È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Flusso Cytometric Detection neonata al seno cancro cellule staminali-come delle cellule dopo l'inversione di apoptosi

9.6K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/58642

⸱

26 gennaio 2019

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, The Chinese University of Hong Kong, 2State Key Laboratory of Agrobiotechnology, The Chinese University of Hong Kong, 3Key Laboratory for Regenerative Medicine, Ministry of Education, The Chinese University of Hong Kong, 4Centre for Novel Biomaterials, The Chinese University of Hong Kong

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per isolare cellule di carcinoma mammario apoptotica ordinando di fluorescenza-attivato delle cellule e ulteriormente rilevare la transizione delle cellule staminali non cancro al seno al seno cancro cellule staminali-come le cellule dopo inversione di apoptosi mediante citometria a flusso.

Abstract

Recidiva del tumore lungo è stato studiato dagli oncologi, mentre i meccanismi di fondo rimangono poco chiari. Recentemente, abbiamo e altri trovato che un fenomeno denominato apoptosi inversione porta ad aumento tumorigenicità in vari modelli di cellulari sotto diversi stimoli. Gli studi precedenti si sono concentrati sul monitoraggio di questo processo in vitro e in vivo; Tuttavia, l'isolamento di cellule vero invertite ha ancora da conseguire, che limita la nostra comprensione sulle conseguenze dell'inversione di apoptosi. Qui, approfittiamo di una tintura di Caspase-3/7 verde rilevazione alle cellule di etichetta con caspasi attivate dopo induzione apoptotica. Cellule con segnali positivi sono ulteriormente separate per fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) per il recupero. L'esame morfologico sotto microscopia confocale aiuta a verificare lo stato di apoptotic prima FACS. Un aumento di carcinogenicità spesso può essere attribuito all'elevazione della percentuale di cellule staminali tumorali (CSC)-come le cellule. Inoltre, data l'eterogeneità di cancro al seno, identificare l'origine di queste cellule di CSC-come sarebbe fondamentale per il trattamento del cancro. Così, prepariamo le cellule staminali non cancro al seno prima di innescare l'apoptosi, isolare cellule caspase-attivata ed eseguire la procedura di inversione di apoptosi. Analisi di citometria a flusso rivela che i CSC-come le cellule del seno ri-appaiono nel gruppo invertito, che indica i CSC-come le cellule del seno sono transitate da cellule staminali non cancro al seno durante l'inversione di apoptosi. Questo protocollo prevede in sintesi, l'isolamento delle cellule di cancro al seno apoptotica e rilevamento delle modifiche in percentuale di CSC in cellule invertite tramite flusso cytometry.

Introduzione

Cancro è stato delle cause principali di morte, causando il pesante fardello di paesi in tutto il mondo1. Cancro al seno truppa alta sia in termini di incidenza e mortalità in pazienti femminili tra tutti i tipi di cancro1. A causa dell'eterogeneità di cancro, una combinazione di farmaci è solitamente utilizzata in chemioterapia per raggiungere cancro delle cellule morte2,3,4. Tuttavia, poiché le droghe chemioterapeutiche comuni spesso target DNA5,6, proteina sintesi7,8 e/o microtubule dynamics9, cellule in rapida crescita sono interessati più mentre cellule quiescenti come cancro cellule staminali (CSC) s sono solitamente meno colpiti10. CSC sono, pertanto, più probabilità di sopravvivere dopo il trattamento, che poi conduce a farmacoresistenza e cancro recidiva10,11. Quindi, eliminazione delle CSCs è diventata un tema importante per il trattamento del cancro e lo studio dell'origine delle CSCs è necessario.

