Misurazione del metabolismo energetico in tessuto retinico Explanted usando l'analisi di flusso extracellulare

Sommario

Questa tecnica viene descritto la registrazione in tempo reale del consumo di ossigeno e tassi di acidificazione extracellulare nei tessuti retinici explanted del mouse utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare.

Abstract

Alta acuità visione è un processo fortemente che consumano energia, e la retina ha sviluppato diversi adattamenti unici per soddisfare proprio queste esigenze pur mantenendo la trasparenza dell'asse visivo. Perturbazioni di questo delicato equilibrio causano malattie accecante, quali la retinopatia diabetica. Di conseguenza, la comprensione dei cambiamenti di metabolismo energetico nella retina durante la malattia è indispensabile per lo sviluppo di terapie razionali per varie cause di perdita di vison. Il recente avvento di analizzatori di flusso extracellulare commercialmente disponibile ha reso più accessibile lo studio del metabolismo energetico della retina. Questo protocollo descrive l'uso di un tal analizzatore per misurare contributi all'approvvigionamento energetico della retina attraverso le braccia due principio - fosforilazione ossidativa e la glicolisi - quantificando le variazioni dei tassi di consumo di ossigeno (OCR) ed extracellulari tariffe di acidificazione (ECAR) come proxy per queste vie. Questa tecnica viene eseguita prontamente in tessuto retinico explanted, facilitando la valutazione delle risposte agli agenti farmacologici multipli in un singolo esperimento. Metaboliche firme in retine da animali carenti asta del fotoricettore segnalazione sono confrontate ai comandi di selvaggio-tipo utilizzando questo metodo. Una limitazione importante in questa tecnica è la mancanza di capacità di discriminare tra l'utilizzazione di energia luce-adattato e scuro-adattato, una considerazione importante fisiologica in tessuto retinico.

Introduzione

La retina è tra i tessuti più esigente di energia nel sistema nervoso centrale¹. Come la maggior parte dei tessuti, che genera l'adenosina trifosfato (ATP) tramite la glicolisi nel citosol o tramite fosforilazione ossidativa nei mitocondri. La convenienza energetica di fosforilazione ossidativa sopra glicolisi per produrre ATP da una molecola di glucosio è chiara: 36 molecole di ATP generato dal ex vs 2 molecole di ATP generata da quest'ultimo. Di conseguenza, neuroni retinici dipendono principalmente dalla respirazione mitocondriale per l'approvvigionamento energetico e questo si riflette dalla loro alta densità di mitocondri². Ancora, la retina anche dipende fortemente dalle macchine glicolitica anche quando l'ossigeno è abbondante. Questo processo di glicolisi aerobica è stata originariamente descritta in cellule tumorali di Otto Warburg³, che una volta ha notato che la retina era il solo post-mitotico tessuto capace di questa forma di metabolismo⁴. Da tali osservazioni iniziali, molti tessuti post-mitotici sono stati descritti per impegnarsi in vari gradi di glicolisi oltre alla fosforilazione ossidativa per soddisfare le loro richieste di ATP.

Fototrasduzione, pigmento visivo, riciclaggio, biosintesi di segmenti esterni del fotoricettore ed attività sinaptica sono tutti i processi di energia esigente nei fotorecettori, la sottoclasse predominante di un neurone nella retina. Ma la necessità di trasportare attivamente gli ioni contro loro elettrico e gradienti di concentrazione è di gran lunga il processo più energico che richiede in neuroni¹. Fotorecettori sono neuroni peculiari nel senso che essi sono depolarizzate in assenza di stimolazione (cioè, al buio), considerando che uno stimolo luminoso innesca la chiusura del canale e successive hyperpolarization. Di conseguenza, al buio, la retina consuma grandi quantità di ATP per mantenere sua depolarizzazione o "corrente di buio", come viene comunemente chiamato. Dal punto di vista adattativo, una sfida importante nella fornitura di queste vaste quantità di ATP è la necessità di organismi mantenere la chiarezza visiva attraverso l'asse ottico. L'architettura retinica invertito visto in creature moderni è la soluzione dominante, come mantiene la fitta rete capillare fornitura fotorecettori lontano dal percorso della luce. Ma questa meraviglia di Bioingegneria naturale mette la retina a un precipizio in termini di riserva metabolica. Anche i piccoli insulti alla retina potenzialmente possono compromettere il delicato equilibrio di energia offerta alla domanda, e la disfunzione visiva o cecità frank può seguire rapidamente.

