Articolo metodologico

Costruzione di un foglio di multistrato delle cellule staminali mesenchimali con un sistema di cultura dinamica 3D

DOI:

10.3791/58624

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20 ottobre 2018

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1Key Laboratory for Regenerative Medicine, Ministry of Education, Jinan University, 2Department of Developmental and Regenerative Biology, Jinan University, 3Nansha College Preparatory Academy, 4Department of Cardiology, First Affiliated Hospital of Jinan University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo articolo fornisce un metodo efficiente e fattibile per la costruzione di fogli multistrato sulle cellule staminali con proprietà favorevoli della cellula formativa.

Abstract

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Terapia della cellula formativa Mostra un promettente futuro nella rigenerazione di tessuti e organo danneggiato, e la tecnica di foglio di cella è stata sviluppata per migliorare la conservazione delle cellule basse e scarsa sopravvivenza all'interno della zona di destinazione. Tuttavia, durante il processo di costruzione di in vitro , è urgente una soluzione per il mantenimento delle cellule staminali bioattività e aumentando la quantità di cellule all'interno del foglio di cella. Qui, questo protocollo presenta un metodo per la costruzione di un foglio di celle multistrato con cellule staminali favorevole bioattività e un'operatività ottima. Pericardio porcino decellularizzato (DPP) è preparato dalla fosfolipasi un metodo di decellularizzazione2 (PLA2) come l'impalcatura di strato delle cellule e cellule staminali mesenchimali di ratto del midollo osseo (BMSC) sono isolate e ampliate come cellule del seminato. La struttura del foglio temporaneo celle multistrato è costruita usando RAD16-ho peptide idrogel. Infine, strato di cellule è coltivato con un sistema di perfusione dinamica per stabilizzare la struttura tridimensionale (3D) e strato di cellule poteva essere ottenuto seguendo una 48 ore di coltura in vitro. Questo protocollo fornisce un metodo efficiente e fattibile per la costruzione di un foglio di multistrato sulle cellule staminali, e strato di cellule potrebbe essere sviluppato come un prodotto di terapia della cellula formativa favorevole in futuro.

Introduzione

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Terapia con cellule staminali è stata segnalata come un efficace trattamento per molte malattie; Tuttavia, cella bassa ritenzione e scarsa sopravvivenza all'interno della zona di destinazione rimangono questioni critiche dopo l'iniezione di cellule staminali tradizionale. Per risolvere questo problema, tessuto ingegneria gli scienziati hanno sviluppato la tecnica del foglio di cella. Un foglio monostrato cellulare con intatto della matrice extracellulare in primo luogo è stato preparato utilizzando la risposta di temperatura cultura piatto1e relativi studi di follow-up segnalato i miglioramenti significativi di conservazione delle cellule stami....

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Protocollo

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Tutte le cellule staminali e procedure di esperimento sugli animali sono state condotte secondo le linee guida etiche della guida nazionale per la cura e l'uso di animali da laboratorio e approvate dal comitato di uso (Guangzhou, Cina) e Jinan University Animal Care.

1. preparazione dell'impalcatura DPP con il PLA2 decellularizzazione metodo14

Nota: Vedere Figura 1A per un disegno schematico del metodo di decellularizzazione2 PLA.

  1. Preparare 100 mL di soluzione di2 200 U/mL PLA. Aggiungere 0,5 g di sodio desossicolato ....

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Risultati

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Lo schema della costruzione foglio multistrato sulle cellule staminali è illustrato nella Figura 1. Preparando il patibolo di foglio di cella dal metodo di decellularizzazione di PLA2 è il primo passo. Basato sul patibolo, una struttura temporanea delle cellule 3D è costruita mescolando le cellule staminali con l'idrogel di peptide RAD16-1. Al fine di ottenere un foglio di celle multistrato con cellule staminali favorevole bioattività e ottima resi.......

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Discussione

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Il presente protocollo segnala un metodo efficiente per la costruzione di un foglio multistrato di MSC. Questo strato di cellule presenta resistenza meccanica ottima, cell ad alta densità di semina e bioattività favorevole sulle cellule staminali. Utilizzando BMSCs come esempio, la struttura cellulare 3D rapidamente costruita con RAD16-io del peptide idrogel. Dopo in coltura nel sistema dinamico di aspersione, il foglio BMSC multistrato è ottenuto con successo e le BMSC mantenere un'alta espressione di marcatori di cellu.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato dal National Natural Science Foundation della Cina (concessione numero 31771064); la scienza e la tecnologia pianificazione progetto della provincia di Guangdong (sovvenzione numeri 2013B010404030, 2014A010105029 e 2016A020214012); la scienza e la tecnologia pianificazione progetto di Guangzhou (concessione numero 201607010063); e l'innovazione dello studente non laureato e il programma di formazione all'imprenditorialità (concessione numero 201610559028); la National Science Foundation per giovani scienziati della Cina (grant numero 31800819).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Fosfolipasi A2Sigma-AldrichP6534
Sodio desossicolatoSigma-AldrichD6750-100G
Tampone fosfatoGibco BRL89033
Penicillina streptomicina / amfotericinaGibco BRL15640055
Buffer bicarbonatoSigma-AldrichC3041
Concentratore da tavoloChangzhou Aohua Instrument Co.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Corning Cellgro10-014-CVR
Siero fetale bovino sudamericano Gibco BRL10270-106 / P30-3302
L-GlutamminaCorning Cellgro25-005-CI
0,25% Tripsina / 2,21 mM EDTACorning Cellgro25-053-CI
Armadio di biosicurezzaEsco, SingaporeAC2-2S1
Incubatore a temperatura costante...Esco,SingaporeCLS-170B-8
Provetta da centrifuga Corning430790
Tubo EPAxygen31617934
Macchina centrifugaTOMOS1-16R 
SaccarosioSigma-AldrichS9378-500G
Pura Matrix BD354250
Sistema di coltura a perfusione dinamicaMinucells e MinutissueD-93077
Pompa peristalticaIsmatecIPC N8
Tubo pompaIsmatecNr.1306
MINUSHEET 1300 Componenti del supporto tissutaledi Ratisbona
MINUSHEETRegensburg 
MINUSHEET 0006Apparecchiature per lo scambio di gas diRatisbona
MINUSHEET 0002Regensburgda 500 mL
Contenitore per colture di perfusione MINUSHEET 1301 
KT20183 Sistema di perfusione dinamica   Bottiglia di vetro

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nature Medicine. 12 (4), 459-465 (2006).
  2. Narita, T., et al.

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