Sono stati effettuati ulteriori studi sul fenomeno dell'inversione di apoptosi nella decade recente12,13,14,15,16,17,18 , 19. prima della nascita di questo concetto, è stato ampiamente accettato che le cellule irreversibilmente subirà apoptosi dopo l'attivazione delle caspasi. Caspasi sono una famiglia di enzimi proteine che giocano un ruolo chiave nelle fasi di iniziazione e l'esecuzione dell'apoptosi, tra cui la formazione del complesso apoptotico e la fenditura di substrati a valle20. L'attivazione delle caspasi boia come caspasi 3 o caspasi 7 è stato considerato come il "punto di non ritorno" per apoptosi21. Tuttavia, i ricercatori hanno recentemente osservato che l'apoptosi inversione si verifica sia in vitro e in vivo, , durante il quale le cellule possono recuperare dall'apoptosi anche dopo l'attivazione di caspasi12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. Inoltre, caratteristiche aggressive come maggiore resistenza alla originale induttore apoptotico e maggiore invasività vengono rilevati nel cancro invertito cellule15. Quindi, è stato proposto che la percentuale di CSC-come le cellule sarebbe superiore alla popolazione invertita rispetto alle cellule non trattate, contribuendo alla fine alle funzionalità più maligna dopo apoptosi inversione18.

In precedenza, molti sforzi sono stato apportati traccia l'inversione di apoptosi in vitro e ancora più importante, in vivo, che notevolmente aiutare a confermare l'universalità di questo processo16,17,19. Tuttavia, uno studio sistematico sulle conseguenze delle cellule invertite è carente a causa dell'isolamento insoddisfacente delle cellule che hanno effettivamente subito inversione di apoptosi. C'è la necessità di acquisire le cellule apoptotiche puro e recuperarli per ulteriore studio. Così, usiamo il marcatore tradizionalmente ben accettato di attivazione delle caspasi boia come l'indicatore del "punto di non ritorno"21 per apoptosi e utilizzare fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) per discriminare caspase-attivata cellule colorate con la tintura di Caspase-3/7 verde rilevazione. La tintura è covalentemente ad una sequenza di amminoacido breve, DEVD, che può essere riconosciuto e spaccati di caspases attivi 3/7. Il clivaggio aiuta a rilasciare il colorante, che sarà traslocano dal cytosol al nucleo dove si lega al DNA ed emette fluorescenza forte. Questa procedura evita di utilizzare una popolazione delle cellule di massa in cui alcune cellule possono non aver subito l'apoptosi.

CSC o cellule d'inizio del tumore sono state identificate in molti tumori solidi, utilizzando un singolo o una combinazione di diversi marker(s) superficiale e molto pochi numeri di queste cellule sono sufficienti a formare tumori in topi immunodeficienti22,23, 24,25,26,27. Una combinazione di CD44 e CD24 è stato comunemente utilizzata negli studi di seno CSC e CD44+/CD24– cellule sono state definite come il seno di CSCs26,27,28,29 , 30. recentemente, abbiamo effettuato una serie di esperimenti per confermare il rapporto proposto tra apoptosi inversione e CSCs e dimostrare che cellule di carcinoma mammario invertita acquisito capacità aumentata di formazione del tumore in vitro e in vivo con un elevata percentuale di cellule con CSC marcatori18. Anche se non potremmo escludere la possibilità che al seno CSCs sopravvivono meglio e così arricchirsi dopo inversione di apoptosi, cosa importante, quando isoliamo le cellule tumorali staminali non e soggetto a inversione di apoptosi, CSC emergerà nell'originariamente non-staminali popolazione delle cellule di cancro, suggerendo che non-staminali cancro cellule possono contribuire all'aumento della percentuale di CSCs durante l'inversione di apoptosi.

Questo articolo si propone di dimostrare la transizione da cellule staminali non cancro al seno alle cellule simil-CSC del seno dopo l'inversione di apoptosi e di rilevare questa transizione tramite flusso cytometry. Le cellule staminali non cancro al seno sono inizialmente preparate isolando CD44–/CD24+ cancro cellule di FACS al seno. Quindi, apoptosi sono indotta e confermata da cambiamenti morfologici sotto il microscopio. In seguito, le cellule apoptotiche positivamente etichettati da tintura verde rilevazione di Caspase 3/7 sono isolate da FACS e ulteriormente coltivate in assenza di induttori apoptotici per l'inversione di apoptosi. Le cellule invertite sono poi tinto con marcatori di CSC dopo 7 giorni di recupero per l'analisi cytometric di flusso. Cellule con CD44+/CD24 marcatori– ri-appaiono nella popolazione invertita, suggerendo che la transizione dalle cellule tumorali staminali non a CSC-come le cellule si è verificato durante l'apoptosi inversione.

