentando la quantità di cellule all'interno del foglio di cella. Qui, questo protocollo presenta un metodo per la costruzione di un foglio di celle multistrato con cellule staminali favorevole bioattività e un'operatività ottima. Pericardio porcino decellularizzato (DPP) è preparato dalla fosfolipasi un metodo di decellularizzazione₂ (PLA₂) come l'impalcatura di strato delle cellule e cellule staminali mesenchimali di ratto del midollo osseo (BMSC) sono isolate e ampliate come cellule del seminato. La struttura del foglio temporaneo celle multistrato è costruita usando RAD16-ho peptide idrogel. Infine, strato di cellule è coltivato con un sistema di perfusione dinamica per stabilizzare la struttura tridimensionale (3D) e strato di cellule poteva essere ottenuto seguendo una 48 ore di coltura in vitro. Questo protocollo fornisce un metodo efficiente e fattibile per la costruzione di un foglio di multistrato sulle cellule staminali, e strato di cellule potrebbe essere sviluppato come un prodotto di terapia della cellula formativa favorevole in futuro.

Introduction

Terapia con cellule staminali è stata segnalata come un efficace trattamento per molte malattie; Tuttavia, cella bassa ritenzione e scarsa sopravvivenza all'interno della zona di destinazione rimangono questioni critiche dopo l'iniezione di cellule staminali tradizionale. Per risolvere questo problema, tessuto ingegneria gli scienziati hanno sviluppato la tecnica del foglio di cella. Un foglio monostrato cellulare con intatto della matrice extracellulare in primo luogo è stato preparato utilizzando la risposta di temperatura cultura piatto¹e relativi studi di follow-up segnalato i miglioramenti significativi di conservazione delle cellule staminali e la sopravvivenza all'interno il colpito da infarto zona^2,3. Tra i metodi, costruendo il foglio di celle multistrato è stata segnalata come una strategia efficace per migliorare la sopravvivenza delle cellule e la cella foglio effetto terapeutico^3,4. Da allora, gli scienziati hanno lavorato sullo sviluppo di metodi di costruzione del foglio differenti delle cellule al fine di aumentare la quantità di cellule, cellule staminali proprietà e proprietà meccaniche dei fogli delle cellule. Finora, alcuni tipi di strato delle cellule sono stati costruiti e studiati nel trattamento di infarto miocardico⁵, cartilagine ferita⁶, e la pelle ferita⁷.

La bioattività delle cellule staminali prima di trapianto ha mostrato un'influenza emergente sulla rigenerazione del tessuto danneggiato e cellula diverse strategie di costruzione di foglio hanno effetti diversi sulle cellule staminali. Da un lato, strati delle cellule confluenti consistevano soltanto di cellule staminali ad alta densità e matrici extracellulari naturale potrebbero essere acquistati da impilamento monostrato cellulare fogli⁸ o utilizzando tessuto magnetico Ingegneria tecniche⁹. D'altra parte, i ricercatori hanno sviluppato diverse impalcature per fornire un'adeguata resistenza meccanica e supporto delle cellule crescita^10,11,12, che ha permesso una cellula staminale bassa densità per garantire la nutrizione di semina fornitura. Tuttavia, nonostante questi approcci, la fornitura di basso efficiente nutrizione all'interno della struttura di strato di celle multistrato rimane delle principali preoccupazioni durante la costruzione in vitro . Di conseguenza, un sistema di costruzione del foglio delle cellule efficiente e fattibile è urgentemente necessario.

Questo protocollo descrive i passaggi per preparare un foglio di cellula staminale (MSC) multilayeredmesenchymal. In questo sistema di costruzione, la resistenza meccanica del foglio di cella è fornita da un DPP. Basato su questa impalcatura, struttura cellulare 3D può essere rapidamente costruita con RAD16-io idrogel peptidici e un sistema di perfusione dinamica viene utilizzata per il foglio di celle multistrato, al fine di stabilizzare la struttura del foglio di cella 3D e fornire sufficiente nutrizione della coltura approvvigionamento per le cellule. Utilizzando questo sistema, un foglio BMSC multistrato è stato preparato correttamente e ha esibito un effetto terapeutico ottimale il ratto infarto miocardico modello¹³.