Date le richieste energetiche uniche della retina neurale, accoppiato con la sua limitazione stretto di rifornimento vascolare, misura accurata del consumo di ATP in retina e i suoi cambiamenti durante la malattia potrebbe avere profonde implicazioni nella comprensione e nel trattamento condizioni accecante come retinite pigmentosa e retinopatia diabetica. Tradizionalmente, queste misure richiedono attrezzature costose, personalizzati con maggior parte degli studi emergenti da una manciata di laboratori interamente dedicati alle misure di attività metabolica^{2,5,6, 7,8}. Le tecniche includono singoli saggi per specifici metaboliti, gli studi di tracciante usando radio-marcato precursori, consumo di ossigeno registrazione utilizzando elettrodi di Clark e metabolomica profilatura⁹.

Con gli avanzamenti nella tecnologia ad alta velocità e una maggiore disponibilità di dispositivi commerciali, tecniche per registrare metabolismo retinico sono sempre più accessibile e conveniente. Il metodo qui descritto misura entrambi fosforilazione ossidativa e la glicolisi in retina utilizzando espiantati tessuto e un flusso extracellulare reperibile analizzatore^9,10,11,12. Questo analizzatore registra separatamente tasso di consumo di ossigeno (OCR) e il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR), che servono come indicatori indiretti di fosforilazione ossidativa e la glicolisi, rispettivamente¹³. Queste misure sono fatte da una sonda immersa all'interno di un microchamber creato sopra il tessuto di interesse. Questo adattamento dei metodi precedentemente pubblicati utilizza una piastra di acquisizione originariamente progettata per gli isolotti di Langerhans per registrare l'attività metabolica in piccole, circolare sezioni della retina di topo. Esposizioni multiple farmacologiche possono essere consegnate al tessuto nel corso di una singola registrazione perché il sistema contiene ben 4 porte di iniezione per ogni campione. Utilizzando questo sistema con distinti protocolli ottimizzati per registrazioni ECAR e OCR, le risposte delle retine di selvaggio-tipo possono essere paragonate a retine carente transducina (Gnat1^{- / -}), delle cause di cecità notturna congenita stazionaria in gli esseri umani¹⁴.

Protocollo

Protocolli di seguirono l'associazione per la ricerca in visione e Oftalmologia istruzione per l'uso degli animali e sono stati approvati dall'Università di Washington.

1. animale preparazione

1. Tenere animali in custodia standard con 12 ore di buio per ciclo di 12 ore di luce. Begin esperimenti presso standardizzata volte per evitare effetti circadiani, in genere al mattino poco dopo si accenderanno le luci.

2. soluzione preparazione

1. Preparare il supporto di base sciogliendo 8,4 mg di polvere media bidistillata H₂O (ddH₂O) e regolare il pH a 7.4 con HCl o NaOH, ad un volume finale di 1 L. filtro sterilizzare questa soluzione con un filtro di coltura del tessuto da 0,22 µm.
   1. Aggiungere 1 M del glucosio e del piruvato di sodio 100 mM ai media per ottenere le concentrazioni finali di glucosio di 5 mM e 1 mM piruvato.
   2. Posto un'aliquota di 50 mL di base media in bagnomaria a 37 ° C.
2. Preparare la soluzione di Lisi, per la quantificazione del tessuto alla fine dell'analisi del flusso, aggiungendo tris base a 10mm, polietilene glicole etere di tert-octylphenyl allo 0,2% (v/v) ed EDTA a 1 mM, tutte in ddH₂Mix O. fino a quando tutti i componenti completamente dissolto e regolare pH a 8.0.
3. Per il protocollo di sforzo mitocondriale, preparare un brodo di 11 µM di oligomycin, un inibitore di trifosfato di adenosina Synthase, disciolto in base media di indirizzare una concentrazione finale di 1 µM nel pozzo. Preparare un brodo di 11 µM del cianuro di carbonile - 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), un agente disgiungente, disciolto in base media di indirizzare una concentrazione finale di 1 µM nel pozzo. Preparare un cocktail di inibitori della catena di trasporto degli elettroni, rotenone e antimycin A (RAA) aggiungendo rotenone 11 µM e antimycin A 22 µM, disciolto in base media di indirizzare una concentrazione finale di 1 µM rotenone e 2 µM antimycin A nel bene.
4. Per il protocollo di glicolisi, preparare un brodo di 220 mM di glucosio disciolto in media base, a una concentrazione finale di 20 mM nel pozzo di destinazione. Anche preparare uno stock di 1,1 M di 2-deoxyglucose (2DG), un inibitore competitivo di glucosio e glicolitica antagonista, scioglierlo in base media. Questo sarà destinato a una concentrazione finale di 100 mM 2-DG nel pozzo.