Inversione di apoptosi è stata osservata nel cancro più linee cellulari come pure le cellule primarie normali trattati con stimoli apoptotici diversi in vitro12,13. Questo processo è stato rintracciato anche in Drosophila modello in vivo16,17,19. Molte informazioni per quanto riguarda il meccanismo di fondo di ricaduta del cancro nei modelli differenti del cancro malattia e l'origine delle CSCs possono essere ottenuti attraverso l'uso della tecnica come descritto in questo manoscritto.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

1. preparazione del seno cancro cellule staminali Non

  1. Cultura MCF-7 e cellule MDA-MB-231 in 10 mL di medium di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 privo di rosso fenolo supplementato con 10% inattivati siero bovino fetale (FBS) in un piatto di 100 mm. Cultura T47D in 10 mL di fenolo rosso privo RPMI 1640 supplementato con 2 mM L-Glutammina, 10% inattivati FBS e 1% v/v penicillina-streptomicina (PS) in un piatto di 100 mm. Cellule di coltura a 37 ° C in un'incubatrice di coltura cellulare di 5% CO295% aria.
    Nota: Rosso fenolo colpisce rilevamento basati sulla fluorescenza ma ha anche una potenziale influenza sulla crescita delle cellule di cancro al seno a causa dei suoi effetti estrogeno-simile31. Ad esempio, rosso fenolo potrebbe stimolare il ricevitore del progesterone e la crescita di cellule MCF-731. Potrebbe inoltre incentivare la crescita di cellule di T47D31.
  2. Lavare le cellule con 2 mL di fosfato tampone salino (PBS) due volte. Aggiungere 2 mL di tripsina-EDTA 0,05% a MCF-7 e MDA-MB-231 o 2 mL di 0,25% tripsina-EDTA a cellule T47D.
    Nota: La concentrazione di tripsina-EDTA necessari per la separazione delle cellule fra tipi di cellule di cancro al seno diversi variare mentre una concentrazione inappropriata può influenzare il pattern di espressione di alcuni marcatori di superficie cellulare come CD44 e CD2432.
  3. I piatti per 5 min a 37 ° C in atmosfera di 5% CO295% aria della coltura. Controllare frequentemente il distacco delle cellule sotto il microscopio di prevenire le cellule da sovra-digestione con tripsina-EDTA.
  4. Quando oltre il 90% cellule scollegare, aggiungere 5 mL di medium RPMI completate il piatto e pipetta sopra la superficie di strato delle cellule diverse volte.
  5. Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 300 x g e a 4 ° C per 5 min.
    Nota: Solitamente, circa 6 x 106 cellule possono essere ottenute da un piatto di 100 mm quando il confluency raggiunge il 70%.
  6. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 106 cellule/100 μL di tampone di FACS (PBS contenente 0.5% di BSA e 0,1% di sodio azide) in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
  7. Dividere le celle in diversi tubi. Per cellule MCF-7, dividere le celle in 4 tubi: due per isotipo controlli, uno per singolo CD24 colorazione come controllo positivo CD24 e uno per la doppia colorazione.
  8. Per le cellule T47D, dividere le celle in 3 tubi: due per controlli di isotipo e uno per la doppia colorazione.
  9. Per le cellule MDA-MB-231, dividere le celle in 4 tubi: due per isotipo controlli, uno per CD44 singola colorazione come controllo positivo CD44 e uno per la doppia colorazione.
  10. Centrifugare le provette nuovamente a 300 x g e a 4 ° C per 5 min. eliminare il supernatante e quindi aggiungere blocco Fc diluito 01:50 nel buffer di FACS.
  11. Incubare i campioni in ghiaccio per 20 minuti al buio prima centrifugazione a 300 x g e 4 ° C per 5 min, scartare il surnatante.
  12. Aggiungere fluorocromo-coniugate di anticorpi monoclonali contro umano CD44 (PerCP-Cy 5.5) e CD24 (PE) a diluizioni 01:40 e 01:10 (nel buffer di FACS) in dual macchiatura gruppi. Per i controlli positivi, aggiungere CD44 (PerCP-Cy 5.5) per MDA-MB-231 e aggiungere CD24 (PE) alle cellule MCF-7 alla stessa concentrazione, rispettivamente.
    Nota: La combinazione di CD44 e C24 è stato comunemente utilizzata in seno CSC Studio26,27,28,29,30.
  13. Per i gruppi di controllo di isotipo, aggiungere PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG2b, κ presso un 01:40 diluizione come il controllo di isotipo per CD44 anticorpi e PE Mouse IgG2a, κ presso un 01:10 diluizione come il controllo di isotipo per CD24 anticorpi alle 106 cellule/100 μL.
    Nota: Isotype controlli per gli anticorpi di interesse sono raccomandati come controlli negativi33.
  14. Incubare i campioni (da passaggi 1.12 e 1.13) a 4 ° C al buio per 30 min. Centrifugare a 300 x g e 4 ° C per 5 min, scartare il surnatante.
  15. Lavare la pallina due volte con 500 μL di PBS e centrifugare a 300 x g e a 4 ° C per 5 min.
  16. Risospendere il pellet in 0,5 mL di PBS e filtrare attraverso una rete di nylon di 40 µm prima di eseguire su un sorter fluorescenza-attivato delle cellule.
  17. Per scopi di gating e compensazione, macchia cellule MCF-7 con gli anticorpi anti-CD24 PE-coniugati e macchiare le cellule MDA-MB-231 con gli anticorpi anti-CD44 PerCP-Cy 5.5-coniugato come controlli positivi. Utilizzare le cellule colorate con isotipo controlli come controlli negativi (Figura 1).
  18. Raccogliere le cellule con CD44–/CD24+ marcatori in tubi di turno-fondo polistirolo 12x75 mm contenente 1 mL di mezzo di raccolta (privo di rosso fenolo RPMI 1640 supplementato con 20% inattivati FBS e 2% v/v PS). Centrifugare le provette a 300 x g e RT per 5 min e scartare il surnatante.
    Nota: CSC-come le cellule in cellule di cancro al seno sono definite come CD44+/CD24– cellule26,27,28,29,30e il seno non-staminali cellule tumorali sono definiti come CD44–/CD24+ cellule18 (Figura 1).
  19. Piastra di cellule di cancro non-staminali del seno ordinato nella piastra di coltura contenenti terreno collezione fresca per la ulteriore coltura a 37 ° C in 5% CO2 incubatrice della coltura cellulare.