Protocol

Tutte le cellule staminali e procedure di esperimento sugli animali sono state condotte secondo le linee guida etiche della guida nazionale per la cura e l'uso di animali da laboratorio e approvate dal comitato di uso (Guangzhou, Cina) e Jinan University Animal Care.

1. preparazione dell'impalcatura DPP con il PLA₂ decellularizzazione metodo¹⁴

Nota: Vedere Figura 1A per un disegno schematico del metodo di decellularizzazione₂ PLA.

1. Preparare 100 mL di soluzione di₂ 200 U/mL PLA. Aggiungere 0,5 g di sodio desossicolato e 2 mL di PLA₂ in 198 mL di soluzione tampone di carbonato. Questa soluzione deve essere usata entro 24 ore dopo la preparazione.
2. Ottenere il pericardio porcino fresco (FPP) da macello e restituire al laboratorio entro 1 h.
   Nota: La FPP deve essere conservata a 4 ° C durante il trasporto. Passaggi: 1.2-1.10 dovrebbero essere condotta con continua agitazione in un bagno di acqua termostatata.
3. Lavare accuratamente la FPP con 200 mL di soluzione tampone fosfato (PBS) contenente 1% di penicillina-streptomicina in un becher da 500 mL a 10 ° Cfor 10 min ripetere questo passaggio x 2.
4. Dividere la FPP in due strati e rimuovere il tessuto adiposo con pinze e le forbici.
   Nota: Tenere la FPP bagnato con l'aggiunta di 50 mL di PBS ogni 20 min durante la rimozione del tessuto adiposo.
5. Modellare la FPP 10x10 cm² pezzi con le forbici. Lavare la FPP con 200 mL di soluzione tampone di carbonato (CBS) contenente 1% di penicillina-streptomicina in un becher da 500 mL a 10 ° C per 10 min. Ripetere questo passaggio x 2.
6. Trasferire la FPP per acqua pura e inzupparlo a 10° C per 12 h.
7. Immergere i campioni di² cm 10x10 in 50 mL di CBS contenente 200 U/mL PLA₂ e 0,5% (p/v) sodio desossicolato soluzione a 37 ° C per 6 h.
8. Lavare i campioni con CBS contenente 1% di penicillina-streptomicina a 10 ° C per 10 min. Ripetere questo passaggio x 2.
9. Immergere ogni campione in 50 mL di CBS contenente 200 U/mL PLA₂ e 0,5% (p/v) sodio desossicolato soluzione a 37 ° C per 2 h.
10. Lavare i campioni con CBS contenente 1% di penicillina-streptomicina a 10 ° C per 2 h. Ripetere questo passaggio per 10 volte almeno. I campioni su piatti piani e asciugarli fino a peso costante nel forno a temperatura costante a 55 ° C.
    Nota: Il campione deve essere asciugata completamente. Pesare il campione DPP ogni 10 min e ripetere 3 volte o fino a quando il peso non cambia.
11. Forma ogni campione DPP in un cerchio di 10,5 mm di diametro con un trapano. Confezione ogni DPP in un sacchetto sigillato sterile.
12. Sterilizzare i campioni DPP a raggi gamma (25 kGy). Memorizzati i campioni DPP a 4 ° C prima dell'uso.
    Nota: Tutti i campioni possono essere conservati fino a sei mesi a 4 ° C.