3. strumento taratura

1. Per calibrare la strumentazione per l'analisi di un flusso extracellulare, aggiungere 1 mL di soluzione di calibrazione in ciascun pozzetto della cartuccia sensore (in totale 24 pozzetti) e incubare a 37 ° C in un CO₂-free incubatore durante la notte (o almeno 8 h).
2. Caricare gli additivi per il protocollo di sforzo mitocondriale o la glicolisi in ciascuna porta iniettore, da A D, la cartuccia sensore, regolazione per variazioni di volume nel pozzo.
   Nota: Ad esempio, un dosaggio tipico includerebbe 45 µ l di un additivo alla prima porta iniettore, 49,5 µ l nella seconda, 54,5 µ l nel terzo e 60 µ l nell'ultimo, assumendo un volume iniziale di ben 450 µ l.
3. Durante i primi esperimenti diversi, caricare i supporti base nel porto A misurare quanto tessuto movimento/manufatto si verifica dopo un'iniezione di Porto.
4. Fate la piastra sensore caricato Incubare a 37 ° C in un incubatore non-CO₂ per almeno 60 min.

4. isolamento del tessuto retinico Mouse fresco

Nota: Questo passaggio è adattato dalla tecnica del Dr. Barry Winkler¹⁵.

1. Dopo aver somministrato l'anestesia profonda usando un cocktail di chetamina/xilazina standard, eutanasia topi di dislocazione cervicale.
2. Utilizzare un paio di pinze curve medie per afferrare il globo posteriore al nervo ottico e applicare una leggera pressione in avanti per proptose l'occhio (Figura 1A).
   1. Con una lama di rasoio pulita, è necessario creare un'incisione di limbus a limbus attraverso la cornea utilizzando un pass singolo, deliberato della lama.
   2. Usando bene, forcipe angolato di McPherson-stile, pizzicare il globo posteriore per esprimere la lente e membrane ialoide anteriore fuori l'incisione corneale. Eliminare questi tessuti.
   3. Ripetere la manovra pizzicare con il forcipe per esprimere la retina neurale.
   4. Utilizzando le pinze come un cucchiaio per sollevare la retina, anziché cogliere il tessuto, trasferire la retina lontano l'incisione corneale e inserire direttamente in media caldo in un piatto di 3 cm o una piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti cluster.
3. Utilizzare due paia di pinze McPherson-stile fine, angolate per sezionare delicatamente rimanente vitreo dalla retina. Questo è fatto meglio afferrando il vitroso alla periferia della Coppa retinica e tirando verso il centro, con un finale disinsertion del corpo vitreo dal centro nel suo complesso. Utilizzando le pinze, rimuovere qualsiasi epitelio pigmentato retinico residuo dalla superficie dei fotorecettori della retina.
   1. Tagliare una punta di pipetta P1000 con una lama di rasoio per creare un'apertura di ~ 4 mm per evitare inutili traumi il delicato tessuto retinico durante manovre di trasferimento.
   2. Trasferire il tessuto retinico isolato in media fresco utilizzando un taglio puntale P1000.
   3. Tagliare pugni di 1 mm della retina intorno al nervo ottico con una biopsia di 1mm punzone dotato di un pistone per sloggiare il tessuto nel caso in cui esso rimane incastrato nel foro (Figura 1B). Impostare i pugni della retina da parte nella media pulito tenuto su un blocco di 37 ° C o rilievo di riscaldamento.