2. rilevamento e induzione apoptotica

  1. Preparare 1 mM staurosporine12,34 in DMSO. Per il gruppo trattato di MCF-7, aggiungere 25 μL di 1mm staurosporine al medium completato delle cellule MCF-7 di rendere fino a 10 mL di volume finale (2,5 μM staurosporine) in una provetta conica da 15 mL. Pipetta per mescolare il contenuto in modo uniforme.
  2. Rimuovere il terreno di coltura dalle cellule, lavare le cellule con 2 mL di PBS una volta. Quindi aggiungere i 10 mL di medium con 2,5 μM staurosporine alle cellule MCF-7 per 6 h di indurre apoptosi quando raggiunge la densità delle cellule confluency di 70%.
  3. Preparare 1 mM paclitaxel35,36 in DMSO. Per il gruppo trattato di T47D, aggiungere 12,5 μL di paclitaxel 1 mM al medium completato delle cellule T47D per rendere ad un volume finale di 10 mL (5 μM paclitaxel) in una provetta conica da 15 mL. Pipetta per mescolare il contenuto in modo uniforme.
  4. Rimuovere il terreno di coltura dalle cellule e lavare le cellule con 2 mL di PBS una volta. Quindi aggiungere i 10 mL di medium con 5 μM paclitaxel alle cellule T47D per 10 h per indurre apoptosi quando raggiunge la densità delle cellule confluency di 70%.
    Nota: Il tempo di induzione e la concentrazione degli induttori che inducono apoptosi dovrebbe essere ottimizzati ogni volta che una nuova linea di cella viene utilizzata per la prima volta.
  5. Per il gruppo solvente-trattato di MCF-7, aggiungere 25 μL di sterile dimetilsolfossido (DMSO) al medium completato delle cellule MCF-7 per rendere ad un volume finale di 10 mL (cioè, 0,25% v/v DMSO) in una provetta conica da 15 mL. Pipetta per mescolare il contenuto in modo uniforme.
  6. Rimuovere il terreno di coltura dalle cellule MCF-7 trattate solvente, lavare una volta con 2 mL di PBS. Quindi aggiungere i 10 mL di medium con 0,25% v/v DMSO per 6 h come il controllo solvente per STS.
  7. Per il gruppo di T47D solvente-trattati, aggiungere 5 μL di DMSO sterile al medium completato delle cellule T47D per portare a 10 mL di volume finale (cioè, 0.05% v/v DMSO) in una provetta conica da 15 mL. Pipetta per mescolare il contenuto in modo uniforme.
  8. Rimuovere il terreno di coltura dalle cellule T47D trattate solvente, lavare una volta con 2 mL di PBS. Quindi, aggiungere 10 mL di medium con 0.05% v/v DMSO per 10 h come il controllo solvente per il paclitaxel.
  9. Per osservare i cambiamenti morfologici delle cellule trattate, macchia le cellule con 50 nM Mitotracker Red CMXRos e 250 ng/mL Hoechst 33342 e incubare per un altro 20 min a 37 ° C in atmosfera di aria di 95% di 5% CO2. Osservare la morfologia delle cellule apoptotiche tipiche sotto un 60 x laser confocale scansione microscopio (Figura 2).
    Nota: Apoptosi tipica morfologia include restringimento delle cellule, blebbing membrana, mitocondri frammentazione e condensazione nucleare ma con membrana cellulare intatta12,13,14,15 ,18,37.