2. preparazioni per la cella foglio costruzione

1. Autoclave tutti gli strumenti e i componenti di vettore del tessuto a 121 ° C per 30 min, compresi i tubi centrifughi di 1,5 mL, pinze, pinze, forbici, a denti nero basi (componente portante del tessuto) e anelli di tensione bianco (componente portante del tessuto).
2. Preparare 20 mL di soluzione di saccarosio di 10% privo di germi. Peso 2 g di saccarosio e sciogliere il saccarosio in 18 mL di acqua ultrapura. Sterilizzare in autoclave la soluzione di saccarosio al 10% a 121 ° C per 30 min o filtro la soluzione con un filtro da 0,22 µm.
3. Autoclave i dispositivi di sistema dinamico di aspersione a 121 ° C per 30 min, compreso un gas cambio attrezzature, una bottiglia di vetro da 500 mL, un contenitore di cultura di aspersione e i tubi di tessuto connettivi.
4. Preparare gli strumenti sterilizzati in autoclave e tessuto componenti del vettore. Mettere la parte nera di base dell'elemento portante del tessuto in una piastra di coltura.
5. Pick up un'impalcatura DPP secca e metterlo al centro della base nera. Mettere un anello bianco di tensionamento sul patibolo DPP e fissarlo nell'elemento portante del tessuto.
   Nota: Assicurarsi l'impalcatura è totalmente fisso nell'elemento portante del tessuto e non c'è nessuno spazio tra la base nera e l'anello di tensione bianco. In caso contrario, separare il vettore di tessuto e fissare nuovamente il patibolo.
6. Aggiungere 100 µ l di terreno di coltura sul patibolo DPP per reidratazione.
   Nota: Se l'impalcatura non viene risolto anche nel supporto del tessuto, il terreno di coltura si infiltrano la piastra di coltura.
7. Mettere l'impalcatura in un incubatore a 37 ° C e lasciare in ammollo per 15 min.

3. preparazione delle cellule per cella foglio costruzione

Nota: Questo protocollo è per la coltura cellulare usando un piatto di 100 mm. Per una schematica della costruzione della struttura celle multistrato, vedere Figura 1B .

1. Isolare le BMSC¹³.
   Nota: Questo metodo è progettato per la costruzione di un strato di cellule MSC multistrato. Ratto BMSC sono utilizzati nel presente protocollo. Le BMSC sono isolati utilizzando il metodo aderente intero midollo osseo, e le BMSC sono espanse in vitro per ottenere sufficienti quantità di cellule.
   1. Autoclave gli strumenti a 121 ° C per 30 min, tra cui pinze, pinze dentate e forbici. Preparare una siringa da 2 mL per iniezione e terreno di coltura BMSC (Dulbecco modificato dell'Aquila medio [DMEM], 10% siero bovino fetale, glutamina 1% e 1% di penicillina-streptomicina).
   2. Eutanasia i ratti maschii di Sprague-Dawley (deviazione standard) di tre-settimana-vecchio dalla dislocazione della vertebra cervicale. Immergere l'animale in 100 mL di soluzione di alcool di 75% in un becher per 5 min.
   3. Prendere l'animale fuori il becher e posizionarlo incline sul tavolo operatorio. Incidere la pelle sul dorso dell'animale con forbici e pinze. Isolare i tessuti della pelle e del muscolo per esporre i femori di coscia.
   4. Isolare i femori di coscia e metterlo in 30 mL di PBS in una provetta da centrifuga 50 mL. Inserire due femori di coscia in una provetta. Vortexare la provetta da centrifuga per lavare il tessuto. Ripetere questo passaggio x 2.
   5. Entrambe le estremità dei femori di tagliare con le forbici ed esporre la cavità del midollo.
   6. Aspirare 2 mL di terreno di coltura BMSC con una siringa di iniezione. Inserire l'ago nella cavità del midollo e scovare il midollo osseo con terreno di coltura. Scovare ogni femori due coscia in una piastra di coltura di 100 mm.
   7. Per ogni piatto di cultura di 100mm, aggiungere 2 mL di terreno di coltura nella piastra di coltura. Mettere la piastra di coltura in incubatore a 37 ° C e coltura statica per 72 h.
   8. Togliere la piastra di coltura dall'incubatrice. Sostituire il surnatante con 6 mL di terreno di coltura fresco.
   9. Osservare BMSCs primario sotto un microscopio. In seguito, passaggio le BMSC ogni 5-7 gg.
2. Prendere le cellule fuori dell'incubatrice. Osservare le cellule al microscopio e scegliere celle adatte per costruzione di strato delle cellule. Quando le BMSC raggiungere confluenza di 80% - 90%, le cellule possono essere scelti come le cellule seminate.
3. Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra di coltura. Lavare delicatamente le cellule con 2 mL di PBS caldo. Rimuovere tutti i PBS dalla piastra di coltura e rendere sicuro no liquidi resti. Aggiungere 2 mL di tripsina 0,25% (o un'altra soluzione di dissociazione) al piatto e incubare a 37 ° C per 3 min.
4. Fermare l'effetto della tripsina aggiungendo 2 mL di terreno di coltura e lavare delicatamente le cellule dal piatto. Trasferire la sospensione cellulare in una nuova provetta da centrifuga da 15 mL. Centrifugare le cellule a 225 x g per 5 min.
5. Eliminare il surnatante. Risospendere le cellule con 3 mL di soluzione di saccarosio al 10% (p/v).
   Nota: soluzione di saccarosio al 10% (p/v) viene utilizzato per lavare le cellule per ottenere un impasto uniforme delle cellule-idrogel nei passaggi seguenti.
6. Aspirare 10 µ l di sospensione cellulare e contare il numero di cellulare con un emocitometro. Calcolare il volume necessario per il passaggio successivo. Per foglio di una cella, vengono utilizzati BMSCs 3 milioni.
7. Estrarre le cellule 3 milioni e trasferirli in una provetta da centrifuga da 15 mL nuovo. Centrifugare le cellule a 225 x g per 5 min.
8. Eliminare il surnatante. Risospendere le cellule con 1 mL di soluzione di saccarosio al 10% (p/v). Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 1,5 mL.
   Nota: Utilizzando un tubo da centrifuga 1,5 mL è utile per preparare la miscela di cella-idrogel.
9. Centrifugare le cellule a 260 xg per 5 minuti completamente rimuovere il supernatante e ottenere il sedimento cellulare.