5. protocollo

1. Trasferire singoli punzoni di una micropiastra di cattura dell'isolotto 24 pozzetti utilizzando una tagliata punta P1000, aspirando 450 µ l di media con il tessuto.
2. Bene, utilizzare forcipe dritto per manipolare delicatamente pugni nel centro della micropiastra. Tenere pugni orientati nella stessa direzione (ad es., lato della cellula del ganglio verso l'alto).
   1. Appoggiare la piastra di cattura su un rilievo di riscaldamento o riscaldamento insieme di blocchi a 37 ° C come questi passaggi vengono ripetuti per gli altri campioni.
      Nota: Per ogni esperimento, mettere da parte 3-4 pozzetti del bianco con 450 µ l di base media di servire come controlli negativi. Nel restante 20-21 pozzi, testare ogni replica biologica in triplice copia. Di conseguenza, ogni piastra a 24 pozzetti permetterà per la registrazione da 6-7 diversi animali o condizioni di trattamento.
3. Evitando bolle d'aria, delicatamente posizione l'isolotto catturare inserti in mesh in ciascun pozzetto usando il forcipe e fissare gli inserti con uno stantuffo di metallo, o con un taglio puntale P1000 (Figura 1 C).
   Nota: Evitare eccessivo tessuto movimento durante questo passaggio di mantenere la posizione retinica punzone all'interno del centro della microchamber di campione. Bolle d'aria falsare gravemente letture OCR. Anche se il microchamber ha una profondità adeguata per ospitare la retina di topo tipico (Figura 1), occasionalmente lavorazione-difetti negli inserti mesh possono causare tessuti diventare eccessivamente compresso durante l'inserimento di schermo. Se questo accade, semplicemente prendere nota del tessuto schiacciato ed escludere che il campione dall'analisi finale.
4. Incubare la piastra di tessuto in una di 37 ° C CO₂-gratis incubatore per almeno 60 min.
5. L'analizzatore di flusso extracellulare utilizzando Mix, attesa, misura del programma e ripetere i comandi. Ad esempio, un tipico esperimento con tessuto retinico può includere quanto segue: mescolare 2 minuti, attendere 2 minuti e misurare 5 minuti. Ripetere l'esperimento con questi tre passaggi tra 5 - 8 volte (cicli) per una registrazione di base e dopo l'iniezione di ogni composto in fase di test durante l'esecuzione.
6. Premere il pulsante di avvio del programma sull'analizzatore flux extracellulare e seguire le istruzioni sullo schermo per inserire la cartuccia di sensore per la calibrazione.
7. Al termine della calibrazione, seguire le istruzioni sullo schermo per sostituire la piastra di calibratore con la piastra che contiene i campioni della retina.
8. Consentire al programma di eseguire, come programmato. Al completamento dell'esecuzione, seguire le istruzioni sullo schermo per espellere la piastra del tessuto. Mostra i risultati dell'esecuzione e archiviare il file di dati.
9. Con un ago di calibro 20 piegato ed il forcipe, rimuovere tutti gli inserti in mesh dai pozzi, lasciando il punzone della retina.
10. Attentamente i media dal tessuto di aspirare e lavare il tessuto due volte con 0,5 mL di soluzione tampone fosfato (PBS) e freddo. Aspirare il PBS dopo il lavaggio.
11. Aggiungere 100 µ l di tampone di lisi in ciascun pozzetto e dispensare su e giù per omogeneizzare il tessuto.
12. Quantificare i livelli di input basati su totale DNA a doppia elica (dsDNA) o contenuto proteico totale.
    Nota: Di seguito si basa su un'analisi di dsDNA disponibile in commercio.
13. Diluire i campioni lisati 1:1 con l'aggiunta di 100 µ l di tampone Tris-EDTA (TE) e trasferire 100 µ l del campione diluito ad una piastra ben 96.
    1. Aggiungere 100 µ l di tampone di rilevazione in ogni pozzetto. Dopo la miscelazione per 2-5 minuti, quantitate fluorescenza dopo eccitazione a 480 nm ed emissione a 520 nm, rispetto ad una curva standard.
    2. Normalizzare l'analisi di flusso extracellulare crudo al contenuto di DNA all'interno del pozzo.
       Nota: Nei risultati presentati qui, i campioni vengono normalizzati a 50 ng dsDNA - un importo tipico in un pugno di retinica di 1 mm. Di conseguenza, valori assoluti qui presentati può essere paragonati agli studi che presentano dati "a punzone retinica". Normalizzare i tracciati a uno standard interno, ad esempio la linea di base di esecuzione ad una concentrazione di glucosio di 5 mM.