3. isolamento di cellule apoptotiche e procedura di inversione di apoptosi

  1. Macchia apoptotica induttore solvente trattati e MCF-7 o cellule T47D con tintura di Caspase-3/7 verde rilevazione 3 μM nella concentrazione delle cellule/ml al buio per 30 min a 37 ° C in atmosfera di 5% CO295% aria 10-6.
  2. Filtrare le cellule attraverso una rete di nylon di 40 µm prima di eseguire l'ordinatore per l'ordinamento.
  3. Per scopi di gating, primo cancello la popolazione principale (R1) ed escludere i detriti tracciando il grafico in punti con forward scatter e dispersione laterale (Figura 3).
  4. Utilizzare le cellule non trattate senza aggiungere il colorante di Caspase-3/7 verde rilevazione come controllo negativo al cancello della regione negativa (R2) (Figura 3A).
  5. Utilizzare le cellule trattate con staurosporine12,18,34 per 24 h e colorate con il colorante come controllo positivo al cancello della regione positiva (R3) (Figura 3B).
  6. Raccogliere le cellule positive (R3) dei gruppi trattati con induttore in tubi di turno-fondo polistirolo 12x75 mm contenente 1 mL di mezzo di raccolta (stesso come il mezzo di raccolta nel passaggio 1.18) (figure 3C-3D). Centrifugare le provette a 300 x g e RT per 5 min e scartare il surnatante.
  7. Raccogliere le cellule negative (R2) da gruppi trattati con solvente in provette di polistirene di turno-fondo 12 × 75 mm con 1 mL di mezzo di raccolta come al punto 3.6 (figure 3E-3F).
    Nota: Una piccola porzione di celle (ad esempio 10.000 cellule) possa essere raccolti ed eseguire nuovamente ordinatore per controllare il modello del marcatore di caspases attivi. Se oltre il 90% di cellule trattate con solvente ordinate sono mostrati nella regione caspase-negativi o oltre il 90% di cellule trattate con induttore ordinate sono mostrati nella regione caspase-positivi, queste cellule prelevate sono credute per essere relativamente puro (figure 3C-3F). In caso contrario, la regione di ordinamento e/o la sequenza deve essere reimpostata.
  8. Risospendere le cellule ordinate in mezzo collezione fresca e semi in piastre di coltura del tessuto 12-pozzetti e coltura a 37 ° C in un'atmosfera di 5% CO295% aria per 7 giorni per l'inversione di apoptosi.