4. preparazione delle BMSC e il RAD16-ho miscela peptidica Hydrogel

Nota: Vedere Figura 1B per una schematica della costruzione della struttura celle multistrato.

1. Aggiungere 20 µ l di soluzione di saccarosio al 10% (p/v) per il tubo centrifugo 1.5 mL. Risospendere le BMSC delicatamente e ottenere una sospensione uniforme.
   Nota: Non generare eventuali bolle durante la risospensione.
2. Aggiungere 20 µ l di RAD16-ho peptide idrogel nella parte superiore della sospensione. Mescolare delicatamente il RAD16-io sospensione delle cellule e del peptide con la punta della pipetta. Quando la sospensione cellulare e idrogel sono mescolati insieme, pipettare delicatamente l'impasto un paio di volte.
3. Estrarre l'impalcatura DPP da parte del vettore di tessuto e aspirare delicatamente il terreno di coltura con un puntale.
   Nota: Accertarsi che l'impalcatura DPP è completamente reidratato prima di aggiungere la miscela di cella-idrogel.
4. Aspirare la miscela e uniformemente aggiungerlo al patibolo DPP.
   Nota: Il volume totale della miscela sarebbe circa 40-50 µ l. Si consiglia di aggiungere la miscela 10 µ l in un momento dal centro verso l'esterno dell'impalcatura.
5. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura alla parte inferiore dell'elemento portante del tessuto. Mettere il foglio di cella nell'incubatore 37 ° C per 5 min.
6. Prendere il foglio delle cellule dall'incubatrice. Delicatamente aggiungere 4 mL di terreno di coltura nella piastra di coltura e immergere il foglio delle cellule. Mettere il foglio di cella nell'incubatore 37 ° C per 2 h di coltura statica.

5. cultura in Vitro di un foglio di celle multistrato 3D utilizzando un sistema di cultura dinamica

Nota: Vedere Figura 1 per una schematica del sistema dinamico 3D.

1. Preparare il sistema di perfusione dinamici, tra cui una pompa peristaltica, apparecchiature di scambio di gas, una bottiglia di vetro da 500 mL, un contenitore di cultura di aspersione e i tubi di tessuto connettivi. Assemblare il sistema di perfusione dinamica come mostrato nella Figura 2.
2. Aggiungere 200 mL di terreno di coltura per la bottiglia di vetro sterile. Inserire il foglio delle cellule nella camera del contenitore di cultura.
   Nota: Prestare attenzione alla direzione della superficie superiore dello strato di cellule.
3. Aggiungere 3 mL di terreno di coltura nel contenitore del tessuto e chiudere il contenitore. Mettere il sistema dinamico di aspersione nell'incubatrice e avviare la pompa. Impostare la portata della pompa peristaltica a 8 mL/min cultura strato di cellule nel sistema dinamico di perfusione per 48 h.