Risultati

Utilizzando le tecniche descritte (riassunte nella Figura 1), retiniche espianti da topi di 8 settimana-vecchio wild type (WT) sono stati confrontati per età e background-abbinato transducina topi (Gnat1^{- / -}). Perché Gnat1^{- / -} animali mancano la macchina per chiudere ciclico del nucleotide gated scanalature dello ione in risposta a stimoli luminosi, loro fotoricettori dell'asta rimangono depolarizzate anche i...

Discussione

OCR ed ECAR prontamente sono misurati in tessuto retinico explanted utilizzando un bioanalyzer utilizzando le tecniche descritte. Questo metodo parte da quelle degli altri gruppi in diversi passaggi critici. Tessuto retinico è isolati attraverso una grande incisione cornea senza enucleando il globo, come originariamente descritto da Winkler¹⁵. Questo metodo di isolamento retinica consente un rapido trasferimento dall'occhio vivente nella piastra di cattura del tessuto (spesso entro 5 minuti). Tess...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Seahorse XF24 Analizzatore di flusso extracellulare	Agilent, Santa Clara, CA
Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (include: micropiastra per la cattura delle isole, cartuccia del sensore e soluzione di calibrazione)	Agilent, Santa Clara, CA	101174-100	Include micropiastra per la cattura delle isole, cartuccia del sensore e soluzione di calibrazione
RPMI 1640 Media (terreno in polvere)	Millipore-Sigma	R1383	RPMI 1640 Terreni con L-Glutammina e senza glucosio o bicarbonato di sodio
D-Glucosio	Millipore-Sigma	G8270	1M D-Glucosio filtrato, per la preparazione di terreni
Piruvato di sodio	Corning	25000CI	100 mM piruvato di sodio
Antimicina-A	Millipore-Sigma	A8674	Componente del protocollo di stress mitocondriale
FCCP	Millipore-Sigma	C2920	Componente del protocollo di stress mitocondriale
Rotenone	Millipore-Sigma	R8875	Componente del protocollo di stress mitocondriale
2-desossiglucosio	Millipore-Sigma	D6134	Componente del protocollo di glicolisi
Punzoni per biopsia cutanea da 1 mm con stantuffo	Integra-Miltex	33-31AA-P/25	Strumento per l'espianto di tessuto retinico
Dumont Mini-Pinze Dritte	Strumenti per la scienza fine	11200-10	Strumento per l'espiantazione del tessuto retinico
Dumont Medical #5/45 Pinze - Angolato a 45 gradi	Fine Science Tools	11253-25	Strumento per l'espiantazione del tessuto retinico
Dumont #7 Pinze - Curved	Fine Science Tools	11271-30	Strumento per l'espiantazione del tessuto retinico
Quant-iT Picogreen dsDNA Assay
Kit Fisher Scientific P7589 Saggio di normalizzazione del caricoBase Trizma (Tris base)	Millipore-Sigma	T6066	Componente del tampone di lisi
Triton X-100 (polietilenglicole terz-ottilfenil etere)	Millipore-Sigma	X100	Componente del tampone di lisi
0,5M EDTA pH 8,0	Ambion	AM9262	Componente del tampone di lisi
C57BL/6J topi	Laboratori Jackson	nbsp; Ceppo 000664	Animali
Gnat1-/- e Gnat1+/+	Vladimir Kefalov, PhD; Animali della Scuola di Medicina dell'Università di Washington