4. conferma dell'apoptosi in cellule di Caspase-attivata

  1. Mix 10 mM HEPES, 140 mM NaCl e 2,5 mM CaCl2 per preparare annessina-associazione tampone (pH 7,4). Conservare il tampone a 4 ° C ed evitare il buffer per esporre alla luce.
  2. Preparare una soluzione di lavoro 100 µ g/mL di ioduro di propidio (PI) diluendo 5 µ l di 1 mg/mL soluzione di riserva di PI in 45 µ l di tampone di annessina-associazione. Conservare la soluzione a 4 ° C ed evitare la soluzione per esporre alla luce.
    Nota: PI è un potenziale mutageno e deve essere maneggiato con cura.
  3. Preparare le cellule induttore-trattate come nei passaggi 2.1 a 2.5.
  4. Raccogliere l'induttore-trattati MCF-7 o cellule T47D pipettando il mezzo sopra lo strato delle cellule 3-5x per staccare le cellule. Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 mL.
  5. Centrifugare a 300 x g e RT per 5 min, scartare il surnatante.
  6. Risospendere le cellule con il mezzo completato presso la concentrazione cellulare di 106/ml in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e macchiare le cellule con 3 della tintura di verde rilevazione di Caspase 3/7 μM al buio per 30 min a 37 ° C.
  7. Centrifugare a 300 x g e RT per 5 min. scartare i sovranatante.
  8. Lavare le cellule con 1 mL di PBS ghiacciata e centrifugare a 300 x g e 4 ° C per 5 min, eliminare i sovranatante.
  9. Risospendere le cellule in 100 μL di tampone di annessina-associazione con l'aggiungere 5 μL del coniugato Annessina V e 1 µ l di 100 µ g/mL PI soluzione di lavoro per ogni 100 µ l di sospensione cellulare e incubare le cellule per 15 min a temperatura ambiente.
    Nota: Annessina V e PI sono insieme comunemente usate per marcare le cellule apoptotiche in flusso cytometry38,39,40.
  10. Aggiungere 400 µ l di tampone di annessina-associazione, mix delicatamente. Mantenere i campioni sul ghiaccio prima di eseguire su un citometro a flusso.

5. misurazione del seno CSC-come le cellule tramite flusso Cytometry

  1. La MCF-7 invertita in entrambi i gruppi induttore o solvente-trattati con tripsina-EDTA 0,05% della raccolta. Raccogliere cellule T47D in entrambi i gruppi trattati di induttore o solvente o con 0,25% tripsina-EDTA come nei passaggi 1.2 a 1.5.
  2. Macchia le celle con fluorocromo-coniugate di anticorpi monoclonali contro umano CD44 (PerCP-Cy 5.5) e CD24 (PE) come descritto al punto 1.12. Nel frattempo, preparare i controlli di isotipo come descritto al punto 1.13.
  3. Eseguire le cellule su un citometro a flusso e rilevare la percentuale di cellule con CD44+/CD24– marcatori.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Al fine di osservare il passaggio dal seno non-staminali cellule di cancro al seno CSC-come le cellule, una prima cernita di CD44–/CD24+ cellule di cancro al seno sono stati necessari. Per la linea cellulare MCF-7, che ha circa 0,15% cellule con marcatori di CSC nella popolazione originale (Figura 1), questo passaggio ha aiutato esclude la possibilità di arricchimento di CSC durante l'inversione di apoptosi. Al contrario, se non ci fosse...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Questo protocollo descrive un modo diretto e chiaro per rilevare il passaggio di cellule staminali non cancro al seno in seno CSC-come le cellule come conseguenza di inversione di apoptosi. Conferma delle proprietà CSC di queste cellule invertite potrebbe essere assistito tramite in vitro mammosphere formazione dosaggio ed in vivo dello xenotrapianto trapianto in topi immunodeficienti18,24,26 ,