6. ottenere un strato di cellule MSC multistrato

1. Autoclave gli strumenti e i componenti di vettore del tessuto a 121 ° C per 30 min, inclusi tubi centrifughi 1,5 mL, forcipe e forcipe dentato.
2. Tirare fuori l'ingresso condotto dalla bottiglia di vetro per interrompere l'alimentazione di coltura per il contenitore.
   Nota: Arrestare la pompa peristaltica, quando il contenitore di cultura è vuoto.
3. Prendere il foglio di cella dal contenitore di cultura e metterlo in una piastra di coltura.
4. Utilizzare una pinza per immobilizzare il vettore di tessuto e un altro forcipe dentato per separare l'anello bianco dalla base nera. Infine, ottenere strato di cellule BMSCs multistrato.
5. Per breve conservazione, ogni strato di cellule possa essere trasferito a un tubo centrifugo 1.5 mL con il forcipe. L'impalcatura DPP deve essere collegato alla parete interna del tubo centrifugo, e strato di cellule dovrebbe diffondere quanto più possibile la provetta da centrifuga.
6. Delicatamente aggiungere 1 mL di terreno di coltura nel tubo centrifugo da immergere il foglio delle cellule. Chiudere il tappo del tubo centrifugo e memorizzare strato di cellule a 4 ° C.
   Nota: Strato di cellule dovrebbe essere trapiantato o analizzato quanto prima. Si consiglia di utilizzare il foglio di cella all'interno di 4 h.

Results

Lo schema della costruzione foglio multistrato sulle cellule staminali è illustrato nella Figura 1. Preparando il patibolo di foglio di cella dal metodo di decellularizzazione di PLA₂ è il primo passo. Basato sul patibolo, una struttura temporanea delle cellule 3D è costruita mescolando le cellule staminali con l'idrogel di peptide RAD16-1. Al fine di ottenere un foglio di celle multistrato con cellule staminali favorevole bioattività e ottima resi...

Discussion

Il presente protocollo segnala un metodo efficiente per la costruzione di un foglio multistrato di MSC. Questo strato di cellule presenta resistenza meccanica ottima, cell ad alta densità di semina e bioattività favorevole sulle cellule staminali. Utilizzando BMSCs come esempio, la struttura cellulare 3D rapidamente costruita con RAD16-io del peptide idrogel. Dopo in coltura nel sistema dinamico di aspersione, il foglio BMSC multistrato è ottenuto con successo e le BMSC mantenere un'alta espressione di marcatori di cellu...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fosfolipasi A2	Sigma-Aldrich	P6534
Sodio desossicolato	Sigma-Aldrich	D6750-100G
Tampone fosfato	Gibco BRL	89033
Penicillina streptomicina / amfotericina	Gibco BRL	15640055
Buffer bicarbonato	Sigma-Aldrich	C3041
Concentratore da tavolo	Changzhou Aohua Instrument Co.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Corning Cellgro	10-014-CVR
Siero fetale bovino sudamericano	Gibco BRL	10270-106 / P30-3302
L-Glutammina	Corning Cellgro	25-005-CI
0,25% Tripsina / 2,21 mM EDTA	Corning Cellgro	25-053-CI
Armadio di biosicurezza	Esco, Singapore	AC2-2S1
Incubatore a temperatura costante...	Esco,Singapore	CLS-170B-8
Provetta da centrifuga	Corning	430790
Tubo EP	Axygen	31617934
Macchina centrifuga	TOMOS	1-16R
Saccarosio	Sigma-Aldrich	S9378-500G
Pura Matrix	BD	354250
Sistema di coltura a perfusione dinamica	Minucells e Minutissue	D-93077
Pompa peristaltica	Ismatec	IPC N8
Tubo pompa	Ismatec	Nr.1306
MINUSHEET 1300	Componenti del supporto tissutale	di Ratisbona
MINUSHEET	Regensburg
MINUSHEET 0006	Apparecchiature per lo scambio di gas di	Ratisbona
MINUSHEET 0002	Regensburg		da 500 mL
Contenitore per colture di perfusione MINUSHEET 1301