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dalla innovativa tecnologia fondo di innovazione tecnologia Commissione: supporto finanziamenti dal laboratorio chiave dello stato di Istittuto (CUHK), al fondo di ricerca biomedica Lo Kwee-Seong e Lee Hysan Foundation. Y.X. è stato sostenuto da studentship post-laurea dal CUHK.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
MCF-7Collezione di colture di tipo americano (ATCC)HTB-22
MDA-MB-231Collezione di colture di tipo americano (ATCC)HTB-26
T47DCollezione di colture di tipo americano (ATCC)HTB-133
Reagente
0,05% tripsina-EDTAInvitrogen25300054
0,25% tripsina-EDTAInvitrogen25200072
Alexa Fluor 680 annessina V coniugatoInvitrogenA35109
siero bovino albuminaUSB9048-46-8
CaCl2 · 2H2OSigma-AldrichC-5080
CellEvent caspasi-3/7 colorante fluorescente verdeInvitrogenC10423
dimetilsolfossidoSigma-AldrichD2650
Blocco FcMiltenyi Biotec130-059-901
siero fetale bovinoInvitrogen16000044inattivato a caldo
USB16926
Hoechst 33342InvitrogenH3570
L-glutamminaInvitrogen25030081
Mitotracker Rosso CMXRosInvitrogenM7512
contro l'umano CD24BD Biosciences555428PE Clone:ML5
Lotto:5049759
RRID:AB_395822
anticorpi monoclonali contro l'umano CD44BD Biosciences560531PERCP-CY5.5 Clone:G44-26
Lotto:7230770
RRID:AB_1727485
NaClSigma-Aldrich31434
paclitaxelSigma-AldrichT7402
PE Topo IgG2a, κ Controllo dell'isotipoBD Biosciences554648clone:G155-178 (RUO)
RRID:AB_395491
Penicillina-streptomicinaInvitrogen15070-063
PerCP-Cy5.5 IgG2b di topo, κ Controllo degli isotipiBD Biosciences558304Clone:27-35
RRID:AB_647257
soluzione salina tamponata con fosfatoThermo Fisher Scientific21600010
ioduro di propidioInvitrogenP1304MP
Roswell Park Memorial Institute 1640 medioInvitrogen11835055
azzarde di sodioSigma-AldrichS2002
staurosporinaSigma-AldrichS4400
Equipment
100 mm piatto di colturaGreiner Bio-One664160
piastre per coltura tissutale a 12 pozzettiThermo Fisher Scientific150628
Cell Strainer 40 μ m rete in nylonBD Biosciences08-771-1
FACSuite software bundle v1.0BD Biosciences651360
FACSVerseBD Biosciences651155
FluoView FV1000 microscopio confocaleOlympusIX8160X obiettivo
FV10-ASW Software visualizzatore Ver.4.2bOlympus-round-bottom
polystyrene 12 &volte; Tubi da 75 mmBD Biosciences352003
Selezionatrice S3eBio-Rad1451006
HEPES Anticorpi monoclonali privo di rosso fenolo

Riferimenti

  1. McGuire, S. World Cancer Report 2014. Geneva, Switzerland: World Health Organization, International Agency for Research on Cancer, WHO Press, 2015. Advances in Nutrition. 7 (2), 418-419 (2015).
  2. Slamon, D. J., et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. New England Journal of Medicine. 344 (11), 783-792 (2001).
  3. Geyer, C. E., et al. Lapatinib plus capecitabine for HER2-positive advanced breast cancer. New England Journal of Medicine. 355 (26), 2733-2743 (2006).
  4. Cameron, D., et al. A phase III randomized comparison of lapatinib plus capecitabine versus capecitabine alone in women with advanced breast cancer that has progressedon trastuzumab: updatedefficacy andbiomarker analyses. Breast Cancer Research and Treatment. 112 (3), 533-543 (2008).
  5. Liu, L. F. DNA topoisomerase poisons as antitumor drugs. Annual Review of Biochemistry. 58, 351-375 (1989).
  6. Hertel, L. W., et al. Evaluation of the antitumor activity of gemcitabine (2',2'-difluoro-2'-deoxycytidine). Cancer Research. 50 (14), 4417-4422 (1990).
  7. Ni, H., et al. Analysis of expression of nuclear factor kappa B (NF-kappa B) in multiple myeloma: downregulation of NF-kappa B induces apoptosis. British Journal of Haematology. 115 (2), 279-286 (2001).
  8. Richardson, P. G., Mitsiades, C., Hideshima, T., Anderson, K. C. Bortezomib: proteasome inhibition as an effective anticancer therapy. Annual Review of Medicine. 57, 33-47 (2006).
  9. Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nature Review Drug Discovery. 9 (10), 790-803 (2010).
  10. Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nature Review Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).
  11. Pirozzi, G., et al. Prognostic value of cancer stem cells, epithelial-mesenchymal transition and circulating tumor cells in lung cancer. Oncology Reports. 29 (5), 1763-1768 (2013).
  12. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100 (1), 118-122 (2009).
  13. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23 (12), 2240-2252 (2012).
  14. Xie, X., Wang, S. S., Wong, T. C. S., Fung, M. C. Genistein promotes cell death of ethanol-stressed HeLa cells through the continuation of apoptosis or secondary necrosis. Cancer Cell International. 13 (1), 63(2013).
  15. Wang, S. S., Xie, X., Wong, C. S., Choi, Y., Fung, M. C. HepG2 cells recovered from apoptosis show altered drug responses and invasiveness. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 13 (3), 293-300 (2014).
  16. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Harwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Scientific Reports. 5, 9015(2015).
  17. Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  18. Xu, Y., So, C., Lam, H. M., Fung, M. C., Tsang, S. Y. Apoptosis reversal promotes cancer stem cell-like cell formation. Neoplasia. 20 (3), 295-303 (2018).
  19. Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting anastasis in vivo by CaspaseTracker biosensor. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  20. Li, J., Yuan, J. Caspases in apoptosis and beyond. Oncogene. 27 (48), 6194-6206 (2008).
  21. Green, D. R., Amarante-Mendes, G. P. The point of no return: mitochondria, caspases, and the commitment to cell death. Results and Problems in Cell Differentiation. 24, 45-61 (1998).
  22. Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).
  23. Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).
  24. O'Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).
  25. Cioffi, M., et al. Identification of a distinct population of CD133(+) CXCR4(+) cancer stem cells in ovarian cancer. Scientific Reports. 5, 10357(2015).
  26. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  27. Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).
  28. Liu, S., et al. Breast cancer stem cells transition between epithelial and mesenchymal states reflective of their normal counterparts. Stem Cell Reports. 2 (1), 78-91 (2013).
  29. Sheridan, C., et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis. Breast Cancer Research. 8 (5), R59(2006).
  30. Phillips, T. M., McBride, W. H., Pajonk, F. The response of CD24(-/low)/CD44+ breast cancer-initiating cells to radiation. Journal of the National Cancer Institute. 98 (24), 1777-1785 (2006).
  31. Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Molecular and Cellular Endocrinology. 57 (3), 169-178 (1998).
  32. Tsuji, K., et al. Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  33. Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nature Immunology. 7 (7), 681-685 (2006).
  34. Belmokhtar, C. A., Hillion, J., Ségal-Bendirdjian, E. Staurosporine induces apoptosis through both caspase-dependent and caspase-independent mechanisms. Oncogene. 20 (26), 3354-3362 (2001).
  35. Saunders, D. E., et al. Paclitaxel-induced apoptosis in MCF-7 breast-cancer cells. International Journal of Cancer. 70 (2), 214-220 (1997).
  36. Miller, A. V., et al. Paclitaxel-induced apoptosis is BAK-dependent, but BAX and BIM-independent in breast tumor. PLoS One. 8 (4), e60685(2013).
  37. Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  38. Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184 (1), 39-51 (1995).
  39. Ng, S. Y., et al. Role of voltage-gated potassium channels in the fate determination of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 165-177 (2010).
  40. Lo, I. C., et al. TRPV3 channel negatively regulates cell cycle progression and safeguards the pluripotency of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 403-413 (2016).
  41. Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. Journal of Biological Chemistry. 272 (15), 9677-9682 (1997).
  42. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  43. Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12 (5), 468-476 (2010).
  44. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  45. Desiderio, V., et al. Increased fucosylation has a pivotal role in invasive and metastatic properties of head and neck cancer stem cells. Oncotarget. 6 (1), 71-84 (2015).
  46. Gupta, P. B., et al. Stochastic State Transitions Give Rise to Phenotypic Equilibrium in Populations of Cancer Cells. Cell. 146 (4), 633-644 (2011).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Cellule staminali del cancro al senocitometria a flussosmistamento cellulare attivato da fluorescenzamicroscopia confocalerilevazione della caspasi-3/7marcatori CD44 CD24cellule cancerose non staminalianalisi della tumorigenicità
Flusso Cytometric Detection neonata al seno cancro cellule staminali-come delle cellule dopo l'inversione di apoptosi
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.